Summary
Здесь мы представляем протокол для количественного определения и квалификацию каждого вида сфингомиелин, используя несколько мониторинг реакции и МС/МС/МС режим, соответственно.
Abstract
Мы представляем метод анализа сфингомиелин (SM) качественно и количественно жидкого хроматографии электроспрей ионизации тандем масс-спектрометрия (LC-ЭСИ-МС/МС). SM является общей Сфинголипиды, состоящий из фосфорилхолин и Церамид как компонент гидрофильные и гидрофобные, соответственно. Ряд видов SM присутствуют в клетках млекопитающих из-за разнообразия в сфингоидные длинной цепи базы (LCB) и N-ацил группу в составе Церамид. В настоящем докладе, мы показываем метод оценки количество углерода и двойных связей в LCB и N-ацил группу на основе их соответствующего продукта ионов в экспериментах MS/MS/MS (3МС). Кроме того мы представляем метод количественного анализа для SM с использованием двух стабильных гетерогенны помечены SM видов, что облегчает определение диапазона, используемые в SM количественный. Нынешний метод будет полезным при характеристике различных видов SM в биологических образцов и промышленных продуктов, таких как косметика.
Introduction
Сфингомиелин (SM) является общим Сфинголипиды в mammalian клетках. SM-синтезированных внутриклеточно1 и настоящего как прекурсор для других Сфинголипиды, такие как сфингозин-1-фосфата и керамиды, которые имеют решающую роль в иммунной клетки оборота и кожи барьер гомеостаза, соответственно2, 3. Таким образом точный анализ метаболизма SM имеет важное значение для выяснения роли физиологических и патологических Сфинголипиды.
SM состоит из церамида и фосфорилхолин, что связано с 1-гидрокси группы Церамид, которая также состоит из сфингозин и N-ацил остаток. Различные количества углерода и двойную связь в сфингозин и N-ацил общие результаты количество Церамид (и SM) видов. Последние достижения в LC-ЭСИ-MS/MS позволило количественный и качественный анализ SM4,5. В качественном анализе количество углерода и двойные скрепления сфингоидные LCB SM была определена путем назначения продукта Ион спектры LCB. Однако структурная информация N-ацил остаток не было получено непосредственно, потому что его соответствующего продукта ионов не сообщалось и поэтому N-ацил постановление были выведены дифференциального анализа между ионами прекурсоров и ионы продукт, соответствующий LCB в обоих режимах положительных и отрицательных ионов4,5. В настоящем докладе, мы представляем метод для обнаружения продукта ионов LCB и N-ацил группу одновременно в режиме3 МС, с помощью тройной квадрупольного и квадрупольного линейной ионной ловушки масс-спектрометрии, который облегчает точное структурных спекуляции каждого вида SM6.
Ион подавления (или повышение) эффекты, вызванные матрицы в биологических образцах затрудняют точную количественную оценку в анализе LC-ЭСИ-MS, и поэтому, желательно строить калибровочные кривые для всех аналитов интерес в матрице идентичные в биологическом образце. Однако эта стратегия не возможно, потому что это почти невозможно для подготовки всех видов SM в биологических образцах, особенно в всеобъемлющего анализа. Таким образом это практично для построения калибровочной кривой и определения количественного диапазона с помощью представительных видов SM шипами в биологических образцах. Мы использовали два вида гетерогенны помечены SM для построения калибровочной кривой; один был использован для внутреннего стандарта и другой для соединения стандарта. Мы обнаружили небольшое количество гетерогенны помечены SM видов как стандартное соединение с шипами в биологических образцах и успешно получил калибровочной кривой и количественного диапазона6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Консультации все соответствующие листы данных безопасности материалов (MSDS) перед использованием. Надевайте перчатки, чтобы свести к минимуму загрязнение образцов кожи производные SM. Настоящий Протокол применяется к клетки HeLa, выращенных в орла минимальных основных средних дополнена 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 2 мм L-глютамин, 1.000 U/L пенициллина и стрептомицина 100 мг/Л.
1. подготовка проб липидов
Примечание: Важно, что все стекла, включая пробирки с тефлоновым покрытием колпачки быть моющих средств бесплатно.
- Извлечение общего Липидные фракции из клеток огневки, используя метод Bligh и Дайер7
- Удаление культуры (или кондиционером) СМИ от 10 см ткани культуры блюдо и полоскать дважды с 6 мл ледяной PBS.
- Добавьте 1 mL ледяной PBS в 10 см ткани культуры блюдо, P1000 пипеткой. Урожай клетки с ячейки скребками и собирать в 2.0 мл силицированного пластиковые трубы.
- После центрифугирования (1000 × g, 5 мин, 4 ° C) удалите супернатант P1000 пипетки.
- Добавьте 1 мл метанола. Вихревой трубы кратко и sonicate на 200 Вт для 5 минут в баня типа sonicator.
Примечание: Отрегулируйте уровень воды в ванной тип sonicator так, что клетки гранулы эффективно гомогенизации. - Перевести огневки клеток в метаноле, пипетки в пробирки (13 мм x 100 мм) с тефлоновым покрытием колпачки.
- Добавить 1 мл метанола, 1 мл хлороформа, 0,8 мл двойной дистиллированной воды и 50 мкл 10 мкмоль/Л внутреннего стандарта d18:1 /(D31)-16:0 см в каждую пробирку.
- Вихревой пробирки энергично за 5 мин при комнатной температуре.
Примечание: В этот момент одна фаза (хлороформ/метанол/вода = 1/2/0,8 (v/v/v)) формируется. - Добавьте 1 мл хлороформа и 1,0 мл двойной дистиллированной воды.
- Вихревой трубы энергично при 2500 об/мин за 5 мин при комнатной температуре.
Примечание: на данный момент, водный (верхний) фаза и фаза органических (Нижняя) разделены. - После центрифугирования (2150 × g, 5 мин, 25 ° C), сбора и передачи нижней фазе в одноразовых стеклянных трубок (начальная фаза ниже).
Примечание: Собирайте этапа ниже, с помощью пипетки Пастера и пипетки фильтр безопасности. Вставьте наконечник пипетки в нижней фазе, сожмите небольшие лампочки рядом с «E» клапан доставить Верхний этап и межфазного пух внутри кончиком пипетки и затем сифон нижней фазе в пипетку. - Добавьте 2 мл хлороформа в пробирки и вихревых трубок энергично при 2500 об/мин за 5 мин при комнатной температуре достаточно смешать с верхнего этапа и межфазного пух.
- После центрифугирования (2150 × g, 5 мин, 25 ° C), собирать и передавать изменение нижней фазе в одноразовых стеклянных трубок с этапа первоначального ниже, как описано в шаге 1.1.10.
- Разместите стеклянных трубочек под поток азота и полностью удалить органических растворителей в собранных нижней фазе.
- Восстановить образцы с 500 мкл метанола или этанола, фильтрата с 0,02 мкм фильтром и хранить в стеклянных флаконах в-20 ° C.
- Пробоподготовка для построения калибровочной кривой и проверка метода
- Добавьте 50 мкл 0.1, 0.5, 1, 5, 10 или 50 мкмоль/Л стандартного комплекса (d18:1 /(D9)-18:1 см) в пробирки с тефлоновым покрытием колпачки.
- Добавление ячейки огневки в каждую пробирку и добавить метанола в 1 мл.
Примечание: Количество клеток огневки как матрица варьируется в зависимости от каждого эксперимента. Если регулярно анализируются SM видов в образцах, полученных от клеток в культуре 10 см блюдо, количество клеток огневки в каждую пробирку должно быть близка к клеток в культуре 10 см блюдо. - Экстракт всего липидная фракция, как описано в шагах 1.1.6-1.1.14.
- Подготовьте проверки качества (КК) образцов для проверки метода как различал в 1.2.1-1.2.3 шаги. Подготовить три КК образцы с различной концентрации стандартного комплекса (d18:1 /(D9)-18:1 см): один в течение 3 x нижнюю границу калибровочной кривой (QC-низкий, QC-L), один недалеко от центра (QC-среднего, QC-M) и один вблизи верхней границы калибровочной кривой (QC-высокий, QC-H).
2. SM анализ LC-ESI-MS/MS
- Подготовка этапа мобильных
- Смесь растворителей (ацетонитрил/метанол/ddH2O = 2/2/1 (v/v/v) для водной фазе и изопропиловый спирт для органической фазы) в стеклянные бутылки с тефлоновым покрытием колпачки и sonicate за 5 мин в баня типа sonicator.
- Добавить муравьиной кислоты (конечная концентрация 26,4 ммоль/Л) и NH4OH (14,9 ммоль/Л) в каждой мобильной фазу.
- Качественный анализ SM LC-ЭСИ-МС3
- Активировать систему высокопроизводительной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), поставил впускной трубы в стеклянные бутылки, которые содержат подвижных фазах и очистить линии ВЭЖХ. Связать столбец HPLC C18 (длина 100 мм × 1,5 мм и.д., частиц размер 3,0 мкм) ВЭЖХ системы, поддержания температуры в духовке столбца при 50 ° C и состояние столбца с водной фазе мобильных минимум 100 мкл/поместить образцы в стойку образца в autosampl э.
- Установите параметры тройной квадрупольного и квадрупольного линейной ионной ловушки масс-спектрометрии системы для анализа3 МС, перечисленных в таблице 1 и таблице 2 , а также первый и второй прекурсоров ионов SM видов, представляющих интерес.
- Дважды щелкните значок программного обеспечения для сбора данных, дважды щелкните конфигурацию оборудования, выберите «LC + QTRAP4500 + клапан» и нажмите кнопку «Активировать профиль».
- Создайте новую вложенную папку, нажав кнопку «Новый подпункт проекта» и «OK».
- Нажмите на вкладку «файл», выберите «New» и выберите «Приобретение метод» и «OK». Щелкните значок «Масса Spec» и «MS» tab. Выберите проверять тип как «MS/MS/MS (MS3)», скорость сканирования как 10000 Da/s, полярности как «Отрицательных» и «Длительность» как все время быть проанализированы (мин). Значение m/z «Start (Da)» и «Stop (Da)» как диапазон проверяемых. Значение m/z 1-го и 2-й прекурсоров ионов целевых видов SM интерес.
Примечание: Для анализа нескольких видов SM, выделите '-MS3' значок, щелкните правой кнопкой мыши, выберите «Копировать этот эксперимент», а затем положить m/z ионов прекурсора 1 и 2 других видов SM. - Выберите вкладку «Advanced MS» и значение каждого параметра следующим образом: режим сканирования как «Профиль», размер шага как 0.12 (Da), резолюции Q1 и Q3 «Блок» и «ОСВЕЩЕННЫЕ», соответственно, интенсивность порог как 0, параметр времени 50 (МС), паузы между массовые диапазоны как 1,5 мс, выберите ' динамический заполнить время ', Q3 барьеры как 8 V и возбуждения время как 25 мс.
- Нажмите кнопку «Изменить параметры» на вкладке «MS» и выберите «источник/газ» tab. Установите параметры занавес газа, газа столкновения, ionspray напряжения, температуры, ионный источник gas1 и gas2, перечисленных в таблице 1. Затем выберите вкладку «Соединения» задать параметры declustering потенциал, потенциал вход, столкновения энергии, энергии возбуждения и энергии столкновения распространились как перечисленные в таблице 2.
- Выделите «Интегрированный Valco клапан» и выберите «позиции имя для шага 0' а и установите «B» как позицию для всего времени 5.0 мин. Также установить «A» в качестве позиции для всего времени 70.0 мин.
- Выделите «Симадзу LC системы». Выберите вкладку «Насос» и установите режим перекачки как двоичный поток, общий поток 0.28 мл/мин, а максимум пределы давления как 20,0 МПа. Выберите вкладку «Автоматический пробоотборник» и установить объем промывки как 200 мкл, игла инсульта как 52 мм, ополаскиватели скорость как 35 мкл/s, выборки скорость как 5.0 мкл/s, очистить время как 25,0 мин, промойте время падения 5 s, а режим полоскания как «До и после аспирации».
- Кроме того, включить блок охладителя, установить кулер температура 4 ° c и ход иглы флакон управления как 52 мм. Выберите вкладку «Печи» включить духовку и установите температуру духовки и максимальная температура 50 ° C до 85 ° C, соответственно.
- Выберите вкладку «Контроллер» и установите флажок «Власть на». Выберите вкладку «Время программа» и установите растворителя градиенты следующим: Растворители A / B в соотношении 100/0 для 5мин, программа линейного изменения 80/20 более 4 минут, до 35/65 свыше 50 мин и 25/75 более 1 мин после , держать их в 25/75 за 10 мин, затем линейно до 100/0 свыше 4 мин. Затем сохраните этот метод.
- Создайте пакетный файл
- Дважды щелкните значок «Построить приобретения пакета», нажмите кнопку «Добавить набор», «Добавить образцы», количество новых образцов и нажмите кнопку «OK».
- Нажмите кнопку «Редактор метода ' и выберите метод для использования. Если в одном пакетном файле используется несколько методов, установите флажок «Использовать несколько методов» и выберите метод приобретения для каждого образца. Переименование «Имя образца», установите соответствующий номер для «Флакон позиции» и поставить количество объем впрыска. Затем сохраните пакетный файл.
- Приобрести продукт3 MS Ион спектры SM видов интерес LC-ЭСИ-МС3 анализа
- Выберите вкладку «Отправить» в пакетный файл, выделите строку образцов для анализа и нажмите кнопку «Отправить».
- Нажмите кнопку '' зрения Quene', «Equilibrate» значок, выберите метод приобретения, чтобы использоваться, установите время как 1 мин и нажмите кнопку «OK».
- Деактивируйте «Резервный инструмент для настройки», нажав на соответствующий значок. Затем выполните пакетную операцию, щелкнув значок «Запуск образца».
- Назначить каждой MS3 продукта Ион спектры SM, сравнивая массы заряда коэффициент (m/z) продукта Ион спектры и точные массы сфингоидные LCB и N-ацил остаток интерес. Определить число атомов углерода и двойной облигаций в сфингоидные LCB и N-ацил остаток по данным соответствующего продукта ионов.
- Убедитесь, что выбрана папка надлежащих подпроектов, затем дважды щелкните значок «Открыть файл данных» и выберите образцы для анализа. Перетащите пик в Хроматограмма для каждого целевого SM видов, а затем дважды щелкните. Будут представлены полученные3 MS продукт Ион спектров в данную область.
- Количественный анализ SM, LC-ESI-MS/MS
- Установите подвижных фазах и ВЭЖХ столбец, как описано в шаге 2.1 и 2.2.1.
- Задайте параметры тройной квадрупольного и линейной ионной ловушки квадрупольного масс-спектрометрии системы для нескольких реакции, мониторинг (MRM) анализ, перечисленных в таблице 1 и таблице 2.
- Проводить процедуры, как описано в шаге 2.2.2.1 и 2.2.2.2.
- Нажмите на вкладку «файл», выберите «New» и выберите «Приобретение метод» и «OK». Нажмите значок «Масса Spec» и «MS» tab. Выберите проверять тип как «МРМ», полярность как «Положительных». Установите «Продолжительность» как все время для анализа. Установите m/z [M + H]+ и 184 как «Q1 массы (Da)» и «Q3 массы (Da)» целевых видов SM интереса, соответственно. Установите «Время» 10 мс и «ID» как имя целевого SM видов.
- Выберите вкладку «Advanced MS» и значение каждого параметра следующим образом: обе резолюции Q1 и Q3 как «Блок», интенсивность порог 0, установив время как 0 (МС) и паузы между массовые диапазоны как 5 мс.
- Нажмите кнопку «Изменить параметры» на вкладке «MS» и выберите вкладку «Источник/газ» параметр занавес газа, газа столкновения, ionspray напряжения, температуры, ионный источник gas1 и gas2, перечисленных в таблице 1. Затем выберите вкладку «Соединения» положить параметры declustering потенциал, потенциал вход, энергию столкновения и столкновения клеток выхода потенциал, перечисленные в таблице 2.
- Установите клапан, как описано в шаге 2.2.2.6.
- Задайте условие LC, как описано в шаге 2.2.2.7. Затем сохраните этот метод.
- Создайте пакетный файл, как описано в шаге 2.2.3.
- Получите данные Записями каждого вида SM LC-ЭСИ-MS/MS анализа как описано в шаге 2.2.4.
- Процесс управления записями сообщений данных с использованием программного обеспечения для интеграции данных и получать данные о площади пика для извлечения ионов Хроматограмма каждого вида см.
- Дважды щелкните значок программного обеспечения для интеграции данных в количественный анализ, нажмите на вкладку «Edit» и выберите пользователя интеграции по умолчанию. Задать ширину Гаусса гладкой как 1.0 точки и нажмите кнопку «OK». Нажмите на вкладку «Edit» и выберите «Новая таблица результатов». Выберите образец, чтобы быть интегрированы, нажмите кнопку со стрелкой и нажмите кнопку «Далее». Выберите «Создать новый метод», задайте имя метода и нажмите кнопку «Далее». Нажмите кнопку «Далее» и установите флажок d18:1 /(D31)-16:0 SM как есть, нажмите «Далее» и нажмите «Готово».
- Нажмите кнопку «Отображает обзор пик» и подтвердите, что вершины Хроматограмма надлежащим образом признаются. Следует отметить, что время удерживания d18:1 /(D31)-16:0 SM обычно меньше по ~ 0,3 мин по сравнению с 34-1 см (обычно состоит из d18:1 / 16:0 SM).
- Количественно каждый SM видов согласно отношение пик каждый SM видов d18:1 /(D31)-16:0 SM внутренний стандарт.
- Перейдите на вкладку «Файл», выберите «Экспорт», выберите «Таблица результатов», подтвердить формат как «MultiQuant», столбцы как «Экспорт всех столбцов», строки «Экспортировать все строки, за исключением тех явно скрытые», а затем нажмите кнопку «OK».
- Откройте экспортированный файл в программе Excel. Нормализовать области целевых видов SM в области ИС (d18:1 /(D31)-16:0 SM). Затем умножьте на теоретическое количество IS в образце вводят для расчета суммы целевых видов SM в закачиваемой образец.
- Построение калибровочной кривой
- Получить данные Записями d18:1 /(D9)-18:1-SM и d18:1-/(D31)-16:0 SM в образцах для построения калибровочной кривой LC-ЭСИ-MS/MS анализом, как описано в шаге 2.3.1-2.3.4.
- Получение данных о площади пика d18:1 /(D9)-18:1-SM и d18:1-/(D31)-16:0 SM, как описано в шаге 2.3.5.
- Рассчитать количество d18:1 /(D9)-18:1 см в закачиваемой образец как описано в шаге 2.3.6.
- Построить линию тренда, установив оси x и y как номинальная сумма и вычисленное количество d18:1 /(D9)-18:1 см и получить Формула тренда.
- Проверка количественный метод, с помощью Microsoft Excel программного обеспечения
- Для проверки метода, подсчитать количество d18:1 /(D9)-18:1-SM и d18:1-/(D31)-16:0 SM в КК образцы, анализируя каждый КК образца по крайней мере три раза в течение 1 дня и повторять по крайней мере 3 дней, как описано в шаге 2.3.1-2.3.4.
- Получение данных области пик и рассчитать количество d18:1 /(D9)-18:1 см в закачиваемой образец как описано в шаге 2.3.5 и 2.3.6.
- Согласно полученной калибровочной кривой, рассчитать количество d18:1 /(D9)-18:1 см в закачиваемой образец.
- Оценка точности
- Вычислить среднее и стандартное отклонение количества d18:1 /(D9)-18:1 SM, полученные на шаге 2.5.3 на наборе intra-day и торгующим через день с помощью Excel программного обеспечения.
- Средний показатель, полученный на шаге 2.5.4.1 делится, стандартное отклонение и выражается в %.
- Оценка точности
- Рассчитайте точность каждого из данных следующим образом:
[(Подсчитанная сумма полученного на шаге 2.5.3.) / (Номинальная сумма) - 1] × 100(%) - Вычислить среднее абсолютное значение точности набора данных внутри-и межучрежденческой дня.
- Рассчитайте точность каждого из данных следующим образом:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Химически синтезированных d18:1 / см (рис. 1A) и d18:1 24:0 / 24:0 SM в образцах липидов, извлеченные из клеток HeLa (рис. 1Б) были проанализированы LC-ЭСИ-МС3 использованием [M + HCOO]– и [M-CH3]- как первый и второй прекурсоров ионы, соответственно. Обратите внимание, что интенсивность спектра деметилированное sphingosylphosphorylcholine (СПК) (m/z 449) больше, чем у SM N-ацил остаток (m/z 378). Кроме того, спектр, соответствующие [M-холин CH3 (сфингозин-1-фосфата)]– также полезно назначить LCB SM. Мы также подтвердили, что спектр деметилированное SPC (m/z 449) в основном производится из d18:1 НПЦ в условиях нашего анализа3 мс (рис. 1C).
Калибровочной кривой с помощью двух гетерогенны помечены SM видов было показано в рисунке 2A. Линии тренда была получена путем применения 1 / x2, в качестве коэффициента взвешивания. Результат анализа остаточного был показан на рисунке 2B. Обратите внимание, что остаточная стоимость недалеко от нижнего предела количественный (0.1 пмоль в этом настоящем исследовании) был меньше, применив 1 / x2, в качестве коэффициента взвешивания.
Параметры полученных калибровочной кривой и результат проверки были показаны в таблице 3. Значение точности и точности были в пределах ± 15%, показаны, что настоящее исследование удовлетворяет критериям как количественный метод с использованием LC-MS8.
Количество каждого вида SM в клетки HeLa была показана в таблице 4. НеЬа клетки были выращены в культуре средств массовой информации, содержащие 10% FBS и собранный. D18:1 / 16:0 SM и d18:1 / 24:1 SM были наиболее и вторым наиболее распространенным SM видов, структура которого были определены и состоят из 54% и 14% всего см, соответственно
Рисунок 1 . MS3 спектры сигналов конкретных m/z см в клетки HeLa. MS3 спектры химически синтезированных d18:1 / 24:0 SM (A) и d18:1 / 24:0 SM в образцах липидов, извлеченные из НеЬа клетки (B) отображаются. Результаты были адаптированы из Хама и др. 6 Обратите внимание, что интенсивность спектра НПФ больше, чем N-ацил остаток спектров3 сантиметр MS химически синтезированных d18:1 НПЦ приведены в (C), используя ионов с идентичными m/z ([M + HCOO]-, м /z 499) как прекурсор ионы 1 и 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Калибровочных кривых с помощью двух видов гетерогенны помечены SM SM. (A) калибровочной кривой с помощью двух гетерогенны помечены видов SM (d18:1 /(D9)-18:1-SM и d18:1-/(D31)-16:0 SM). Калибровочные кривые были построены с использованием весовой коэффициент = 1 / x2. В таблице 3перечислены результаты проверки. (B) остаточный анализ для оценки добра построенному градуировочному. Остатки в калибровочной кривой с помощью весовой коэффициент = 1 / x2 меньше, чем те, с использованием весовой коэффициент = 1 / x или 1, особенно в более низкое количество d18:1 /(D9)-18:1 сантиметр , пожалуйста, нажмите здесь чтобы посмотреть большую версию этого Рисунок.
| TurboIonSpray параметры | ||||||
| Режим | Занавес газ (psi) | Столкновение газ | Ион спрей напряжение (V) | Температура (° C) | Ионный источник газа 1 (psi) | Ионный источник газа 2 (psi) |
| MS-3 | 40 | Высокая | -4500 | 200 | 40 | 80 |
| MRM | 40 | 10 | 5500 | 300 | 40 | 80 |
Таблицы 1. Условия для качественного и количественного анализа источника ионов электроспрей. Эта таблица была адаптирована из Хама и др. 6
| режим | полярность | Ион прекурсоров (Q1) | Ион продукта или 2 прекурсоров Ион (Q3) | declustering потенциал (V) | Вход потенциальных (V) | Энергия столкновения (V) | столкновение клеток выхода потенциал (V) | распространение энергии столкновения (V) | Возбуждения время (МС) | Скорость (Da/сек) | время (ов) | резолюция |
| MRM | положительные | [M + H] + | 184 | 1 | 10 | 35 | 12 | - | - | - | 5.364 | Единица |
| MS-3 | негативные | [M + HCOO] - | M-15 | -26 | -10 | -40 | - | 0 | 25 | 10000 | автоматически caluculated | Единица |
Таблица 2. Параметры MS3 и режим управления записями сообщений в тройной квадрупольного и квадрупольного линейной ионной ловушки массового спектрометрирования используется для качественного и количественного анализа, соответственно. Эта таблица была адаптирована из Хама и др. 6
В таблице 3. Параметры полученных калибровочной кривой и результат проверки. Результаты были адаптированы из Хама и др. 6
| молекулярных видов SM | сумма (пмоль/мг белка) |
| D18:1 / 14:0 | 115.5 |
| D16:1 / 16:0 | 115.5 |
| D17:1 / 16:0 | 239.8 |
| D18:2 / 16:0 | 449.9 |
| D18:1 / 16:0 | 3355.1 |
| D18:0 / 16:0 | 203.8 |
| D18:1 / 17:0 | 106.3 |
| D18:2 / 18:0 | 26.5 |
| D20:0 / 16:1 | 94,9 |
| D18:1 / 18:0 | 94,9 |
| D18:2 / 22:0 | 102.3 |
| D18:1 / 22:0 | 235 |
| D18:1 / 23:1 | 83.3 |
| D18:1 / 23:0 | 23.9 |
| D18:1 / 24:2 | 286,5 |
| D18:2 / 24:1 | 286,5 |
| D18:1 / 24:1 | 853.2 |
| D18:1 / 24:0 | 94,6 |
| D18:1 / 25: 1 | 12,9 |
Таблица 4 . Количество каждого вида SM в клетки HeLa. НеЬа клетки были выращены в культуре средств массовой информации, содержащие 10% FBS. Клетки были собраны, и общая липидная фракция было извлечено методом Bligh и Дайер. Результаты были адаптированы из Хама и др. 6
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящий качественный метод, мы получили MS3 продукта ионов SPC и N-ацил остаток. Важно, чтобы правильно назначить SPC и N-ацил остаток. В этой связи следует отметить, что другие молекулы, содержащие фосфорилхолин также могут быть обнаружены как MS3 продукта ионов. Diacyl фосфатидилхолин (PC) и Плазмалогены PC изобилии присутствуют в клетках млекопитающих, и их гидрофобность подобна SM. Таким образом diacyl- и Плазмалогены ПК с изотопом (обычно 13C) может быть теоретически обнаружен одновременно с см. В наших экспериментах MS3 продукта ионов Плазмалогены PC одновременно наблюдались в анализе SM. Это полезно для правильно выбрать MS3 продукта ионов SM, чтобы знать, что интенсивность спектра НПФ больше, чем у SM N-ацил группу (рис. 1A и B). В противоположность этому, интенсивность жирных ацил остаток больше, чем (или почти так же, как), demethylated lysoplasmalogen-PC (данные не показаны).
В нынешний количественный метод важно точно подготовить образцы для построения калибровочной кривой и проверка метода. Кроме того весовой коэффициент должен быть должным образом используется для построения калибровочной кривой; Это полезно для улучшения кривой, особенно при низкой концентрации. Мы сравнили калибровочных кривых, используя различные весовые коэффициенты. Кривой на низкой концентрации явно была улучшена с помощью весовой коэффициент = 1 / x2 по сравнению с, что использование весовой коэффициент = 1 или 1 / x (рис. 2B). Значение точности и точности должна быть в пределах ± 15%. Если концентрация QC-L идентичен нижнюю границу калибровочной кривой (нижний предел количественный), она должна быть в пределах ± 20%8.
Мы использовали метод Bligh и Дайер для извлечения всего липидная фракция из культивируемых клеток в данном исследовании. Другие методы для извлечения липидов, например метод Folch также являются полезным9. Важно, чтобы извлечь липидная фракция, используя соответствующий метод согласно сумме или свойства образцов. Число видов SM, одновременно анализируется в каждой инъекции не должно быть слишком большим для того, чтобы предотвратить перегрузку программное обеспечение для сбора данных. Запланированное МНО будет полезным для quantitating ряд видов SM одновременно.
Наш нынешний метод, с помощью MS3 анализа полезно размышлять, количество углерода и двойные скрепления LCB и N-ацил общие см без дополнительных устройств. Однако нельзя получить другие структурную информацию, как расположение двойных связей, изомер (СНГ или транс) и форму (прямой или разветвленные). Это необходимо для получения продукта ионов и их структурная информация, с помощью дополнительных инструментов10,11,12,13использовать более высокой энергии. Молекулярная формула продукта ионов соответствует N-ацил постановление было [РРО2]– ионов, которые не содержат азота. В настоящее время неизвестно, как столкновение индуцированная диссоциации доходов.
Для анализа3 МС важно настроить параметры энергии столкновения (CE) и возбуждения время для MS3 фрагментации (ExT). Выше CE будет привести к избыточной фрагментации и уменьшить интенсивность продукта Ион demethylated SM как Ион 2nd прекурсоров. Кроме того осколков зависит значительно доб. Перед эксперименты, желательно, чтобы определить соответствующее условие CE и ExT, максимизировать интенсивность продукта ионов demethylated SM, SPC и N-ацил остаток вливая синтетических SM растворяют в подвижных фазах.
Мы использовали d18:1 /(D9)-18:1-SM и d18:1-/(D31)-16:0 как два вида гетерогенны помечены SM SM для построения калибровочной кривой. Эффективность ионизации зависит от видов SM и состояние этапа мобильных. Таким образом если количество SM интерес ограничено, желательно подготовить гетерогенны помечены SM видов, представляющих интерес для более точный количественный.
Согласно Ион прекурсоров и Ион продукт, соответствующий деметилированное SPC пока определена структура SM. Кроме того он иногда мешает точно определить нижний предел количественный в матрице образца присутствие, поскольку целевых соединений, представляющих интерес были обильно представлены в матрице образца.
Настоящее исследование является полезным оценить количество углерода и двойных связей в LCB и N-ацил группу на основе их соответствующего продукта ионов в MS3 экспериментов без дополнительных инструментов. Кроме того мы представляем метод количественного анализа для SM с использованием двух стабильных гетерогенны помечены SM видов, что облегчает определение диапазона, используемые в SM количественный. Нынешний метод будет полезным при характеристике различных видов уникальных SM в различных биологических образцов и промышленных товаров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они имеют никакого конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана исследовательский грант от министерства образования, культуры, спорта, науки и технологии Японии (KAKENHI) для К.Х. (#15 K 01691), Ю.Ф (#15 K 08625), к.ю. (#26461532) и Грант для изучения сложных заболеваний проекта от министерства Здравоохранения, труда и социального обеспечения (к.ю. #201510032A). Мы благодарим группу Edanz (www.edanzediting.com/ac) для редактирования проекта этой рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100 mm tissue culture dish | IWAKI | 3020-100 | |
| Cell scraper | IWAKI | 9000-220 | |
| Siliconized 2.0 mL tube | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Test tube | IWAKI | TST SCR 16-100 | |
| Teflon-lined screw cap | IWAKI | 9998CAP415-15 | |
| Disposable glass tube | IWAKI | 9832-1310 | |
| CAPCELL PAK C18 ACR 3 µm 1.5 mm I.D. x 100 mm | Shiseido | 92223 | Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column |
| CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE | Shiseido | 12197 | |
| Cartridge holder | Shiseido | 12415 | |
| Acetonitrile | Wako | 018-19853 | |
| 2-Propanol (Isopropyl Alcohol) | Wako | 161-09163 | |
| Methanol | Wako | 134-14523 | |
| Formic acid | Wako | 066-00466 | |
| 28% Ammonia water | Wako | 016-03146 | |
| Sonicator (bath type) | SHARP | UT-206H | |
| Vortex mixer for glass test tube | TAITEC | Mix-EVR | |
| 1.4 mL glass vial | Tomsic | 500-1982 | Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20°C |
| 8 mm septum | Tomsic | 200-3322 | When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum |
| Screw cap for 1.4 mm glass vial | Tomsic | 500-2762 | |
| Screw cap with slit septum | Shimadzu GLC | GLCTV-803 | |
| PVDF 0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
| Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry | SCIEX | QTRAP4500 | |
| The software for data acquisition and analysis of product ion spectra | SCIEX | Analyst | |
| The software for data integration in quantitative analysis | SCIEX | MultiQuant | |
| HPLC system | Shimadzu | Nexera | |
| Glass bottle | Sansyo | 85-0002 | |
| d18:1/24:0 sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860592P | |
| Sphingosylphosphorylcholine | Merck | 567735 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| L-glutamine | ThermoFisher | 25030081 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Eagle’s minimum essential medium | Sigma | M4655 |
References
- Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. Identification of a family of animal sphingomyelin synthases. EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).
- Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J.
- Kihara, A. Synthesis and degradation pathways, functions, and pathology of ceramides and epidermal acylceramides. Prog Lipid Res. 63, 50-69 (2016).
- Merrill, A. H., Sullards, M. C., Allegood, J. C., Kelly, S., Wang, E. Sphingolipidomics: high-throughput, structure-specific, and quantitative analysis of sphingolipids by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Methods. 36 (2), 207-224 (2005).
- Houjou, T., et al. Rapid and selective identification of molecular species in phosphatidylcholine and sphingomyelin by conditional neutral loss scanning and MS3. Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (24), 3123-3130 (2004).
- Hama, K., Fujiwara, Y., Tabata, H., Takahashi, H., Yokoyama, K. Comprehensive Quantitation Using Two Stable Isotopically Labeled Species and Direct Detection of N-Acyl Moiety of Sphingomyelin. Lipids. , (2017).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Gu, H., Liu, G., Wang, J., Aubry, A. F., Arnold, M. E. Selecting the correct weighting factors for linear and quadratic calibration curves with least-squares regression algorithm in bioanalytical LC-MS/MS assays and impacts of using incorrect weighting factors on curve stability, data quality, and assay performance. Anal Chem. 86 (18), 8959-8966 (2014).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Thomas, M. C., et al. Ozone-induced dissociation: elucidation of double bond position within mass-selected lipid ions. Anal Chem. 80 (1), 303-311 (2008).
- Baba, T., Campbell, J. L., Le Blanc, J. C., Baker, P. R. In-depth sphingomyelin characterization using electron impact excitation of ions from organics and mass spectrometry. J Lipid Res. 57 (5), 858-867 (2016).
- Ryan, E., Nguyen, C. Q. N., Shiea, C., Reid, G. E. Detailed Structural Characterization of Sphingolipids via 193 nm Ultraviolet Photodissociation and Ultra High Resolution Tandem Mass Spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. , (2017).
- Pham, H. T., Ly, T., Trevitt, A. J., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. Differentiation of complex lipid isomers by radical-directed dissociation mass spectrometry. Anal Chem. 84 (17), 7525-7532 (2012).
