Summary
כאן, אנו מציגים בפרוטוקול כדי לכמת ויגדיר לכל מין ספינגומיילין באמצעות ניטור התגובה מרובים ומצב MS/MS/MS, בהתאמה.
Abstract
אנו מציגים שיטה של ניתוח ספינגומיילין (SM) איכותית, באופן כמותי באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית electrospray יינון-טנדם ספקטרומטר מסה (LC-ESI-MS/MS). SM הוא ספינגוליפיד משותף מורכב של phosphorylcholine של ceramide כרכיב הידרופיליות, הידרופוביות, בהתאמה. מספר מינים SM נמצאים בתאי יונקים בשל מגוון רחב של sphingoid ארוך רשת בסיס (LCB) N-moiety ליפיד ב- ceramide. בדו ח זה, אנו מציגים שיטה להערכת המספר של פחמן קשרים כפולים LCB, N-moiety ליפיד המבוסס על יונים המוצר המקביל שלהם בניסויים MS/MS/MS (MS3). בנוסף, אנו מציגים שיטת ניתוח כמותי ס באמצעות שני יציב isotopically שכותרתו SM מינים, אשר מקלה על קביעת הטווח בשימוש SM כימות. השיטה הנוכחית יהיה מועיל באפיון מגוון מינים SM דגימות ביולוגיות ומוצרים תעשייתיים כגון מוצרי קוסמטיקה.
Introduction
ספינגומיילין (SM) הוא ספינגוליפיד נפוצות בתאים בתרבית. SM היא מסונתז intracellularly1 ומתנת כמבשר sphingolipids אחרים כגון sphingosine-1-פוספט ו- ceramide של, אשר יש תפקיד מכריע החיסון תא סחר ועור מכשול הומאוסטזיס, בהתאמה2, 3. לפיכך, ניתוח מדויק של החומרים SM חשוב שחקרתי את התפקידים פיזיולוגיים ופתולוגיים של sphingolipids.
SM מורכבת של ceramide phosphorylcholine מקושרת קבוצת ceramide, אשר מורכב עוד יותר sphingosine Nהידרוקסי 1-acyl השומן moiety. מגוון את המספרים פחמן, הקשר הכפול הן sphingosine והן N-moiety ליפיד מתבטא המין מספר ceramide (SM). התפתחויות אחרונות LC-ESI-MS/MS איפשר ניתוח כמותי ואיכותי של SM4,5. בספירת הדם, המספר של פחמן ו כפולים של sphingoid LCB של SM זוהה על-ידי הקצאת המוצר ספקטרום יון של LCB. עם זאת, במידע המבני N-acyl השומן moiety לא ישירות הושג כי יונים המוצר המקביל שלו לא דווחו, ולכן N-acyl השומן moieties היו להסיק על ידי ניתוח ההפרש בין יונים קודמן ו יונים של המוצר המתאים LCB שני יונים חיוביים ושליליים מצבי4,5. בדו ח זה, אנו מציגים שיטה לגילוי היונים מוצר של LCB ו- N-moiety ליפיד בו-זמנית במצב MS3 באמצעות פאול משולשת, פאול מלכודת יונים ליניארי ספקטרומטר מסה, המאפשרת את מבני מדויק ספקולציות של כל המינים SM6.
יון דיכוי (או שיפור) ההשפעות שנגרמו על ידי המטריקס בדגימות ביולוגיות ה"בלתי כימות מדויק בניתוח LC-ESI-MS, לכן רצוי לבנות עקומות כיול עבור analytes כל עניין המטריצה זהים המדגם ביולוגי. עם זאת, אסטרטגיה זו הוא לא ריאלי כי זה כמעט בלתי אפשרי להכין את כל המינים SM בדגימות ביולוגיות, במיוחד בניתוח מקיף. לכן מעשית לבנות עקומת כיול ולקבוע טווח כמותית באמצעות זן SM נציג עלה בדגימות ביולוגיות. היינו שני מינים של SM isotopically התווית על-ידי בניית עקומת כיול; אחד שימש תקן פנימי והשני עבור תקן מורכבים. גילינו כמות קטנה של מינים SM isotopically שכותרתו כמו תרכובת רגילה עלה בדגימות ביולוגיות והשיג בהצלחה עקומת כיול ו טווח כמותי6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
להתייעץ עם כל גליונות נתונים גשמי בטיחות (MSDS) לפני השימוש. ללבוש כפפות כדי לצמצם זיהום הדגימה מאת SM נגזר העור. בפרוטוקול הנוכחי היה המוחלים על תאים הלה גדל בינוני חיוני המינימלי של נשר, בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), 2 מ מ L-גלוטמין 1000 פניצילין U/L, סטרפטומיצין 100 מ ג/ליטר.
1. הכנת דוגמאות השומנים
הערה: חשוב כי כל כלי זכוכית כולל מבחנות עם מצופה טפלון מזרקי להיות ללא חומרי ניקוי.
- מיצוי של השומנים הכולל שבר מ תא homogenate באמצעות את בליי & דייר שיטה7
- הסר את התרבות (או ממוזגים) מדיה מן המנה תרביות רקמה ס מ-10 יש לשטוף פעמיים עם 6 מ של PBS קר כקרח.
- להוסיף 1 מ"ל של PBS קר כקרח לתוך המנה ס מ-10 תרביות רקמה באמצעות פיפטה P1000. לקצור את התאים עם תא מגרדים ולאסוף לתוך צינורות פלסטיק siliconized 2.0-mL.
- לאחר צנטריפוגה (1,000 × גרם, 5 דקות, 4 ° C), הסר את תגובת שיקוע על ידי פיפטה P1000.
- להוסיף 1 מ"ל של מתנול. וורטקס צינורות בקצרה, sonicate 200 W עבור 5 דקות ב- sonicator אמבטיה-סוג.
הערה: להתאים את מפלס המים ב- sonicator אמבטיה-סוג כך היא בגדר תא ביעילות הומוגני. - להעביר את homogenate תא ב מתנול באמצעות פיפטה לתוך מבחנות (13 מ"מ x 100 מ"מ) עם מזרקי מצופה טפלון.
- להוסיף 1 מ"ל של מתנול, 1 מ"ל של כלורופורם, 0.8 מ ל מים מזוקקים כפול 50 µL של 10 µmol/L /(D31) d18:1 תקן פנימי-16:0 SM לתוך כל מבחנה.
- מערבולת מבחנות נמרצות במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: בשלב זה, חד-פאזי (כלורופורם/מתנול/מים = 1/2/0.8 (v v v)) נוצר. - להוסיף 1 מ"ל של כלורופורם, 1.0 מ"ל של מים מזוקקים כפול.
- וורטקס צינורות נמרצות-2,500 סל"ד למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: בשלב זה, מימית (עליון) שלב ושלב (נמוך יותר) אורגני מופרדים. - לאחר צנטריפוגה (2,150 גרם ×, 5 דקות, 25 ° C), באיסוף והעברת השלב התחתון לתוך צינורות זכוכית חד פעמיות (ראשוני נמוך יותר).
הערה: לאסוף את השלב התחתון בעזרת פיפטה של פסטר ומסנן פיפטה בטיחות. להכניס את קצה פיפטה השלב התחתון, לסחוט את הנורה קטן ליד השסתום 'E' כדי לספק את השלב העליון והאבסה פנים בפנים קצה פיפטה, ואז לשאוב את שלב תחתון לתוך פיפטה. - להוסיף 2 מ של כלורופורם לתוך צינורות הבדיקה, מערבולת הצינורות נמרצות בכל 2,500 סל"ד למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר מספיק לערבב עם השלב העליון, מוך פנים.
- לאחר צנטריפוגה (2,150 גרם ×, 5 דקות, 25 ° C), באיסוף והעברת השלב התחתון ששונתה לתוך צינורות זכוכית חד פעמיות עם השלב התחתון הראשונית כפי שמתואר בשלב 1.1.10.
- מקם את צינורות זכוכית תחת זרם חנקן, להסיר לחלוטין את ממיסים אורגניים בשלב התחתון שנאספו.
- לשקם את הדגימות עם µL 500 של מתנול או אתנול, filtrate עם מסנן 0.02-מיקרומטר, לאחסן צלוחיות זכוכית ב-20 ° C.
- הכנת הדוגמא עבור בניית עקומת כיול ואימות של השיטה
- להוסיף 50 µL של 0.1, 0.5, 1, 5, 10 או 50 µmol/L של המתחם סטנדרטי (d18:1 /(D9)-18:1 SM) לתוך מבחנות עם מזרקי מצופה טפלון.
- להוסיף תא homogenate לתוך כל מבחנה ולהוסיף מתנול 1 מ"ל.
הערה: כמות תא homogenate כמו מטריצה משתנה על פי ניסוי. אם המין SM בדגימות שמקורם בתאי לצלחת תרבות ס מ-10 מנותחים באופן שגרתי, כמות תא homogenate בתוך כל מבחנה צריך להיות קרוב לזה של תאים בצלחת ס מ-10 תרבות. - לחלץ את השבר השומנים הכולל כפי שמתואר שלבים 1.1.6-1.1.14.
- מכינים בדיקת האיכות דגימות (קיו סי) עבור אימות השיטה כפי descried ב שלבים 1.2.1-1.2.3. להכין שלוש דוגמאות QC עם ריכוזים שונים של המתחם סטנדרטי (d18:1 /(D9)-18:1 SM): אחד בתוך 3 x הגבול התחתון של העקומה סטנדרטי (QC-נמוך, QC-L), אחד ליד המרכז (QC-התיכון, QC-מ'), ואחד ליד הגבול העליון של עיקול רגיל (QC-גבוהה, QC-H).
2. SM ניתוח מאת LC-ESI-MS/MS
- הכנת השלב ניידים
- לערבב את ממיסים (acetonitrile/מתנול/ddH2O = 2/2/1 (v v v) כדי להפוך את פאזה מימית אלכוהול איזופרופיל לשלב אורגני) ב זכוכית בקבוקים עם מצופה טפלון מזרקי ו sonicate עבור 5 דקות ב- sonicator אמבטיה-סוג.
- להוסיף חומצה פורמית (הריכוז הסופי 26.4 mmol/L) ו- NH4הו (14.9 mmol/L) לתוך כל שלב ניידים.
- ניתוח איכותי של מפקד חיל האוויר על ידי LC-ESI-MS3
- להפעיל את מערכת כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) ביצועים גבוהים, להכניס צינורות כניסת מבקבוקי זכוכית המכילים שלבים ניידים, לטהר את הקווים HPLC. לקשר C18 HPLC עמודה (1.5 מ מ ז × 100 מ מ אורך, חלקיקים בגודל 3.0 מיקרומטר) מערכת HPLC, לשמור על הטמפרטורה בתנור עמודה ב 50 מעלות צלזיוס, להתנות את העמודה עם שלב ניידים מימית 100 לדקה µL להכניס ארון מדגם ב autosampl הדגימות . אה.
- להגדיר את הפרמטרים של פאול משולשת, פאול מלכודת יונים ליניארי ספקטרומטר מסה מערכת לניתוח3 MS כמפורט בטבלה 1 בטבלה 2 , כמו גם מבשר הראשון והשני יונים של המין SM עניין.
- לחץ פעמיים על סמל התוכנה עבור רכישת נתונים, לחץ פעמיים על 'תצורת החומרה', בחר 'LC + QTRAP4500 + שסתום' ולאחר לחץ על 'הפעל פרופיל'.
- ליצור תיקיית משנה חדשה על ידי לחיצה על 'חדש תת הפרויקט' 'אישור'.
- לחץ על הכרטיסיה 'קובץ', בחר 'חדשה' ובחר 'רכישה שיטה' ו- 'אישור'. לחץ על הסמל 'ספקטרומטר המסות' ו- 'גברת' בכרטיסיית סוג בחר לסרוק בשם 'MS/MS/MS (MS3)', קצב סריקה Da 10,000/s, קוטביות כמו 'שלילי' ו 'משך' כמו כל הזמן להיות שנותחה (דקות). הגדר את מ/z של 'התחל (Da)' ו- 'הפסק (Da)' הטווח שיסרק. הגדר את מ/z של היונים קודמן הראשון והשני של המטרה SM מינים של ריבית.
הערה: כדי לנתח מספר מינים SM, לסמן "-MS3' סמל, לחץ לחיצה ימנית, בחר 'העתקת את הניסוי הזה', ולאחר מכן הצב את מ/z של היונים קודמן 1 ו-2 של מינים אחרים SM. - בחר את הכרטיסיה 'מתקדם MS', וקבעו לכל פרמטר כדלקמן: במצב סריקה כמו 'פרופיל', שלב בגודל 0.12 (Da), רזולוציה Q1 ו Q3 'יחידה' 'מיטה', בהתאמה, עוצמת סף כזמן ההגדרה 0, כ 50 (ms), הפוגה בין הטווחים המונית כמו 1.5 ms, בחר ' דינמי למלא את הזמן ', Q3 חסם כ 8 V, והזמן עירור כמו 25 ms.
- לחץ על הלחצן 'עריכה ' פרמטרים' בכרטיסיה 'MS', בחר 'המקור/גז' בכרטיסיית להגדיר את הפרמטרים של וילון גז, גז התנגשות, מתח ionspray, טמפרטורה, יון מקור gas1, gas2, כפי שמפורט בטבלה1. לאחר מכן בחר הכרטיסיה 'מתחם' להגדיר את הפרמטרים של declustering פוטנציאל, הפוטנציאל לכניסה, אנרגיית התנגשות, עירור אנרגיה, אנרגיית התנגשות להפיץ כמפורט בטבלה מס ' 2.
- לסמן 'שסתום Valco משולב', בחר 'שם המיקום עבור שלב 0' A ואת הגדר 'B' עמדה על סך time דקות 5.0. גם להגדיר 'A' בתור עמדה על סך time 70.0 דקות.
- האר 'מערכת Shimadzu LC'. בחר בכרטיסיה 'משאבת' והגדר Pumping מצב זרימה בינארי, תזרים סה כ 0.28 mL/min ו מרבי של הלחץ מגבלות כמו 20.0 MPa. בחר בכרטיסיה 'תעשיה', קבע את עוצמת הקול השטיפה כמו 200 µL, מחט במשיחת 52 מ"מ, שטיפה מהירות כמו µL 35/s, דגימה מהירות כמו 5.0 µL/s, לטהר זמן כמו מין 25.0, שטוף מח ש זמן s 5, וכן מצב שטיפה כמו 'לפני ואחרי השאיפה'.
- בנוסף, להפעיל את יחידת קריר יותר, להגדיר את הטמפרטורה יותר מגניב כמו 4 ° C והקו המחט המבחנה שליטה כמו 52 מ מ. עבור לכרטיסייה "תנור", להפעיל את התנור להגדיר טמפרטורה התנור, טמפרטורה מקסימלית 50 ° C ו 85 ° C, בהתאמה.
- בחר בכרטיסיה 'בקר', סמן את התיבה 'הפעל'. בחר בכרטיסיה 'זמן תוכנית' והגדר את מעברי צבע הממס כדלקמן: ממיסים A / B ביחס של 100/0 עבור 5 דקות, תוכנית שינויים ליניארי ל 80-20 מעל 4 דקות, עד 35/65 מעל 50 דק ', ו 25/75 מעל 1 דקות לאחר מכן , להחזיק אותם ב- 25/75 למשך 10 דקות ולאחר מכן באופן ליניארי כדי 100/0 מעל 4 דקות. לאחר מכן לשמור את השיטה.
- צור קובץ אצווה
- לחץ פעמיים על הסמל 'לבנות רכישה אצווה', לחץ על 'הוסף ערכה', 'הוסף דוגמיות', הגדר את המספר של דגימות חדשות ולחץ על 'אישור'.
- לחץ על הלחצן ' עריכת שיטת ', בחר את השיטה כדי לשמש. אם נעשה שימוש בשיטות מרובות בקובץ אצווה אחת, סמן את התיבה 'השתמש מספר שיטות' ובחר את שיטת הרכישה עבור כל דגימה. שנה 'מדגם שם', להגדיר את המספר המתאים לתפקיד בקבוקון' ולאחר את כמות אמצעי הזרקה. לאחר מכן לשמור את קובץ האצווה.
- לקבל את המוצר3 MS יון ספקטרום של המין SM של עניין על-ידי ניתוח3 LC-ESI-MS
- בחר בכרטיסיה 'שלח' בקובץ אצווה, לסמן את הקו של דגימות שינותח ולחץ על הכפתור 'שלח'.
- לחץ ' תצוגה Quene' סמל, הסמל 'Equilibrate', בחר בשיטת הרכישה כדי לשמש, להגדיר זמן 1 דקות, ולחץ על 'אישור'.
- לבטל את 'שמורת נכשיר כוונון' על-ידי לחיצה על הסמל המתאים. ואז לבצע רצף אצווה על-ידי לחיצה על הסמל 'הפעל מדגם'.
- להקצות את כל MS3 המוצר ספקטרום יון של מפקד חיל האוויר על-ידי השוואת המסה לחייב יחס (מ/z) של המוצר יון ספקטרה, המסה המדויקת של sphingoid LCB ו- N-moiety ליפיד מעניין. לקבוע המספר של פחמנים וכפול אג ח ב sphingoid LCB ו- N-moiety ליפיד לפי היונים המוצר המתאים.
- לאשר כי התיקיה המתאימה תת הפרויקט נבחרה, ואז לחץ פעמיים על הסמל 'קובץ נתונים פתוח' ובחר את הדוגמאות כדי להיות מנותח. גרור השיא ב- chromatogram עבור כל מטרה SM מינים ולאחר מכן לחץ פעמיים. שהושג MS3 המוצר יון ספקטרום בתחום הנגררים יוצגו.
- ניתוח כמותי של מפקד חיל האוויר על ידי LC-ESI-MS/MS
- הגדר את שלבי ניידים והעמודה HPLC כפי שמתואר בשלב 2.1 ו- 2.2.1.
- להגדיר את הפרמטרים של פאול משולשת, פאול מלכודת יונים ליניארי ספקטרומטר מסה מערכת התגובה מרובים ניטור (MRM) ניתוח כמפורט בטבלה 1 ו- 2 בטבלה.
- לנהל את ההליכים כפי שמתואר בשלב 2.2.2.1 ו 2.2.2.2.
- לחץ על הכרטיסיה 'קובץ', בחר 'חדשה' ובחר 'רכישה שיטה' ו- 'אישור'. לחץ על הסמל 'ספקטרומטר המסות' ו- 'גברת' בכרטיסיית סוג בחר סרוק 'MRM', קוטביות כמו 'חיובית'. הגדר 'משך' כל הזמן כדי להיות מנותח. הגדר את מ/z של [M + H]+ ו- 184 'Q1 מסה (Da)' ו 'ש3 מסה (Da)' של המטרה SM מינים של עניין, בהתאמה. הגדר 'בזמן' 10 ms ו- 'ID' כשם של המטרה SM מינים.
- בחר את הכרטיסיה 'מתקדם MS', וקבעו לכל פרמטר כדלקמן: שניהם הרזולוציה Q1 Q3 כיחידה' בשבע', עוצמת סף כ- 0, הגדרת זמן כ- 0 (ms) ולאחר הפסקה בין טווחי מסה כ 5 אלפיות השנייה.
- לחץ על הלחצן 'עריכה ' פרמטרים' בכרטיסיה 'MS', בחר את הכרטיסיה ' מקור/גז' לשים את הפרמטר של וילון גז, גז התנגשות, מתח ionspray, טמפרטורה, יון מקור gas1 gas2 כמפורט בטבלה1. לאחר מכן בחר את הכרטיסיה 'מתחם' לשים את הפרמטרים של declustering פוטנציאל, הפוטנציאל לכניסה, אנרגיית התנגשות ו התנגשות פוטנציאלית של יציאה תא כמפורט בטבלה מס ' 2.
- הגדר את השסתום כפי שמתואר בשלב 2.2.2.6.
- להגדיר את התנאי LC כפי שמתואר בשלב 2.2.2.7. לאחר מכן לשמור את השיטה.
- צור קובץ אצווה כמתואר בשלב 2.2.3.
- לקבל את הנתונים MRM של כל מין SM על-ידי ניתוח LC-ESI-MS/MS כפי שמתואר בשלב 2.2.4.
- לעבד את הנתונים MRM באמצעות התוכנה לשילוב נתונים ולקבל את הנתונים של אזור הפסגה יון שחולצו chromatogram של כל מין SM.
- לחץ פעמיים על סמל התוכנה אינטגרציית נתונים בניתוח כמותי, לחץ על הכרטיסיה 'עריכה' ובחר ברירות מחדל של אינטגרציה של המשתמש. הגדרת רוחב חלקה לפי עקומת גאוס כנקודת 1.0 ולחץ על 'אישור'. לחץ על הכרטיסיה 'עריכה' ובחר 'טבלת התוצאות חדש'. בחר את הדגימה כדי להיות משולב, לחץ על לחצן החץ ולחץ על 'הבא'. בחר 'צור שיטה חדשה' להגדיר את שם פעולת השירות, לחץ על 'הבא'. לחץ על 'הבא', סמן את התיבה של d18:1 /(D31)-16:0 SM כמות שהוא, לחץ על 'הבא', לחץ על 'סיום'.
- לחץ על 'מציג את הסקירה שיא' ואשר הפסגות chromatogram מזוהים כראוי. יצוין כי זמן השמירה של d18:1 /(D31)-16:0 SM הוא בדרך כלל קטן יותר על-ידי ~ מין 0.3 לעומת האחד של מפקד חיל האוויר 34-1 (מכיל בדרך כלל d18:1 / 16:0 SM).
- לכמת כל מינים SM על היחס של הפסגה של כל המינים SM d18:1 /(D31)-16:0 תקן פנימי SM.
- לחץ על הכרטיסיה 'קובץ', בחרו 'ייצוא', בחרו 'טבלת התוצאות', לאשר את התבנית כמו 'MultiQuant', עמודות ככל 'לייצא את כל העמודות', שורות כמו 'לייצא את כל השורות למעט אלה מוסתרים באופן מפורש' ולאחר מכן לחץ על 'אישור'.
- פתח את הקובץ המיוצא בתוכנת Excel. לנרמל את האזור של המטרה SM מינים על-ידי האזור של IS (d18:1 /(D31)-16:0 SM). ואז להכפיל לפי כמות IS במדגם מוזרק כדי לחשב את סכום היעד SM המינים במדגם מוזרק תיאורטי.
- בניית עקומת סטנדרטי
- להשיג את הנתונים MRM של d18:1 /(D9)-18:1 SM ו- d18:1 /(D31)-16:0 SM הדגימות עבור בניית העקומה סטנדרטי על ידי ניתוח LC-ESI-MS/MS כפי שמתואר בשלב 2.3.1-2.3.4.
- להשיג את הנתונים של אזור שיא של d18:1 /(D9)-18:1 SM ו- d18:1 /(D31)-16:0 SM כפי שמתואר בשלב 2.3.5.
- לחשב את הסכום של d18:1 /(D9)-18:1 SM במדגם מוזרק כשלב שמתואר 2.3.6.
- לבנות קו המגמה על-ידי הגדרת ה-x ועל ציר ה-y וגם הסכום הנומינלי כמות המחושבת של d18:1 /(D9)-18:1 SM ולקבל את הנוסחה קו מגמה.
- אימות בשיטה כמותית באמצעות תוכנת Excel
- עבור אימות של השיטה, לכמת את כמות d18:1 /(D9)-18:1 SM ו- d18:1 /(D31)-16:0 SM ב- QC דוגמאות על-ידי ניתוח כל QC לטעום לפחות שלוש פעמים ביום 1, וחזור לפחות 3 ימים כפי שמתואר בשלב 2.3.1-2.3.4.
- להשיג את הנתונים באזור שיא ולחשב את כמות d18:1 /(D9)-18:1 SM במדגם מוזרק כשלב שמתואר 2.3.5, 2.3.6.
- על-פי עקומת כיול שהושג, לחשב את הסכום של d18:1 /(D9)-18:1 SM במדגם מוזרק.
- הערכה של דיוק
- לחשב את הממוצע, סטיית התקן של כמות d18:1 /(D9)-18:1 SM שהושג בשלב הנגן 2.5.3-ערכת הנתונים של "אינטרה"-היום ויום הבין-באמצעות תוכנת Excel.
- הממוצע שהתקבל בשלב 2.5.4.1 מחולק על ידי סטיית התקן, המבוטא %.
- הערכה של דיוק
- לחשב את הדיוק של כל הנתונים כדלקמן:
[(מחושב הסכום שהושג בשלב הנגן 2.5.3.) / (סכום נומינלי) - 1] × 100(%) - לחשב את הממוצע של הערך המוחלט של הדיוק על ערכת הנתונים של היום, בין יום.
- לחשב את הדיוק של כל הנתונים כדלקמן:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מסונתז כימית d18:1 / 24:0 SM (איור 1א') ו- d18:1 / 24:0 SM בדגימות השומנים שחולצו מן התאים הלה (איור 1B) נותחו על ידי LC-ESI-MS3 העסקת [M + HCOO]– [M-CH3]- כמו יונים קודמן הראשון והשני, בהתאמה. שים לב האינטנסיביות ספקטרום של demethylated-sphingosylphosphorylcholine (SPC) (מ/z 449) הוא גדול מזה של SM N-moiety ליפיד (מ/z 378). בנוסף, הקשת המתאימה [M-כולין-CH3 (sphingosine-1-פוספט)]– שימושי גם להקצות את LCB של מפקד חיל האוויר. אנחנו גם אישר כי הספקטרום של demethylated-SPC (מ/z 449) מופק בעיקר מן SPC בתנאים של הניתוח שלנו3 MS (איור 1ג) d18:1.
עקומת כיול באמצעות שני-isotopically שכותרתו SM מינים הוצגה איור 2א. המגמה הושג על-ידי החלת 1 / x2כגורם ניפוח. התוצאה של ניתוח שיורית הוצג באיור 2B. שימו לב כי הערך שיורית בקרבת הגבול התחתון של כימות (0.1 pmol במחקר הנוכחי זה) היה קטן יותר על-ידי החלת 1 / x2כגורם ניפוח.
הפרמטרים של עקומת כיול שהושג לבין התוצאה של אימות הוצגו בטבלה3. הערך של הדיוק ואת הדיוק היו בתוך ± 15%, מציג המחקר הנוכחי עמדו בקריטריונים כשיטה כימות משתמש LC-MS8.
הכמות של כל מין SM בתאים הלה הוצגה בטבלה4. הלה התאים גדלו בתוך תרבות המדיה המכילה 10% FBS וקוצרים אותם. d18:1 / 16:0 SM ו- d18:1 / 24:1 SM היו רוב, השני הנפוץ ביותר SM המין אשר היו נחושים, ומבנה מורכב 54% ו-14% של סך SM, בהתאמה
איור 1 . ספקטרה3 MS של אותות ספציפית מ/z של מפקד חיל האוויר בתאים הלה. MS3 ספקטרה d18:1 מסונתז כימית / 24:0 SM (A) ו- d18:1 / 24:0 SM בדגימות השומנים שחולצו מן התאים הלה (B) מוצגים. התוצאות היו ממאמרו של Hama. et al. 6 . שים לב עוצמת ספקטרום SPC הוא גדול מזה של N-acyl השומן moiety של ספקטרה3 SM. MS של d18:1 מסונתז כימית SPC מוצגות באיור (C) על ידי העסקת יונים עם מ' זהה/z ([M + HCOO]-, מ' /z 499) כמו היונים קודמן 1 ו-2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . עקומות כיול של חיל האוויר באמצעות שני מינים של SM שכותרתו isotopically. (א) עקומת כיול באמצעות שני-isotopically שכותרתו SM מינים (d18:1 /(D9)-18:1 SM ו- d18:1 /(D31)-16:0 SM). עקומות כיול נבנו באמצעות הגורם שקלול = 1 / x2. התוצאות של אימות מפורטים בטבלה3. (B) ניתוח שיורית על ההערכה של הטוב של עקומת כיול נבנה. שנשאר משהו בתוך עקומת כיול באמצעות הגורם שקלול = 1 / x2 הוא קטן יותר מאשר אלה באמצעות הגורם שקלול = 1 / x או 1, במיוחד בכמות נמוכה יותר של d18:1 /(D9)-18:1 SM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר מזה איור-
| הגדרות TurboIonSpray | ||||||
| מצב | וילון גז (psi) | התנגשות גז | יון ספריי מתח (V) | טמפרטורה (° C) | יון מקור גז 1 (psi) | יון מקור גז 2 (psi) |
| MS3 | 40 | גבוהה | -4500 | 200 | 40 | 80 |
| MRM | 40 | 10 | 5500 | 300 | 40 | 80 |
טבלה 1. התנאים של ספקטרומטריית electrospray יון מקור המשמש איכותני וניתוח כמותי. טבלה זו היה ממאמרו של Hama. et al. 6
| מצב | קוטביות | קודמן יון (Q1) | יון המוצר או קודמן 2 יון (Q3) | declustering פוטנציאל (V) | הכניסה פוטנציאליים (V) | אנרגיית התנגשות (V) | התנגשות תא יציאה פוטנציאל (V) | אנרגיית התנגשות להפיץ (V) | עירור זמן (אלפיות שניה) | מהירות (Da/שניה) | הזמן (s) | רזולוציה |
| MRM | חיובי | [מ' + H] + | 184 | 1 | 10 | 35 | 12 | - | - | - | 5.364 | יחידה |
| MS3 | שלילי | [מ' + HCOO] - | M-15 | -26 | -10 | -40 | - | 0 | 25 | 10000 | באופן אוטומטי caluculated | יחידה |
בטבלה 2. הפרמטרים של MS3 ומצב MRM פאול משולשת, מלכודת פאול ליניארי מסה ספקטרומטר המשמש לניתוח כמותיים, בהתאמה. טבלה זו היה ממאמרו של Hama. et al. 6
בטבלה 3. הפרמטרים של עקומת כיול שהושג לבין התוצאה של אימות. התוצאות היו ממאמרו של Hama. et al. 6
| מינים מולקולרית של SM | כמות (pmol/מ ג חלבון) |
| d18:1 / 14:0 | 115.5 |
| d16:1 / 16:0 | 115.5 |
| d17:1 / 16:0 | 239.8 |
| d18:2 / 16:0 | 449.9 |
| d18:1 / 16:0 | 3355.1 |
| d18:0 / 16:0 | 203.8 |
| d18:1 / 17:0 | 106.3 |
| d18:2 / 18:0 | 26.5 |
| d20:0 / 16:1 | 94.9 |
| d18:1 / 18:0 | 94.9 |
| d18:2 / 22:0 | 102.3 |
| d18:1 / 22:0 | 235 |
| d18:1 / 23:1 | 83.3 |
| d18:1 / 23:0 | 23.9 |
| d18:1 / 24:2 | 286.5 |
| d18:2 / 24:1 | 286.5 |
| d18:1 / 24:1 | 853.2 |
| d18:1 / 24:0 | 94.6 |
| d18:1 / 25:1 | 12.9 |
בטבלה 4. הכמות של כל מין SM בתאים הלה. הלה התאים גדלו בתוך תרבות המדיה המכילה 10% FBS. תאים נקטפו, סך השומנים שבר שהופק בשיטה בליי & דייר. התוצאות היו ממאמרו של Hama. et al. 6
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בשיטה איכותית נוכח, השגנו MS3 המוצר יונים SPC, N-moiety ליפיד. זה קריטי להקצות כראוי SPC והן N-acyl השומן moiety. לשם כך, יצוין כי מולקולות אחרות המכילות phosphorylcholine ניתן לזהות גם כמו MS3 המוצר יונים. פלסמלוגן-PC ו- Diacyl-phosphatidylcholine (PC) נמצאים בשפע בתרבית של תאים, hydrophobicity שלהם דומה לזה של SM. לכן, diacyl-PC ופלסמלוגן-PC עם איזוטופ (בדרך כלל 13ג) יכול תיאורטית יזוהו בו זמנית עם מפקד חיל האוויר. בניסויים שלנו, היונים מוצר3 MS של פלסמלוגן-PC נצפו בו זמנית בניתוח SM. זה עוזר לבחור כראוי היונים מוצר3 MS של SM לדעת עוצמת ספקטרום SPC הוא גדול מזה של SM N-moiety ליפיד (איור 1A ו- B). לעומת זאת, האינטנסיביות של ליפיד שומני-moiety הוא גדול יותר (או כמעט זהה) של demethylated lysoplasmalogen-PC (נתונים לא מוצג).
בשיטה כמותית הנוכחי שלו, חיוני להכין בדיוק דוגמאות עבור בניית עקומת כיול ואימות של השיטה. בנוסף, הגורם שקלול כראוי ישמש כדי לבנות את עקומת הכיול; זה שימושי לשפר את עקומת מתאים במיוחד-ריכוז נמוך. השווינו את עקומות כיול באמצעות ניפוח שונים גורמים. עקומת התאמה-ריכוז נמוך היה בבירור משופר באמצעות הגורם שקלול = 1 / x2 לעומת זה באמצעות הגורם שקלול = 1 או 1 / x (איור 2B). הערך של הדיוק ואת הדיוק צריך להיות בתוך ± 15%. ריכוז QC-L הינו זהה לגבול התחתון של העקומה סטנדרטי (הגבול התחתון של כימות), זה צריך להיות בתוך 20% ±8.
אנחנו מועסקים השיטה בליי & דייר לחלץ את השבר השומנים הכולל תאים בתרבית במחקר זה. שיטות אחרות לחילוץ השומנים כגון שיטת Folch הם גם שימושי9. חשוב לחלץ את השבר השומנים באמצעות השיטה המתאימה על פי כמות ו/או מאפיינים של הדגימות. מספר מינים SM נותחו בו זמנית ב כל זריקה לא צריכה להיות גדולה מדי על מנת למנוע עומס יתר התוכנה עבור חדרי קירור והקפאה. MRM מתוזמן יהיה שימושי עבור quantitating מספר מינים SM בו זמנית.
השיטה הנוכחית שלנו באמצעות ניתוח3 MS שימושית לשער את מספר פחמן ו כפולים של LCB ו- N-moiety ליפיד של SM ללא התקנים נוספים. עם זאת, אין אפשרות לקבל פרטים מבניים אחרים כגון המיקום של קשרים כפולים, איזומר (cis או טרנס) צורה (ישר או מסועף). זה הכרחי להשתמש באנרגיה גבוהה יותר כדי לקבל מוצר יונים ומידע מבניים שלהם באמצעות מכשירים נוספים10,11,12,13. הנוסחה המולקולרית של היונים המוצר המתאים N-acyl השומן moieties היה [RCO2]– יונים שאינן מכילות חנקן. זה לא ידוע כרגע איך ההתנגשות המושרה דיסוציאציה ההכנסות.
לניתוח3 MS, חשוב להתאים את הפרמטרים של אנרגיית התנגשות (CE) וזמן עירור עבור MS3 פיצול (ExT). CE גבוה יותר לגרום לפיצול עודף ולהפחית את עוצמת יונים מוצר של מפקד חיל האוויר demethylated כמו יונים קודמן 2nd . בנוסף, תבנית פיצול תלויה באופן משמעותי שלוחה לפני הניסויים, רצוי לקבוע את התנאי המתאים של CE ו- ExT זה למקסם את האינטנסיביות של היונים המוצר של demethylated SM, SPC, N-moiety acyl השומן על ידי החדרת SM סינתטי מומס שלבי ניידים.
השתמשנו d18:1 /(D9)-18:1 SM ו- d18:1 /(D31)-16:0 SM כמו שני מינים של SM שכותרתו isotopically לבנות את עקומת כיול. היעילות של יינון יכול להשתנות בהתאם המינים SM ואת המצב של השלב ניידים. לפיכך, אם המספר של SM עניין מוגבל, רצוי להתכונן המין SM שכותרתו isotopically עניין כימות מדויקת יותר.
המבנה SM נקבע עד כה על פי קודמן יונים יונים המוצר המתאים demethylated SPC. יתר על כן, זה היה לפעמים הקשו כדי לקבוע במדויק את הגבול התחתון של כימות המטריצה מדגם נוכחות מאז תרכובות היעד עניין נכחו בשפע המטריצה מדגם.
המחקר הנוכחי היא שימושית להעריך את המספר של פחמן קשרים כפולים LCB, N-moiety ליפיד המבוסס על יונים המוצר המקביל שלהם בניסויים3 MS ללא כלים נוספים. בנוסף, אנו מציגים שיטת ניתוח כמותי ס באמצעות שני יציב isotopically שכותרתו SM מינים, אשר מקלה על קביעת הטווח בשימוש SM כימות. השיטה הנוכחית יהיה מועיל באפיון מגוון מינים ייחודי SM שונים דגימות ביולוגיות, מוצרים תעשיתיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אין ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר של משרד החינוך, תרבות, ספורט, המדע, הטכנולוגיה של יפן (KAKENHI) כדי בעדותה (#15 K 01691), שפורחים (#15 K 08625), K.Y. (#26461532), מענק לצורך המחקר של פרוייקט סורר המחלה של משרד בריאות, העבודה והרווחה (K.Y. #201510032A). אנו מודים קבוצת Edanz (www.edanzediting.com/ac) על עריכת טיוטה של כתב היד הזה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100 mm tissue culture dish | IWAKI | 3020-100 | |
| Cell scraper | IWAKI | 9000-220 | |
| Siliconized 2.0 mL tube | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Test tube | IWAKI | TST SCR 16-100 | |
| Teflon-lined screw cap | IWAKI | 9998CAP415-15 | |
| Disposable glass tube | IWAKI | 9832-1310 | |
| CAPCELL PAK C18 ACR 3 µm 1.5 mm I.D. x 100 mm | Shiseido | 92223 | Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column |
| CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE | Shiseido | 12197 | |
| Cartridge holder | Shiseido | 12415 | |
| Acetonitrile | Wako | 018-19853 | |
| 2-Propanol (Isopropyl Alcohol) | Wako | 161-09163 | |
| Methanol | Wako | 134-14523 | |
| Formic acid | Wako | 066-00466 | |
| 28% Ammonia water | Wako | 016-03146 | |
| Sonicator (bath type) | SHARP | UT-206H | |
| Vortex mixer for glass test tube | TAITEC | Mix-EVR | |
| 1.4 mL glass vial | Tomsic | 500-1982 | Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20°C |
| 8 mm septum | Tomsic | 200-3322 | When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum |
| Screw cap for 1.4 mm glass vial | Tomsic | 500-2762 | |
| Screw cap with slit septum | Shimadzu GLC | GLCTV-803 | |
| PVDF 0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
| Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry | SCIEX | QTRAP4500 | |
| The software for data acquisition and analysis of product ion spectra | SCIEX | Analyst | |
| The software for data integration in quantitative analysis | SCIEX | MultiQuant | |
| HPLC system | Shimadzu | Nexera | |
| Glass bottle | Sansyo | 85-0002 | |
| d18:1/24:0 sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860592P | |
| Sphingosylphosphorylcholine | Merck | 567735 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| L-glutamine | ThermoFisher | 25030081 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Eagle’s minimum essential medium | Sigma | M4655 |
References
- Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. Identification of a family of animal sphingomyelin synthases. EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).
- Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J.
- Kihara, A. Synthesis and degradation pathways, functions, and pathology of ceramides and epidermal acylceramides. Prog Lipid Res. 63, 50-69 (2016).
- Merrill, A. H., Sullards, M. C., Allegood, J. C., Kelly, S., Wang, E. Sphingolipidomics: high-throughput, structure-specific, and quantitative analysis of sphingolipids by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Methods. 36 (2), 207-224 (2005).
- Houjou, T., et al. Rapid and selective identification of molecular species in phosphatidylcholine and sphingomyelin by conditional neutral loss scanning and MS3. Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (24), 3123-3130 (2004).
- Hama, K., Fujiwara, Y., Tabata, H., Takahashi, H., Yokoyama, K. Comprehensive Quantitation Using Two Stable Isotopically Labeled Species and Direct Detection of N-Acyl Moiety of Sphingomyelin. Lipids. , (2017).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Gu, H., Liu, G., Wang, J., Aubry, A. F., Arnold, M. E. Selecting the correct weighting factors for linear and quadratic calibration curves with least-squares regression algorithm in bioanalytical LC-MS/MS assays and impacts of using incorrect weighting factors on curve stability, data quality, and assay performance. Anal Chem. 86 (18), 8959-8966 (2014).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Thomas, M. C., et al. Ozone-induced dissociation: elucidation of double bond position within mass-selected lipid ions. Anal Chem. 80 (1), 303-311 (2008).
- Baba, T., Campbell, J. L., Le Blanc, J. C., Baker, P. R. In-depth sphingomyelin characterization using electron impact excitation of ions from organics and mass spectrometry. J Lipid Res. 57 (5), 858-867 (2016).
- Ryan, E., Nguyen, C. Q. N., Shiea, C., Reid, G. E. Detailed Structural Characterization of Sphingolipids via 193 nm Ultraviolet Photodissociation and Ultra High Resolution Tandem Mass Spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. , (2017).
- Pham, H. T., Ly, T., Trevitt, A. J., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. Differentiation of complex lipid isomers by radical-directed dissociation mass spectrometry. Anal Chem. 84 (17), 7525-7532 (2012).
