Summary
Her præsenterer vi en protokol til at kvantificere og kvalificere hver sphingomyelin arter ved hjælp af flere reaktion overvågning og MS/MS/MS tilstand, henholdsvis.
Abstract
Vi præsenterer en metode med at analysere sphingomyelin (SM) kvalitativt og kvantitativt ved liquid chromatography-electrospray Ionisation-tandem massespektrometri (LC-ESI-MS/MS). SM er et fælles sphingolipid bestående af en phosphorylcholine og en ceramid som den hydrofile og hydrofobe komponent, henholdsvis. En række SM arter er til stede i pattedyrceller på grund af en række i den sphingoid lang kæde base (LCB) og et N-acyl gruppe i ceramid. I denne rapport, viser vi en metode til at anslå antallet af kulstof og dobbeltbindinger i en LCB og et N-acyl gruppe baseret på deres tilsvarende produkt ioner i MS/MS/MS (MS3) eksperimenter. Derudover præsenterer vi en kvantitativ analysemetode for SM ved hjælp af to stabile brændselsfremstilling navngivet SM arter, som letter fastsættelse af den anvendte i SM kvantitering måleområde. Den nuværende metode vil være nyttig i kendetegner en række SM arter i biologiske prøver og industrielle produkter som kosmetik.
Introduction
Sphingomyelin (SM) er en fælles sphingolipid i pattedyrsceller. SM er syntetiseret intracellulært1 og nutiden som en forløber for andre sphingolipids såsom en sphingosine-1-fosfat og en ceramid, som har afgørende roller i immune celle handel og hud barriere homøostase, henholdsvis2, 3. Således, den præcise analyse af SM stofskifte er vigtigt for belyse de fysiologiske og patologiske roller for sphingolipids.
SM er sammensat af en ceramid og et phosphorylcholine, der er knyttet til den 1-hydroxy gruppe af ceramid, som yderligere er sammensat af en sphingosine og en N-acyl gruppe. Et udvalg i carbon og dobbeltbinding tallene i både sphingosine og N-acyl gruppe resulterer i arternes antal ceramid (og SM). Seneste fremskridt inden for LC-ESI-MS/MS har aktiveret kvantitativ og kvalitativ analyse af SM4,5. I den kvalitative analyse, blev antallet af kulstof og dobbeltbindinger af en sphingoid LCB af SM identificeret ved at tildele produkt ion spektre af LCB. Imidlertid strukturelle oplysninger af N-acyl gruppe var ikke direkte fremstillede fordi dens tilsvarende produkt ioner ikke er blevet rapporteret, og derfor N-acyl fraspaltning blev udledt af differentieret analyse mellem forløber ioner og produkt ioner svarende til LCB i både positiv og negativ ion modus4,5. I denne betænkning, vi præsenterer en metode til at registrere produktet ioner af både LCB og N-acyl gruppe samtidig i MS3 tilstand ved hjælp af tredobbelt Quadrupol og Quadrupol lineær ion trap-massespektrometri, som letter den præcise struktur spekulationer af hver SM arter6.
Ion suppression (eller forbedring) effekter forårsaget af matrix i biologiske prøver hæmme nøjagtig kvantificering i LC-ESI-MS analyse, og det er derfor ønskeligt at konstruere kalibreringskurverne for alle analysander interesse i matrixen identiske den biologiske prøve. Denne strategi er imidlertid ikke muligt, fordi det er næsten umuligt at forberede alle SM arter i biologiske prøver, navnlig omfattende analyse. Således er det praktisk at konstruere en kalibreringskurve og bestemme kvantitative området ved hjælp af en repræsentativ SM arter spidse i de biologiske prøver. Vi brugte to brændselsfremstilling mærket SM arter for at konstruere en kalibreringskurve; en blev brugt til en intern standard og den anden for en standard sammensatte. Vi opdaget en lille mængde af brændselsfremstilling mærket SM arter som en standard sammensatte spidse i biologiske prøver og med succes opnået en kalibreringskurve og kvantitative række6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Høre alle relevante materiale sikkerhedsdatablade (MSDS) før brug. Bære handsker for at minimere prøve kontaminering af hud-afledte SM. Denne protokol blev anvendt til HeLa celler dyrkes i Eagles mindste afgørende medium suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 1.000 U/L penicillin og 100 mg/L streptomycin.
1. forberedelse af Lipid prøver
Bemærk: Det er vigtigt, at alle glasvarer inklusive reagensglas med Teflon-foret skruelåg vaskemiddel-fri.
- Ekstraktion af total lipid brøkdel fra celle homogenatet ved hjælp af Bligh & Dyer metode7
- Fjern kultur (eller aircondition) medier fra 10-cm vævskultur parabol og skylles to gange med 6 mL iskold PBS.
- Der tilsættes 1 mL iskold PBS i 10 cm vævskultur skål med P1000 pipette. Høste cellerne med celle skrabere og samler ind 2,0 mL Silikoniseret plasticrør.
- Efter centrifugering (1.000 × g, 5 min, 4 ° C), Fjern supernatanten ved P1000 pipette.
- Der tilsættes 1 mL methanol. Vortex rør kort og sonikeres på 200 W i 5 min i en bad-type sonikator.
Bemærk: Justere vandstanden i et badekar-type sonikator, så cellen pellet er effektivt homogeniseret. - Overføre celle homogenatet i methanol med pipette i reagensglas (13 mm x 100 mm) med Teflon-foret skruelåg.
- Der tilsættes 1 mL methanol, 1 mL chloroform, 0,8 mL dobbeltdestilleret vand og 50 µL af 10 µmol/L af intern standard d18:1 /(D31)-16:0 SM i hvert reagensglas.
- Vortex reagensglas kraftigt i 5 min ved stuetemperatur.
Bemærk: på dette punkt, en enkelt fase (chloroform/methanol/vand = 1/2/0,8 (v/v/v)) er dannet. - Der tilsættes 1 mL chloroform og 1,0 mL dobbeltdestilleret vand.
- Vortex rør kraftigt på 2,500 rpm i 5 min ved stuetemperatur.
Bemærk: på dette punkt, den vandige (øverste) og økologiske (lavere) fase er adskilt. - Efter centrifugering (2.150 × g, 5 min, 25 ° C), indsamle og overføre den nederste fase i engangs glasrør (indledende lavere fase).
Bemærk: Indsamle de lavere fase ved hjælp af Pasteurs pipette og en sikkerhed pipette filter. Indsæt spidsen af pipetten i den nederste fase, klem den lille pære ud for 'E' ventil til at levere den øverste fase og interfacial fnug inde i spidsen af en pipette, og derefter Sifon den nederste fase i pipetten. - Tilsættes 2 mL chloroform i reagensglas og vortex rør kraftigt på 2,500 rpm i 5 min ved stuetemperatur til at tilstrækkeligt blandes med den øverste fase og interfacial fnug.
- Efter centrifugering (2.150 × g, 5 min, 25 ° C), indsamle og overføre den modificerede lavere fase i engangsemballage glasrør med den indledende lavere fase som beskrevet i trin 1.1.10.
- Placer glasrør under en nitrogen stream og helt fjerne de organiske opløsningsmidler i de indsamlede lavere fase.
- Rekonstruere prøverne med 500 µL af methanol eller ethanol, filtratet med 0,02 µm filter og opbevares i hætteglas ved-20 ° C.
- Prøveforberedelse til konstruere kalibreringskurven og validere metoden
- Tilsæt 50 µL af 0,1, 0,5, 1, 5, 10 eller 50 µmol/L af standard sammensatte (d18:1 /(D9)-18:1 SM) i reagensglas med Teflon-foret skruelåg.
- Tilføje celle homogenatet i hvert reagensglas og tilsættes 1 mL methanol.
Bemærk: Mængden af cellen homogenatet som en matrix varierer efter hvert forsøg. Hvis SM arter i prøverne stammer fra celler i en 10-cm kultur parabol analyseres rutinemæssigt, bør mængden af cellen homogenatet i hvert reagensglas være tæt på at af celler i en 10-cm kultur parabol. - Uddrag den samlede lipid brøkdel, som beskrevet i trin 1.1.6-1.1.14.
- Forberede kvalitet check (QC) prøver til at validere metoden som descried i trin 1.2.1-1.2.3. Forberede tre QC prøver med forskellige koncentrationer af standard sammensatte (d18:1 /(D9)-18:1 SM): en inden for 3 x den nedre grænse af standardkurven (QC-lav, QC-L), en nær centrum (QC-middle, QC-M), og en nær den øvre grænse for den Standardkurven (QC-høj, QC-H).
2. SM analyse af LC-ESI-MS/MS
- Forberedelse af den mobile fase
- Bland opløsningsmidler (methanol-acetonitril-Hedeselskabet2O = 2/2/1 (v/v/v) vandig fase og isopropanol for den organiske fase) i glas flasker med Teflon-foret skruelåg og Rens med ultralyd i 5 min i en bad-type sonikator.
- Tilføje myresyre (slutkoncentration 26.4 mmol/L) og NH4OH (14,9 mmol/L) i hver Mobil fase.
- Kvalitativ analyse af SM af LC-ESI-MS3
- Aktivere højtydende væskekromatografi (HPLC) system, sætte fjorden rør i glasflasker, som indeholder mobile faser, og rense HPLC linjer. Linke en C18 HPLC kolonne (1,5 mm i.d. × 100 mm længde, partikel størrelse 3,0 µm) til HPLC system, holde temperaturen i kolonneovnen ved 50 ° C og betingelse for kolonnen med den mobile vandfasen på 100 µL/min. tages prøverne i en stikprøve rack i autosampl øh.
- Angiv parametre for triple Quadrupol og Quadrupol lineær ion trap massespektrometri system for MS3 analyse som anført i tabel 1 og tabel 2 samt første og anden forløber ioner af SM arter af interesse.
- Dobbeltklik på ikonet software til dataopsamling, dobbeltklik på den hardwarekonfiguration, Vælg 'LC + QTRAP4500 + ventil', og klik på 'Aktiver profil'.
- Oprette en ny undermappe ved at klikke på 'Ny delprojekt' og 'OK'.
- Klik på fanen 'fil', Vælg 'Ny', og vælg 'Erhvervelse metode' og 'OK'. Klik på ikonet "Masse Spec" og "MS" tab. Vælg Skan type som 'MS/MS/MS (MS3)', Scan rate som 10.000 Da/s, polaritet som 'Negative' og 'Varighed' som hele tiden skal analyseres (min). Sæt m/z 'Start (Da)' og «Stop (Da)» som interval der skal scannes. Sæt m/z af 1st og 2nd forløber ioner af target SM arter af interesse.
Bemærk: For at analysere flere SM arter, fremhæve den '-MS3' ikon, højreklikke, vælge 'Kopier dette eksperiment', og derefter sætte m/z af 1st og 2nd forløber ioner af andre arter, SM. - Vælg fanen 'Avanceret MS', og indstille hver parameter som følger: Scan-tilstand som 'Profil', trin størrelse som 0,12 (Da), opløsning Q1 og Q3 'Enhed' og 'TÆNDTE', henholdsvis intensitet tærskel som 0, indstilling tid som 50 (ms), Pause mellem massen intervaller som 1,5 ms, Vælg ' dynamiske fylde tid ', Q3 adgangsbarriere som 8 V og Excitation tid som 25 ms.
- Klik på knappen 'Rediger parametre' under fanen 'MS' og sluttet den 'kilde/Gas' tab. indstille parametre for gardin gas, kollision gas, ionspray spænding, temperatur, ion kilde gas1 og gas2 som anført i tabel 1. Derefter Vælg fanen 'Sammensatte' indstille parametre for declustering potentiale, indgangen potentiale, kollisionen energi, excitation energi og kollisionen energi spredes som anført i tabel 2.
- Fremhæve 'Integreret Valco ventil' og vælg 'Stilling navn for trin 0' som A, og Indstil 'B' som placering for alt tid 5.0 min. Også indstille 'A' som placering for alt tid 70.0 min.
- Fremhæve 'Shimadzu LC systemet'. Vælg fanen 'Pumpe' og Indstil Pumping som binære flow, samlede flow som 0,28 mL/min., og maksimalt pres grænser som 20,0 MPa. Vælg fanen 'Autosampler' og indstille føres som 200 µL, nål slagtilfælde som 52 mm, skylning hastighed som 35 µL/s, prøveudtagning hastighed som 5.0 µL/s, rense tid som 25,0 min., skyl dukkert tid som 5 s, og skyl tilstand som før og efter aspiration.
- Derudover aktiverer den køligere enhed, angive den køligere temperatur som 4 ° C og kontrol hætteglas nål slagtilfælde som 52 mm. Vælg fanen 'Ovn' aktiverer ovnen og sæt ovntemperatur og maksimal temperatur som 50 ° C og 85 ° C, henholdsvis.
- Vælg fanen "Controller", og Marker afkrydsningsfeltet 'Tændt'. Vælg fanen 'Tid Program' og sæt de opløsningsmiddel forløb som følger: opløsningsmidler A / B i forholdet 100/0 i 5 min, program lineære ændringer til 80/20 mere end 4 min., til 35/65 over 50 min, og at 25/75 over 1 min. bagefter , hold dem på 25/75 10 min og derefter lineært til 100/0 over 4 min. Gem derefter metoden.
- Opret batchfil
- Dobbeltklik på ikonet 'Bygge erhvervelse Batch', klik på 'Tilføj sæt', 'Tilføj prøver', angive antallet af nye prøver, og klik på 'OK'.
- Klik på knappen ' metode Editor' og Vælg metoden, der skal anvendes. Hvis flere metoder der bruges i en batchfil, afkrydsningsfeltet 'Brug flere metoder' og vælg erhvervelse metode til hver prøve. Omdøbe ' prøve ' og angive det relevante nummer for 'Hætteglas Position' sætte mængden af Injektionsvolumen. Gem derefter batchfilen.
- Få MS3 produkt ion spektre af SM arter af interesse ved LC-ESI-MS3 analyse
- Vælg fanen 'Send' i batchfilen, fremhæve linjen af prøver der skal analyseres, og klik på knappen 'Send'.
- Klik på den '' Se Quene' ikon, 'Ekvilibreres' ikon, Vælg erhvervelse metode bruges, indstille tid som 1 min, og klik på 'OK'.
- Deaktivere "Reserve Instrument for Tuning" ved at klikke på det tilsvarende ikon. Derefter udføre batchsekvens ved at klikke på ikonet 'Start prøve'.
- Tildele hver MS3 produkt ion spektre af SM ved at sammenligne masse at oplade ratio (m/z) af produktet ion spectra og den nøjagtige masse af sphingoid LCB og N-acyl gruppe af interesse. Bestemme antallet af kulstofatomer og dobbelt obligationer i sphingoid LCB og N-acyl gruppe ifølge de tilsvarende produkt ioner.
- Bekræfte, at mappen passende delprojekt er valgt, så Dobbeltklik på ikonet 'Open datafil', og vælg prøver der skal analyseres. Træk top i kromatogrammet for hvert mål SM arter og derefter dobbeltklikke. De opnåede MS3 produkt ion spectra inden for området trukket vil blive præsenteret.
- Kvantitativ analyse af SM af LC-ESI-MS/MS
- Sæt den mobile faser og HPLC kolonne som beskrevet i trin 2.1 og 2.2.1.
- Angiv parametrene for den tredobbelte Quadrupol og Quadrupol lineær ion trap massespektrometri system for flere reaktion overvågning (MRM) analyse, som anført i tabel 1 og tabel 2.
- Gennemføre procedurerne, som beskrevet i trin 2.2.2.1 og 2.2.2.2.
- Klik på fanen 'fil', Vælg 'Ny', og vælg 'Erhvervelse metode' og 'OK'. Klik på ikonet "Masse Spec" og "MS" tab. Vælg Skan type som "MRM', polaritet som 'Positive'. Angiv 'Varighed' som hele tiden skal analyseres. Sæt m/z [M + h]+ og 184 som 'Q1 masse (Da)' og 'Q3 masse (Da)"Target SM arter af interesse. Angiv 'Time' som 10 ms og 'ID' som navnet på target SM arter.
- Vælg fanen 'Avanceret MS', og indstille hver parameter som følger: både i beslutningsforslaget Q1 og Q3 som 'Enhed', intensitet tærskel som 0, indstille tid som 0 (ms) og Pause mellem massen intervaller som 5 ms.
- Klik på knappen 'Rediger parametre' under fanen 'MS' og vælg fanen ' Kilde/Gas' sætte parameteren gardin gas, kollision gas, ionspray spænding, temperatur, ion kilde gas1 og gas2 som anført i tabel 1. Vælg derefter fanen 'Sammensatte' opstille parametrene for declustering potentiale, indgangen potentiale, kollisionen energi og kollision celle exit potentiale som anført i tabel 2.
- Sæt ventilen, som beskrevet i trin 2.2.2.6.
- Angive LC betingelse, som beskrevet i trin 2.2.2.7. Gem derefter metoden.
- Opret batchfilen, som beskrevet i trin 2.2.3.
- Hente MRM data for hver SM arter af LC-ESI-MS/MS analyse som beskrevet i trin 2.2.4.
- Behandle MRM data ved hjælp af software til dataintegration og hente data fra topareal for udpakkede ion kromatogrammet af hver art, SM.
- Dobbeltklik på ikonet software for dataintegration i kvantitativ analyse, klik på fanen 'Rediger' og vælg brugeren Integration standarder. Indstille Gaussisk glat bredde som 1,0 punkt, og klik på 'OK'. Klik på fanen 'Rediger' og vælg 'Ny resultater tabel'. Vælg prøven, som skal integreres, klik på en pil, og klik på 'Næste'. Vælg 'Opret ny metode', Angiv navnet på metoden, og klik på 'Next'. Klik på 'Næste' og indskrive boksen i d18:1 /(D31)-16:0 SM som den er, skal du klikke på 'Næste', og klik på 'Udfør'.
- Klik på 'Viser peak anmeldelse' og bekræfte at Kromatogrammets toppe genkendes korrekt. Det skal bemærkes, at retentionstiden for d18:1 /(D31)-16:0 SM er normalt mindre af ~ 0,3 min sammenlignet med ene af 34-1 SM (normalt består af d18:1 / 16:0 SM).
- Kvantificere hver SM arter efter forhold i toppen af hver SM art, d18:1 /(D31)-16:0 SM intern standard.
- Klik på fanen 'Fil', Vælg 'Eksporter', Vælg 'Resultater tabel', bekræfter formatet som 'MultiQuant', kolonner som 'Eksporter alle kolonner', rækker som 'Eksporter alle rækkerne undtagen de udtrykkeligt skjulte', og klik derefter på 'OK'.
- Åbn den eksporterede fil i Excel software. Normalisere området i target SM arter af området i IS (d18:1 /(D31)-16:0 SM). Derefter multipliceres med det teoretiske beløb for er i injiceres stikprøven beregne mængden af target SM arter i den injicerede prøve.
- Konstruere standardkurven
- Få MRM data af d18:1 /(D9)-18:1 SM og d18:1 /(D31)-16:0 SM i prøver til at konstruere standardkurven af LC-ESI-MS/MS analyse som beskrevet i trin 2.3.1-2.3.4.
- Få data af toparealet for d18:1 /(D9)-18:1 SM og d18:1 /(D31)-16:0 SM som beskrevet i trin 2.3.5.
- Beregningen af d18:1 /(D9)-18:1 SM i injiceres prøven som beskrevet i trin 2.3.6.
- Konstruere tendenslinjen ved at indstille x- og y-aksen som nominelle beløb og beregnede mængden af d18:1 /(D9)-18:1 SM og få formlen tendenslinje.
- Validering af den kvantitative metode ved hjælp af Excel software
- Til validering af metoden, kvantificere mængden af d18:1 /(D9)-18:1 SM og d18:1 /(D31)-16:0 SM i QC prøver ved at analysere hver QC prøve mindst tre gange i 1 dag, og Gentag mindst 3 dage som beskrevet i trin 2.3.1-2.3.4.
- Få peak område data og beregne mængden af d18:1 /(D9)-18:1 SM i injiceres prøven som beskrevet i trin 2.3.5 og 2.3.6.
- Ifølge kalibreringskurven opnået, beregne mængden af d18:1 /(D9)-18:1 SM i eksemplet injiceres.
- Evaluering af præcision
- Beregne gennemsnit og standardafvigelse af mængden af d18:1 /(D9)-18:1 SM opnåede i trin 2.5.3 på datasæt af intra-dag og Inter dag bruger Excel software.
- Den gennemsnitlige opnåede i trin 2.5.4.1 er divideret med standardafvigelse og udtrykt i %.
- Vurdering af nøjagtighed
- Beregn nøjagtigheden af hver data som følger:
[(De beregnede beløb, der fremkommer i trin 2.5.3.) / (Nominelle beløb) - 1] × 100(%) - Beregne gennemsnittet af den absolutte værdi af nøjagtighed på datasæt af de intra-dag og Inter.
- Beregn nøjagtigheden af hver data som følger:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kemisk syntetiseret d18:1 / 24:0 SM (fig. 1A) og d18:1 / 24:0 SM i lipid prøver udvundet fra HeLa celler (figur 1B) blev analyseret af LC-ESI-MS3 ansætte [M + HCOO]- og [M-CH3]- som første og anden forløber ioner, henholdsvis. Bemærk, at spektret intensiteten af demethylated-sphingosylphosphorylcholine (SPC) (m/z 449) er større end SM N-acyl gruppe (m/z 378). Derudover spektrum svarende til [M-cholin-CH3 (sphingosine-1-fosfat)]- er også nyttigt at tildele LCB af SM. Vi bekræftede også, at spektret af demethylated SPC (m/z 449) fremstilles hovedsageligt fra d18:1 SPC under betingelse af vores MS3 analyse (figur 1C).
Kalibreringskurven ved hjælp af to brændselsfremstilling navngivet SM arter blev vist i figur 2A. Tendenslinjen blev opnået ved at anvende 1 / x2som vægtningsfaktoren. Resultatet af den resterende analyse var vist i figur 2B. Bemærk, at restværdien tæt på lavere grænse for kvantitering (0,1 pmol i denne foreliggende undersøgelse) var mindre ved at anvende 1 / x2som vægtningsfaktoren.
Parametrene for den fremkomne kalibreringskurve og resultat af valideringen blev vist i tabel 3. Værdien af den præcision og nøjagtighed var inden for ± 15%, viser, at den nuværende undersøgelse opfylder kriterierne som en kvantitering metode ved hjælp af LC-MS8.
Mængden af hver art, SM i HeLa celler blev vist i tabel 4. HeLa celler blev dyrket i kultur medier indeholdende 10% FBS og høstes. D18:1 / 16:0 SM og d18:1 / 24:1 SM var de mest og anden mest rigelige SM arter, hvis struktur blev bestemt, og består af 54% og 14% af de samlede SM, henholdsvis
Figur 1 . MS3 spektre af bestemte m/z signaler af SM i HeLa celler. MS3 spektre af kemisk syntetiseret d18:1 / 24:0 SM (A) og d18:1 / 24:0 SM i lipid prøver udvundet fra HeLa celler (B) er vist. Resultaterne var tilpasset fra Hama et al. 6 Bemærk, at spektret intensiteten af produktresuméet er større end N-acyl gruppe af SM. MS3 spektre af kemisk syntetiseret d18:1 SPC er vist i (C) ved at ansætte ioner med identiske m/z ([M + HCOO]-, m /z 499) som 1st og 2nd forløber ioner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Kalibreringskurverne for SM ved hjælp af to brændselsfremstilling mærket SM arter. (A) kalibrering kurve ved hjælp af to brændselsfremstilling mærket SM arter (d18:1 /(D9)-18:1 SM og d18:1 /(D31)-16:0 SM). Kalibreringskurverne blev bygget ved hjælp af vægtningsfaktoren = 1 / x2. Resultaterne af valideringen er angivet i tabel 3. (B) resterende analyse til vurdering af godhed af en konstrueret kalibreringskurven. Residualer i kalibreringskurven ved hjælp af vægtningsfaktoren = 1 / x2 er mindre end dem ved hjælp af vægtningsfaktoren = 1 / x eller 1, især i en lavere mængde af d18:1 /(D9)-18:1 SM. venligst klik her for at se en større version af denne figur.
| TurboIonSpray indstillinger | ||||||
| Mode | Gardin Gas (psi) | Kollision Gas | ion spray spænding (V) | Temperaturen (° C) | ion kilde gas 1 (psi) | ion kilde gas 2 (psi) |
| MS3 | 40 | Høj | -4500 | 200 | 40 | 80 |
| MRM | 40 | 10 | 5500 | 300 | 40 | 80 |
Tabel 1. Betingelserne for electrospray ion kilde bruges til både kvalitative og kvantitative analyser. Denne tabel blev tilpasset fra Hama et al. 6
| mode | polaritet | forløber ion (Q1) | produkt ion eller 2nd forløber ion (Q3) | declustering potentiale (V) | indgangen potentielle (V) | kollisionen energi (V) | kollision cellepotentiale exit (V) | kollisionen energi spredes (V) | Excitation tid (ms) | Hastighed (Da/sek) | tid (s) | opløsning |
| MRM | positive | [M + H] + | 184 | 1 | 10 | 35 | 12 | - | - | - | 5.364 | Enhed |
| MS3 | negative | [M + HCOO] - | M-15 | -26 | -10 | -40 | - | 0 | 25 | 10000 | automatisk caluculated | Enhed |
Tabel 2. Parametrene for MS3 og MRM tilstand i tredobbelt Quadrupol og Quadrupol lineær ion trap masse SPEKTROMETRI anvendes for analyse af kvalitative og kvantitative henholdsvis. Denne tabel blev tilpasset fra Hama et al. 6
Tabel 3. Parametrene for den fremkomne kalibreringskurve og resultatet af validering. Resultaterne var tilpasset fra Hama et al. 6
| Molekylær arter af SM | beløb (pmol/mg protein) |
| D18:1 / 14:0 | 115.5 |
| D16:1 / 16:0 | 115.5 |
| D17:1 / 16:0 | 239.8 |
| D18:2 / 16:0 | 449.9 |
| D18:1 / 16:0 | 3355.1 |
| D18:0 / 16:0 | 203.8 |
| D18:1 / 17:0 | 106.3 |
| D18:2 / 18:0 | 26,5 |
| D20:0 / 16:1 | 94.9 |
| D18:1 / 18:0 | 94.9 |
| D18:2 / 22:0 | 102.3 |
| D18:1 / 22:0 | 235 |
| D18:1 / 23:1 | 83,3 |
| D18:1 / 23:0 | 23,9 |
| D18:1 / 24:2 | 286.5 |
| D18:2 / 24:1 | 286.5 |
| D18:1 / 24:1 | 853.2 |
| D18:1 / 24:0 | 94,6 |
| D18:1 / 25: 1 | 12,9 |
Tabel 4. Mængden af hver art, SM i HeLa celler. HeLa celler blev dyrket i kultur medier indeholdende 10% FBS. Celler er høstet, og samlede lipid brøkdel blev udvundet af Bligh & Dyer metode. Resultaterne var tilpasset fra Hama et al. 6
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den nuværende kvalitative metode, vi opnåede MS3 produkt ioner af en SPC og et N-acyl gruppe. Det er afgørende for korrekt tildele både en SPC og et N-acyl gruppe. Med henblik herpå, skal det bemærkes, at andre phosphorylcholine-holdige molekyler kan også påvises som MS3 produkt ioner. Diacyl-phosphatidylcholin (PC) og plasmalogen-PC er rigeligt til stede i pattedyrceller, og deres hydrophobicity er svarer til SM. Derfor kan diacyl-PC og plasmalogen-PC med en isotop (normalt 13C) teoretisk påvises samtidig med SM. I vores forsøg blev MS3 produkt ioner af plasmalogen-PC samtidigt observeret i SM analyse. Det er nyttigt at korrekt Vælg MS3 produkt ioner af SM, spektrum intensiteten af produktresuméet er større end SM N-acyl gruppe (figur 1A og B). Derimod intensiteten af fed acyl-gruppe er større end (eller næsten det samme som), af den demethylated lysoplasmalogen-PC (data ikke vist).
I den nuværende kvantitative metode er det kritisk at netop forberede prøverne for opbygningen af kalibreringskurven og validere metoden. Desuden bør er vægtningsfaktoren ordentligt bruges til at konstruere kalibreringskurven; Det er nyttigt at forbedre kurven montering især på en lav koncentration. Vi sammenlignede kalibreringskurverne ved hjælp af forskellige vægtningsfaktorer. Kurven montering ved lav koncentration var klart forbedret ved hjælp af vægtningsfaktoren = 1 / x2 forhold til at bruge vægtningsfaktoren = 1 eller 1 / x (figur 2B). Værdien af den præcision og nøjagtighed skal være inden for ± 15%. Hvis koncentrationen af QC-L er identisk med den nedre grænse for standardkurven (nedre grænse for kvantitering), bør det være inden for ± 20%8.
Vi ansat Bligh & Dyer metoden til at udtrække den samlede lipid brøkdel fra dyrkede celler i denne undersøgelse. Andre metoder for lipid udvinding som metoden Folch er også nyttige9. Det er vigtigt at udtrække lipid brøkdel ved hjælp af passende metode efter beløb og/eller egenskaber af prøverne. Antallet af SM arter samtidig analyseres i hver injektion bør ikke være for stor for at undgå overbelastning software til dataopsamling. Den planlagte MRM vil være nyttigt for quantitating en række SM arter samtidig.
Vores nuværende metode ved hjælp af MS3 analyse er nyttig til at spekulere antallet af kulstof og dobbeltbindinger LCB og N-acyl gruppe af SM uden yderligere enheder. Men andre strukturelle oplysninger såsom placering af dobbeltbindinger, isomer (cis eller trans) og form (straight eller forgrenede) ikke kan opnås. Det er nødvendigt at bruge højere energi for at få produktet ioner og deres strukturelle oplysninger ved hjælp af yderligere instrumenter10,11,12,13. Den molekylære formel for de produkt ioner svarende til N-acyl fraspaltning var [RCO2]- -ioner, der ikke indeholder kvælstof. Det er i øjeblikket uvist hvor kollisionen induceret dissociation provenuet.
For MS3 analyse er det vigtigt at justere parametrene for kollisionen energi (CE) og excitation tid for MS3 fragmentering (ExT). En højere CE vil forårsage overskydende fragmentering og reducere intensiteten af produkt ion af demethylated SM som 2nd forløber ion. Derudover er fragmentering mønster betydeligt afhængig af ExT. Før eksperimenter, er det ønskeligt at bestemme den passende betingelse af CE og ExT at maksimere intensiteten af produktet ioner af demethylated SM, SPC og N-acyl gruppe ved infusion af syntetiske SM opløses i de mobile faser.
Vi brugte d18:1 /(D9)-18:1 SM og d18:1 /(D31)-16:0 SM som to brændselsfremstilling mærket SM arter at konstruere kalibreringskurven. Effektiviteten af ioniserende stråling kan variere alt efter SM arterne og tilstanden af den mobile fase. Hvis antallet af SM af interesse er begrænset, er det således ønskeligt at forberede brændselsfremstilling mærket SM arter af interesse for mere nøjagtig kvantificering.
SM struktur er fastlagt indtil nu forløber ion og produkt ion svarende til demethylated SPC. Derudover var det undertiden hæmmet for at netop afgøre den nedre grænse for kvantitering i prøvematrixen tilstedeværelse, da målet forbindelser af interesse var rigeligt i prøvematrixen.
Den foreliggende undersøgelse er nyttigt at anslå antallet af kulstof og dobbeltbindinger i en LCB og et N-acyl gruppe baseret på deres tilsvarende produkt ioner i MS3 eksperimenter uden yderligere instrumenter. Derudover præsenterer vi en kvantitativ analysemetode for SM ved hjælp af to stabile brændselsfremstilling navngivet SM arter, som letter fastsættelse af den anvendte i SM kvantitering måleområde. Den nuværende metode vil være nyttig i kendetegner en række unikke SM arter i forskellige biologiske prøver og industrielle produkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af forskning tilskud fra Undervisningsministeriet, kultur, sport, videnskab og teknologi i Japan (KAKENHI) til K.H. (#15 K 01691), Y.F. (#15 K 08625), Ky (#26461532) og et tilskud til studiet af vanskelige sygdom projekt fra ministeriet for Sundhed, arbejdskraft og velfærd (Ky #201510032A). Vi takker gruppen Edanz (www.edanzediting.com/ac) til at redigere et udkast af dette manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100 mm tissue culture dish | IWAKI | 3020-100 | |
| Cell scraper | IWAKI | 9000-220 | |
| Siliconized 2.0 mL tube | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Test tube | IWAKI | TST SCR 16-100 | |
| Teflon-lined screw cap | IWAKI | 9998CAP415-15 | |
| Disposable glass tube | IWAKI | 9832-1310 | |
| CAPCELL PAK C18 ACR 3 µm 1.5 mm I.D. x 100 mm | Shiseido | 92223 | Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column |
| CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE | Shiseido | 12197 | |
| Cartridge holder | Shiseido | 12415 | |
| Acetonitrile | Wako | 018-19853 | |
| 2-Propanol (Isopropyl Alcohol) | Wako | 161-09163 | |
| Methanol | Wako | 134-14523 | |
| Formic acid | Wako | 066-00466 | |
| 28% Ammonia water | Wako | 016-03146 | |
| Sonicator (bath type) | SHARP | UT-206H | |
| Vortex mixer for glass test tube | TAITEC | Mix-EVR | |
| 1.4 mL glass vial | Tomsic | 500-1982 | Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20°C |
| 8 mm septum | Tomsic | 200-3322 | When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum |
| Screw cap for 1.4 mm glass vial | Tomsic | 500-2762 | |
| Screw cap with slit septum | Shimadzu GLC | GLCTV-803 | |
| PVDF 0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
| Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry | SCIEX | QTRAP4500 | |
| The software for data acquisition and analysis of product ion spectra | SCIEX | Analyst | |
| The software for data integration in quantitative analysis | SCIEX | MultiQuant | |
| HPLC system | Shimadzu | Nexera | |
| Glass bottle | Sansyo | 85-0002 | |
| d18:1/24:0 sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860592P | |
| Sphingosylphosphorylcholine | Merck | 567735 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| L-glutamine | ThermoFisher | 25030081 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Eagle’s minimum essential medium | Sigma | M4655 |
References
- Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. Identification of a family of animal sphingomyelin synthases. EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).
- Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J.
- Kihara, A. Synthesis and degradation pathways, functions, and pathology of ceramides and epidermal acylceramides. Prog Lipid Res. 63, 50-69 (2016).
- Merrill, A. H., Sullards, M. C., Allegood, J. C., Kelly, S., Wang, E. Sphingolipidomics: high-throughput, structure-specific, and quantitative analysis of sphingolipids by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Methods. 36 (2), 207-224 (2005).
- Houjou, T., et al. Rapid and selective identification of molecular species in phosphatidylcholine and sphingomyelin by conditional neutral loss scanning and MS3. Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (24), 3123-3130 (2004).
- Hama, K., Fujiwara, Y., Tabata, H., Takahashi, H., Yokoyama, K. Comprehensive Quantitation Using Two Stable Isotopically Labeled Species and Direct Detection of N-Acyl Moiety of Sphingomyelin. Lipids. , (2017).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Gu, H., Liu, G., Wang, J., Aubry, A. F., Arnold, M. E. Selecting the correct weighting factors for linear and quadratic calibration curves with least-squares regression algorithm in bioanalytical LC-MS/MS assays and impacts of using incorrect weighting factors on curve stability, data quality, and assay performance. Anal Chem. 86 (18), 8959-8966 (2014).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Thomas, M. C., et al. Ozone-induced dissociation: elucidation of double bond position within mass-selected lipid ions. Anal Chem. 80 (1), 303-311 (2008).
- Baba, T., Campbell, J. L., Le Blanc, J. C., Baker, P. R. In-depth sphingomyelin characterization using electron impact excitation of ions from organics and mass spectrometry. J Lipid Res. 57 (5), 858-867 (2016).
- Ryan, E., Nguyen, C. Q. N., Shiea, C., Reid, G. E. Detailed Structural Characterization of Sphingolipids via 193 nm Ultraviolet Photodissociation and Ultra High Resolution Tandem Mass Spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. , (2017).
- Pham, H. T., Ly, T., Trevitt, A. J., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. Differentiation of complex lipid isomers by radical-directed dissociation mass spectrometry. Anal Chem. 84 (17), 7525-7532 (2012).
