Summary
Her presenterer vi en protokoll for å kvantifisere og kvalifisere hver sphingomyelin Art bruker flere reaksjon overvåking og MS-/ MS-/ MS modus, henholdsvis.
Abstract
Vi presenterer en metode til å analysere sphingomyelin (SM) kvalitativt og kvantitativt ved flytende kromatografi-electrospray Ionization-tandem massespektrometri (LC-ESI-MS/MS). SM er en vanlig sphingolipid består av en phosphorylcholine og en ceramide som de hydrofile og hydrofobe komponent henholdsvis. En rekke SM arter finnes i pattedyrceller av i sphingoid lange kjeden base (LCB) og en N-acyl moiety i ceramide. I denne rapporten, viser vi en metode for å beregne antall karbon og dobbel obligasjoner i en LCB og en N-acyl moiety basert på deres tilsvarende produkt ioner i MS/MS/MS (MS3) eksperimenter. I tillegg presenterer vi en kvantitativ analysemetode for SM bruker to stabile isotopically merket SM arter som forenkler bestemme området brukes i SM kvantifisering. Metoden stede vil være nyttig i karakterisere en rekke SM arter i biologiske prøver og industrielle produkter som kosmetikk.
Introduction
Sphingomyelin (SM) er en felles sphingolipid i pattedyrceller. SM er syntetisert intracellulært1 og gave som en forløper til andre sphingolipider som en sphingosine-1-fosfat og en ceramide, som har avgjørende roller i immun celle smugling og huden barriere homeostase, henholdsvis2, 3. Dermed er nøyaktig analyse av SM metabolismen viktig for Klargjørende fysiologiske og patologiske rollene til sphingolipider.
SM består av en ceramide og en phosphorylcholine som er knyttet til gruppen 1-hydroxy ceramide, som ytterligere består av en sphingosine og en N-acyl moiety. En variasjon i karbon og dobbel bond tallene i både sphingosine og N-acyl moiety resulterer i antall ceramide (og SM) arter. Nylige fremskritt innen LC-ESI-MS/MULTIPLE Sclerosis har aktivert kvantitative og kvalitative analyser av SM4,5. I kvalitativ analyse, ble antall karbon og dobbelt bånd en sphingoid LCB av SM identifisert ved å tilordne produktet ion spektra av LCB. Imidlertid strukturinformasjon av N-acyl moiety var ikke direkte fått fordi dens tilsvarende fabrikat ioner ikke er rapportert, og derfor N-acyl moieties ble utledet av differensialanalyse mellom forløper ioner og produktet ioner tilsvarer LCB i både positive og negative ion moduser4,5. I denne rapporten presenterer vi en metode for å oppdage de produkt ionene LCB og N-acyl moiety samtidig i MS3 modus med tre quadrupole og quadrupole lineær ion felle massespektrometri, som muliggjør nøyaktig strukturelle spekulasjon hver SM arter6.
Ion undertrykkelse (eller forbedring) effekten forårsaket av matrix i biologiske prøver hemme nøyaktig kvantifiseringen LC-ESI-MULTIPLE Sclerosis analyse, og derfor er det ønskelig å konstruere kalibrering kurver for alle analytter rundt i identiske matrix av biologiske utvalget. Men er denne strategien ikke mulig fordi det er nesten umulig å forberede alle SM arter i biologiske prøver, spesielt i omfattende analyse. Dermed er det praktisk å konstruere en kalibreringskurven og bestemme kvantitative området som bruker en representant SM Art piggete i de biologiske prøvene. Vi brukte to isotopically-merket SM arter for å konstruere en kalibreringskurven; en ble brukt til en intern standard og den andre for en standard sammensatte. Vi oppdaget litt isotopically-merket SM arter som en standard compound piggete i biologiske prøver og vellykket innhentet en kalibreringskurven og kvantitative utvalg6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Se alle relevante sikkerhetsdatablader (MSDS) før bruk. Bruke hansker for å minimere eksempel forurensning av hud-avledet SM. Nåværende protokollen ble brukt HeLa celler dyrket i Eagle's minimum viktig medium supplert med 10% fosterets bovin serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 1000 U/L penicillin og 100 mg/L streptomycin.
1. forberedelse av Lipid prøver
Merk: Det er viktig at alle glass inkludert reagensglass med Teflon-lined skrulokk være vaskemiddel uten.
- Utvinning av totale lipid brøkdel fra cellen homogenate bruker Bligh & Dyer metode7
- Fjerne kultur (eller betinget) media fra 10 cm vev kultur parabol og skyll to ganger med 6 mL av iskalde PBS.
- Legge til 1 mL av iskalde PBS i 10 cm vev kultur retten ved P1000 pipette. Høste celler med cellen scrapers og samle inn 2.0-mL silikoniserte plast rør.
- Etter sentrifugering (1000 × g, 5 min, 4 ° C), kan du fjerne nedbryting av en P1000 pipette.
- Legg 1 mL av metanol. Vortex rør kort og sonicate på 200 W i 5 minutter i en bad-type sonicator.
NB: Tilpass vannstanden i en bad-type sonicator slik at celle-pellets er effektivt homogenisert. - Overføre celle homogenate i metanol ved Pipetter i test-rør (13 mm x 100 mm) med Teflon-lined skrulokk.
- Legge 1 mL av metanol, 1 mL av kloroform 0,8 mL dobbel destillert vann og 50 µL av 10 µmol/L interne standard d18:1 /(D31)-16:0 SM i hver test-rør.
- Vortex test-rør godt i 5 minutter ved romtemperatur.
Merk: på dette punktet, en enkelt fase (kloroform/metanol/vann = 1/2/0,8 (v/v/v)) er dannet. - Legg 1 mL av kloroform og 1,0 mL dobbel destillert vann.
- Vortex rør kraftig på 2500 rpm i 5 minutter ved romtemperatur.
Merk: på dette punktet, den vandige (øvre) fase og organisk (lavere) fase skilles. - Etter sentrifugering (2150 × g, 5 min, 25 ° C), samle og overføre de lave faser i disponibel BILLEDRØR (lavere startfasen).
Merk: Samle de lave faser med en Pasteur pipette og en pipette tryggere. Stikk Pipetter i de lave faser, presse den lille pæren ved 'E' ventilen å levere øvre fase og interfacial lo inni tuppen av pipette og deretter Hevert de lave faser i pipette. - Legg 2 mL kloroform i reagensglass og vortex rør kraftig på 2500 rpm i 5 minutter ved romtemperatur å tilstrekkelig bland med øvre fase og interfacial lo.
- Etter sentrifugering (2150 × g, 5 min, 25 ° C), samle og overføre de endrede lave faser i disponibel glass rør med lavere startfasen som beskrevet i trinn 1.1.10.
- Plasser glass-rør under en nitrogen strøm og fjerne de organiske løsemidlene i samlet lavere fase.
- Rekonstituer prøvene med 500 µL av metanol eller etanol, Filtrer med filtere 0,02-µm og lagre i hetteglass på 20 ° C.
- Eksempel forberedelse til konstruere kalibreringskurven og validere metoden
- Legge til 50 µL av 0.1, 0.5, 1, 5, 10 eller 50 µmol/L av standard sammensatte (d18:1 /(D9)-18:1 SM) i reagensglass med Teflon-lined skrulokk.
- Legg celle homogenate i hver test-rør og Legg metanol til 1 mL.
Merk: Mengden av cellen homogenate som en matrise varierer etter hvert eksperiment. Hvis SM arter i prøver fra celler i en 10 cm kultur parabol analyseres rutinemessig, bør mengden av celle homogenate i hver reagensrør være nær for celler i en 10 cm kultur parabol. - Pakk ut den totale lipid fraksjon som beskrevet i trinn 1.1.6-1.1.14.
- Forberede kvalitetskontroll (QC) prøver for validering metoden som descried i trinn 1.2.1-1.2.3. Forberede tre QC prøver med ulike konsentrasjoner av standard sammensatte (d18:1 /(D9)-18:1 SM): en innen 3 x nedre grense for standardkurven (QC-lav, QC-L), en nær midten (QC middels, QC-M), og en nær den øvre grensen til den standardkurve (QC-høy, QC-H).
2. SM analyse av LC-ESI--MS-/ MS
- Forberedelse av mobile fasen
- Bland løsemidlene (acetonitrile/metanol/ddH2O = 2/2/1 (v/v/v) for vandige fasen og isopropanol for organisk fase) i glass flasker med Teflon-lined skrulokk og sonicate i 5 minutter i en bad-type sonicator.
- Legge til maursyre (siste konsentrasjon 26,4 mmol/L) og NH4OH (14.9 mmol/L) i hver mobile fase.
- Kvalitativ analyse av SM av LC-ESI-MS3
- Aktivere høy ytelse flytende kromatografi (HPLC) systemet innløp rør inn glassflasker som inneholder mobile phases og tømme HPLC linjene. Koble en C18 HPLC kolonnen (1,5 mm ID × 100 mm lengde, partikkel størrelse 3.0 µm) HPLC systemet, holde temperaturen i kolonnen ovnen ved 50 ° C og tilstand kolonnen med den vandige mobile fasen på 100 µL/min. sette prøvene i et eksempel rack i autosampl eh.
- Angi parameterne for det trippel quadrupole og quadrupole lineær ion felle massespektrometri system for MS3 analyse som vist i tabell 1 og tabell 2 samt første og andre forløperen ioner av SM arter av interesse.
- Dobbeltklikk ikonet programvare for datainnsamling, dobbel falle i staver "Maskinvarekonfigurasjonen", velg "LC + QTRAP4500 + ventilen" og klikk "Aktiver profil".
- Opprette en ny undermappe ved å klikke 'Nye delprosjektet' og 'OK'.
- Klikk kategorien 'fil', velg "New" og velg 'Anskaffelsesmetoden' og 'OK'. Klikk ikonet "Masse Spec" og "MS" tab. velge Scan type som 'MS/MS/MS (MS3)', avsøke rate som 10.000 Da/s, polaritet "Negative" og "Varighet" som hele tiden å være analysert (min). Angi m/z "Start (Da)" og "Stopp (Da)" området som skal skannes. Angi m/z 1. og 2 forløper ioner av målet SM arter av interesse.
Merk: For å analysere flere SM arter, markere den '-MS3' ikon, høyreklikk, velg "Kopier dette eksperimentet" og deretter sette m/z de 1st og 2nd forløper ioner av andre SM arter. - Velg kategorien 'Avansert MS', og angi hver parameter som følger: skannemodus som "Profil", steg størrelse som 0,12 (Da), oppløsning Q1 og Q3 "Enhet" og "Opplyst", henholdsvis intensitet terskelen som 0, innstillingen som 50 (ms), Pause mellom masse områder som 1,5 ms, velg ' dynamisk fylle tid ', Q3 oppføring barriere som 8 V, og eksitasjon tid som 25 ms.
- Klikk "Rediger Parameters" i kategorien 'MS' og velg 'kilde/gass' kategorien sette parametre gardin gass, kollisjon gass, ionspray spenning, temperatur, ion kilde gas1 og gas2 som er oppført i tabell 1. Deretter Velg kategorien 'Sammensatte' angi parametere av declustering potensial, inngangen potensial, kollisjon energi, eksitasjon energi og kollisjon energi spredt som vist i tabell 2.
- Markere "Integrert Valco ventilen" og velg 'Posisjon navn trinn 0' en, og sette 'B' idet posisjon for totalt tid 5.0 min. Også angi 'A' som posisjon for sum tid 70.0 min.
- Merk "Shimadzu LC system". Velg kategorien "Pumpe" og angi Pumping modus som binære flyt, total flow 0,28 mL/min og maks press grensene som 20.0 MPa. Velg kategorien 'Autosampler' og sette skyllingsprosess volumet som 200 µL, p slag som 52 mm, skylling hastighet som 35 µL/s, samplingsfrekvens som 5.0 µL/s, tømme som 25.0 min, skyll dukkert tid som 5 s, og skyll modus som "Før og etter aspirasjon".
- I tillegg aktivere kjøligere enheten, angi kjøligere temperatur som 4 ° C og kontroll hetteglassene nål slag som 52 mm. Velg kategorien 'Ovnen', aktiverer ovnen og sette ovn temperatur og maksimum temperatur som 50 ° C og 85 ° C, henholdsvis.
- Velg kategorien "Kontroller" og sjekk boksen "Power på". Velg kategorien 'Tid Program' og angi løsemiddel graderingene som følger: løsemidler A / B i 100/0 forholdet i 5 min program lineær endringer 80/20 over 4 min, til 35/65 over 50 min, og 25/75 over 1 min. etterpå , holde dem på 25/75 for 10 min, så lineært 100/0 over 4 min. Lagre metoden.
- Opprett satsvis fil
- Dobbeltklikk ikonet "Bygge oppkjøpet satsvis", klikk "Legg til Set", "Legge til Samples", angi hvor mange nye prøver, og klikk "OK".
- Klikk "metoden Editor" og Velg metoden som skal brukes. Hvis flere metoder brukes i en satsvis fil, Merk av 'Bruk flere metoder' og velg kjøp for hvert utvalg. Endre 'Eksempel navn', angir passende for 'Medisinglass posisjon', og sette mengden injeksjon volum. Deretter lagre den satsvise filen.
- Få MS3 produktet ion spektra av SM arter av interesse av LC-ESI-MS3 analyse
- Velg kategorien 'Send' inne bakst arkiv, markere linjen å bli analysert og klikk 'Send'.
- Klikk på '' Vis Quene' ikon, "Likevekt" ikon, Velg anskaffelsesmetoden brukes, angi tiden som 1 min, og klikk "OK".
- Deaktivere 'Reserve Instrument for Tuning' ved å klikke det tilhørende ikonet. Deretter kjøre gruppesekvens ved å velge "Starte Sample".
- Tilordne hver MS3 produkt ion spektra av SM ved å sammenligne masse å lade forholdet (m/z) av produktet ion spectra og nøyaktig masse sphingoid LCB og N-acyl moiety av interesse. Bestemme antall karbonatomer og dobbelt bånd i sphingoid LCB og N-acyl moiety i henhold til de tilsvarende produkt ionene.
- Bekrefte at mappen riktig delprosjektet er valgt, dobbeltklikk på "Åpne datafil"-ikonet, og velg prøvene skal analyseres. Dra toppen i chromatogram for hvert mål SM arter, og dobbeltklikk deretter. Til innhentet MS3 produkt ion spectra innen dratt vises.
- Kvantitativ analyse av SM av LC-ESI--MS-/ MS
- Angi mobile phases og HPLC kolonnen som beskrevet i trinn 2.1 og 2.2.1.
- Angi parameterne for det trippel quadrupole og quadrupole lineær ion felle massespektrometri system for flere reaksjon overvåking (MRM) analyse som er oppført i tabell 1 og tabell 2.
- Utføre fremgangsmåtene som beskrevet i trinn 2.2.2.1 og 2.2.2.2.
- Klikk kategorien 'fil', velg "New" og velg 'Anskaffelsesmetoden' og 'OK'. Klikk ikonet "Masse Spec" og "MS" tab. velge Scan type som "MRM', polaritet"Positive". Angi "Varighet" hele tiden som skal analyseres. Angi m/z [M + h]+ og 184 som 'Q1 masse (Da)' og 'Q3 masse (Da)' målet SM arter av interesse, henholdsvis. Angi 'Time' som 10 ms og 'ID' som navnet på målet SM arter.
- Velg kategorien 'Avansert MS', og angi hver parameter som følger: begge oppløsningen Q1 Q3 som 'Enhet', intensitet terskelen som 0, sette 0 (ms) og Pause mellom masse områder som 5 ms.
- Klikk "Rediger Parameters" i kategorien "MS" og velg kategorien ' Kilde/gass' sette parameteren gardin gass, kollisjon gass, ionspray spenning, temperatur, ion kilde gas1 og gas2 som er oppført i tabell 1. Velg kategorien 'Sammensatte' sette parametrene i declustering potensial, inngangen potensial, kollisjon energi og kollisjon celle Avslutt potensial som er oppført i tabell 2.
- Angi ventilen som beskrevet i trinn 2.2.2.6.
- Angi betingelsen LC som beskrevet i trinn 2.2.2.7. Lagre metoden.
- Opprett satsvis fil som beskrevet i trinn 2.2.3.
- Få MRM data hver SM art av LC-ESI--MS-/ MS analyse som beskrevet i trinn 2.2.4.
- Behandle MRM dataene ved hjelp av programvare for dataintegrasjon og få data fra peak området for de utpakkede ion chromatogram av hver SM art.
- Dobbeltklikk ikonet programvare for dataintegrasjon i kvantitativ analyse, klikk kategorien "Rediger" og velg brukeren integrering standarder. Angi Gaussian glatt bredde som 1,0 punkt, og klikk "OK". Klikk kategorien "Rediger" og velg "Ny resultater tabell". Velg prøve å integreres, klikk en pilknapp, og klikk "Neste". Velg "Opprett ny metode", angi navnet på metoden, og klikk "Next". Klikk "Neste" og Merk av d18:1 /(D31)-16:0 SM er, klikk "Neste", og klikk på 'Fullfør'.
- Klikk 'Viser topp gjennomgang' og Bekreft at de chromatogram toppene blir riktig gjenkjent. Det bør bemerkes at oppbevaringsperioden d18:1 /(D31)-16:0 SM er vanligvis mindre av ~ 0,3 min mot en av 34-1 SM (vanligvis består av d18:1 / 16:0 SM).
- Kvantifisere hver SM arter ifølge forholdet av toppen av hver SM Art til d18:1 /(D31)-16:0 SM interne standard.
- Klikk kategorien 'Fil', velge "Export", velg 'Resultater tabell', bekrefte formatet som 'MultiQuant', som «Eksportere alle kolonner», rader som «Eksportere alle rader unntatt dem som er eksplisitt skjult» og deretter "OK".
- Åpne den eksporterte filen i Excel-programmet. Normalisere området målet SM arter av området er (d18:1 /(D31)-16:0 SM). Deretter multiplisere med teoretisk mengden er i injisert utvalget til å beregne mengden av målet SM arter i injisert utvalget.
- Konstruere standardkurve
- Få MRM data d18:1 /(D9)-18:1 SM og d18:1 /(D31)-16:0 SM i prøvene for å konstruere standardkurven av LC-ESI--MS-/ MS analyse som beskrevet i trinn 2.3.1-2.3.4.
- Hente data av peak d18:1 /(D9)-18:1 SM og d18:1 /(D31)-16:0 SM som beskrevet i trinn 2.3.5.
- Beregne mengden d18:1 /(D9)-18:1 SM i injisert utvalget som beskrevet i trinn 2.3.6.
- Konstruere trendlinjen ved å angi x- og y-aksen som nominelt beløp og beregnet mengden d18:1 /(D9)-18:1 SM og få trendlinje formelen.
- Validere den kvantitative metoden bruker Excel programvare
- For validering av metoden, kvantifisere mengden d18:1 /(D9)-18:1 SM og d18:1 /(D31)-16:0 SM i QC eksempler ved å analysere hver QC prøve minst tre ganger i 1 dag og gjentar minst 3 dager som beskrevet i trinn 2.3.1-2.3.4.
- Hente peak området data og beregne mengden av d18:1 /(D9)-18:1 SM i injisert utvalget som beskrevet i trinn 2.3.5 og 2.3.6.
- Ifølge kalibreringskurven innhentet, beregne mengden d18:1 /(D9)-18:1 SM i injisert utvalget.
- Evaluering av presisjon
- Beregne gjennomsnittet og standardavviket for mengden av d18:1 /(D9)-18:1 SM innhentet i trinn 2.5.3 på hele datasettet for intra-dag og mellom dag bruker Excel programvare.
- Gjennomsnittlig oppnådd i trinn 2.5.4.1 er oppdelt standardavviket, og uttrykt som en prosentandel.
- Evaluering av nøyaktighet
- Beregne nøyaktigheten av hvert som følger:
[(Beregnet beløpet innhentet i trinn 2.5.3.) / (Nominelt beløp) - 1] × 100(%) - Beregne gjennomsnittet av den absolutte verdien av nøyaktigheten på datasettet intradag og mellom dag.
- Beregne nøyaktigheten av hvert som følger:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Syntetisk kjemisk d18:1 / 24:0 SM (figur 1A) og d18:1 / 24:0 SM i lipid eksempler Hentet fra HeLa celler (figur 1B) ble analysert av LC-ESI-MS3 ansette [M + HCOO]- og [M-CH3]- som første og andre forløper ioner, henholdsvis. Spekteret intensiteten av demethylated-sphingosylphosphorylcholine (SPC) (m/z 449) er større enn SM N-acyl moiety (m/z 378). I tillegg spekteret tilsvarer [M-kolin-CH3 (sphingosine-1-fosfat)]- er også nyttig å tilordne LCB av SM. Vi har også bekreftet at spekteret av den demethylated-SPC (m/z 449) er hovedsakelig produsert fra d18:1 SPC under forutsetning av vår MS3 analyse (figur 1C).
Kalibreringskurven ved hjelp av to-isotopically merket SM arter ble vist i figur 2A. Trendlinjen ble oppnådd ved å bruke 1 / x2som vekting faktor. Resultatet av gjenværende analysen ble vist i figur 2B. Merk at restverdien nær lavere grense for kvantifisering (0,1 pmol i denne nåværende studien) var mindre ved å bruke 1 / x2som vekting faktor.
Parameterne for innhentet kalibreringskurven og resultatet av godkjenningen ble vist i tabell 3. Verdien for presisjon og nøyaktighet var innenfor ± 15%, viser at studien møtte kriteriene som kvantifisering bruker LC-MS8.
Hvor mye hver SM Art i HeLa celler ble vist i Tabell 4. HeLa celler ble dyrket i kultur medier som inneholder 10% FBS og høstet. d18:1 / 16:0 SM og d18:1 / 24:1 SM var den mest og nest mest rikelig SM arten som struktur ble bestemt, og består av 54% og 14% av totale SM, henholdsvis
Figur 1 . MS3 spektra av bestemte m/z signaler av SM i HeLa celler. MS3 spectra kjemisk syntetisk d18:1 / 24:0 SM (A) og d18:1 / 24:0 SM i lipid eksempler Hentet fra HeLa celler (B) vises. Resultatene var tilpasset fra Hama et al. 6 Merk at spektrum intensiteten av Preparatomtalen er større enn N-acyl moiety av SM. MS3 spektra av kjemisk syntetisk d18:1 SPC vises i (C) ved å bruke ioner med identiske m/z ([M + HCOO]-, m /z 499) som de 1st og 2nd forløper ionene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Kalibrering kurver av SM bruker to isotopically-merket SM arter. (A) i kalibrering kurve ved hjelp av to-isotopically merket SM arter (d18:1 /(D9)-18:1 SM og d18:1 /(D31)-16:0 SM). Kalibrering kurver ble bygget med vekting faktor = 1 / x2. Resultatene av validering er oppført i tabell 3. (B) gjenværende analyse for vurdering av godhet av en konstruert kalibreringskurven. Resterende i kalibreringskurven ved hjelp av vekting faktoren = 1 / x2 er mindre enn de som bruker vekting faktoren = 1 / x eller 1, spesielt i en lavere mengde d18:1 /(D9)-18:1 SM. Klikk her for å se en større versjon av dette figur.
| TurboIonSpray innstillinger | ||||||
| Modus | Gardin gass (psi) | Kollisjon gass | ion spray spenning (V) | Temperatur (° C) | ion kilde gass 1 (psi) | ion kilde gass 2 (psi) |
| MS3 | 40 | Høy | -4500 | 200 | 40 | 80 |
| MRM | 40 | 10 | 5500 | 300 | 40 | 80 |
Tabell 1. Betingelsene for electrospray ion kilde brukes for både kvalitativ og kvantitativ analyse. Denne tabellen ble tilpasset fra Hama et al. 6
| modus | polaritet | forløperen ion (Q1) | produktet ion eller 2 forløper ion (Q3) | declustering potensial (V) | inngangen potensielle (V) | kollisjon energi (V) | kollisjon celle Avslutt potensial (V) | kollisjon energi spredt (V) | Eksitasjon tid (ms) | Hastighet (Da/sekund) | tid (s) | oppløsning |
| MRM | positiv | [M + H] + | 184 | 1 | 10 | 35 | 12 | - | - | - | 5.364 | Enhet |
| MS3 | negativ | [M + HCOO] - | M-15 | -26 | -10 | -40 | - | 0 | 25 | 10000 | automatisk caluculated | Enhet |
Tabell 2. Parameterne for MS3 og MRM modus i tre quadrupole og quadrupole lineær ion felle masse massespektrometri brukes for kvalitativ og kvantitativ analyse, henholdsvis. Denne tabellen ble tilpasset fra Hama et al. 6
Tabell 3. Parameterne for innhentet kalibreringskurven og resultatet av godkjenningen. Resultatene var tilpasset fra Hama et al. 6
| molekylær arter av SM | beløp (pmol/mg protein) |
| d18:1 / 14:0 | 115.5 |
| d16:1 / 16:0 | 115.5 |
| d17:1 / 16:0 | 239.8 |
| d18:2 / 16:0 | 449.9 |
| d18:1 / 16:0 | 3355.1 |
| d18:0 / 16:0 | 203.8 |
| d18:1 / 17:0 | 106.3 |
| d18:2 / 18:0 | 26,5 |
| D20:0 / 16:1 | 94.9 |
| d18:1 / 18:0 | 94.9 |
| d18:2 / 22:0 | 102.3 |
| d18:1 / 22:0 | 235 |
| d18:1 / 23:1 | 83.3 |
| d18:1 / 23:0 | 23,9 |
| d18:1 / 24:2 | 286.5 |
| d18:2 / 24:1 | 286.5 |
| d18:1 / 24:1 | 853.2 |
| d18:1 / 24:0 | 94.6 |
| d18:1 / 25: 1 | 12,9 |
Tabell 4. Hvor mye hver SM arter i HeLa celler. HeLa celler ble dyrket i kultur medier som inneholder 10% FBS. Cellene ble høstet, og totalt lipid brøkdel ble utvunnet ved Bligh & Dyer metoden. Resultatene var tilpasset fra Hama et al. 6
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den nåværende kvalitative metoden, vi fikk MS3 produkt ioner en SPC og en N-acyl moiety. Det er avgjørende for riktig tilordne både et SPC og en N-acyl moiety. For dette formål, bør det bemerkes at andre phosphorylcholine inneholder molekyler også kan gjenkjennes som MS3 produkt ioner. Diacyl-phosphatidylcholine (PC) og plasmalogen-PC finnes rikelig i pattedyrceller, og deres hydrophobicity er lik som SM. Derfor kan diacyl-PC og plasmalogen-PC med en isotop (vanligvis 13C) teoretisk oppdaget samtidig med SM. I vårt forsøk, ble MS3 produkt ioner av plasmalogen-PC samtidig observert i SM analysen. Det er nyttig å velge riktig MS3 produkt ioner av SM å vite at spektrum intensiteten av Preparatomtalen er større enn SM N-acyl moiety (figur 1A og B). Derimot intensiteten av fet acyl-moiety er større enn (eller nesten det samme som) som demethylated lysoplasmalogen-PC (data ikke vist).
I den nåværende kvantitative metoden er det avgjørende å forberede nettopp prøver konstruere kalibreringskurven og validere metoden. I tillegg bør vekting faktoren brukes riktig å konstruere kalibreringskurven; Det er nyttig å forbedre kurven passer spesielt på en lav konsentrasjon. Vi sammenlignet kalibrering kurver ved hjelp av forskjellige vektleggingsfaktorer. Kurven monteres til lav konsentrasjon var tydelig forbedret ved hjelp av vekting faktoren = 1 / x2 mot det benytter vekting faktoren = 1 eller 1 / x (figur 2B). Verdien for presisjon og nøyaktighet skal innenfor ± 15%. Hvis konsentrasjonen av QC-L er identisk med nedre grense for standardkurven (laveste grense for kvantifisering), bør det være innenfor ± 20%8.
Vi ansatt Bligh & Dyer metoden å pakke den totale lipid fraksjon fra kulturperler celler i denne studien. Andre metoder for lipid utvinning som metoden Folch er også nyttig9. Det er viktig å trekke lipid brøken bruke fremgangsmåten i henhold til beløpet og/eller egenskaper av prøvene. Antall SM arter samtidig analysert i hver injeksjon bør ikke være for stor for å hindre overbelastning programvaren for datainnsamling. Den planlagte MRM vil være nyttig for quantitating en rekke SM arter samtidig.
Vår nåværende metoden MS3 analyse er nyttig å spekulere antall karbon og dobbelt bånd LCB og N-acyl moiety av SM uten tilleggsenheter. Men kan annen strukturinformasjon for eksempel plasseringen av dobbel obligasjoner, isomer (cis eller trans) og form (rett eller forgrenede) ikke hente. Er det nødvendig å bruke høyere energi for å få produktet ioner og deres strukturinformasjon bruker flere instrumenter10,11,12,13. Den molekylære formelen produkt ioner tilsvarer N-acyl moieties ble [RCO2]- ioner som ikke inneholder nitrogen. Det er for øyeblikket ukjent hvordan kollisjonen indusert dissosiasjon inntektene.
MS3 analyse er det viktig å justere parametre kollisjon energi (CE) og eksitasjon tid for MS3 fragmentering (ExT). En høyere CE vil forårsake overflødig fragmentering og redusere intensiteten av produktet ion av demethylated SM som 2nd forløper ion. I tillegg er fragmentering mønsteret betydelig avhengig av ExT. Før eksperimentene, er det ønskelig å bestemme riktig tilstanden CE og ExT som maksimerer intensiteten av produktet ioner demethylated SM, SPC og N-acyl moiety av infusjonen syntetiske SM oppløst i mobile faser.
Vi brukte d18:1 /(D9)-18:1 SM og d18:1 /(D31)-16:0 SM som to isotopically-merket SM arter å konstruere kalibreringskurven. Effektiviteten av ionisering kan variere SM arter og tilstanden til den mobile fasen. Dermed, hvis antall SM rundt er begrenset, er det ønskelig å forberede isotopically-merket SM arten av interesse for mer nøyaktig kvantifisering.
SM strukturen er fastslått hittil forløper ion og produkt ion tilsvarer demethylated SPC. Videre ble det noen ganger hindret å nøyaktig bestemme den laveste grensen for kvantifisering i tilstedeværelse eksempel matrix siden målet forbindelsene rundt var rikelig tilstede i prøve matrix.
Studien er nyttig til å beregne antall karbon og dobbel obligasjoner i en LCB og en N-acyl moiety basert på deres tilsvarende produkt ioner i MS3 eksperimenter uten flere instrumenter. I tillegg presenterer vi en kvantitativ analysemetode for SM bruker to stabile isotopically merket SM arter som forenkler bestemme området brukes i SM kvantifisering. Metoden stede vil være nyttig i karakterisere en rekke unike SM arter i ulike biologiske prøver og industrielle produkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et forskningsstipend fra Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan (KAKENHI) å grunnlegge Vennskapelighetsstiftelsen (#15 K 01691), Y.F. (#15 K 08625), K.Y. (#26461532) og stipend for studier av vanskelige sykdom prosjektet fra departementet for Helse, Arbeiderpartiet og velferd (K.Y. #201510032A). Vi takker gruppen Edanz (www.edanzediting.com/ac) for å redigere et utkast av dette manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100 mm tissue culture dish | IWAKI | 3020-100 | |
| Cell scraper | IWAKI | 9000-220 | |
| Siliconized 2.0 mL tube | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Test tube | IWAKI | TST SCR 16-100 | |
| Teflon-lined screw cap | IWAKI | 9998CAP415-15 | |
| Disposable glass tube | IWAKI | 9832-1310 | |
| CAPCELL PAK C18 ACR 3 µm 1.5 mm I.D. x 100 mm | Shiseido | 92223 | Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column |
| CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE | Shiseido | 12197 | |
| Cartridge holder | Shiseido | 12415 | |
| Acetonitrile | Wako | 018-19853 | |
| 2-Propanol (Isopropyl Alcohol) | Wako | 161-09163 | |
| Methanol | Wako | 134-14523 | |
| Formic acid | Wako | 066-00466 | |
| 28% Ammonia water | Wako | 016-03146 | |
| Sonicator (bath type) | SHARP | UT-206H | |
| Vortex mixer for glass test tube | TAITEC | Mix-EVR | |
| 1.4 mL glass vial | Tomsic | 500-1982 | Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20°C |
| 8 mm septum | Tomsic | 200-3322 | When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum |
| Screw cap for 1.4 mm glass vial | Tomsic | 500-2762 | |
| Screw cap with slit septum | Shimadzu GLC | GLCTV-803 | |
| PVDF 0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
| Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry | SCIEX | QTRAP4500 | |
| The software for data acquisition and analysis of product ion spectra | SCIEX | Analyst | |
| The software for data integration in quantitative analysis | SCIEX | MultiQuant | |
| HPLC system | Shimadzu | Nexera | |
| Glass bottle | Sansyo | 85-0002 | |
| d18:1/24:0 sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860592P | |
| Sphingosylphosphorylcholine | Merck | 567735 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| L-glutamine | ThermoFisher | 25030081 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Eagle’s minimum essential medium | Sigma | M4655 |
References
- Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. Identification of a family of animal sphingomyelin synthases. EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).
- Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J.
- Kihara, A. Synthesis and degradation pathways, functions, and pathology of ceramides and epidermal acylceramides. Prog Lipid Res. 63, 50-69 (2016).
- Merrill, A. H., Sullards, M. C., Allegood, J. C., Kelly, S., Wang, E. Sphingolipidomics: high-throughput, structure-specific, and quantitative analysis of sphingolipids by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Methods. 36 (2), 207-224 (2005).
- Houjou, T., et al. Rapid and selective identification of molecular species in phosphatidylcholine and sphingomyelin by conditional neutral loss scanning and MS3. Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (24), 3123-3130 (2004).
- Hama, K., Fujiwara, Y., Tabata, H., Takahashi, H., Yokoyama, K. Comprehensive Quantitation Using Two Stable Isotopically Labeled Species and Direct Detection of N-Acyl Moiety of Sphingomyelin. Lipids. , (2017).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Gu, H., Liu, G., Wang, J., Aubry, A. F., Arnold, M. E. Selecting the correct weighting factors for linear and quadratic calibration curves with least-squares regression algorithm in bioanalytical LC-MS/MS assays and impacts of using incorrect weighting factors on curve stability, data quality, and assay performance. Anal Chem. 86 (18), 8959-8966 (2014).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Thomas, M. C., et al. Ozone-induced dissociation: elucidation of double bond position within mass-selected lipid ions. Anal Chem. 80 (1), 303-311 (2008).
- Baba, T., Campbell, J. L., Le Blanc, J. C., Baker, P. R. In-depth sphingomyelin characterization using electron impact excitation of ions from organics and mass spectrometry. J Lipid Res. 57 (5), 858-867 (2016).
- Ryan, E., Nguyen, C. Q. N., Shiea, C., Reid, G. E. Detailed Structural Characterization of Sphingolipids via 193 nm Ultraviolet Photodissociation and Ultra High Resolution Tandem Mass Spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. , (2017).
- Pham, H. T., Ly, T., Trevitt, A. J., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. Differentiation of complex lipid isomers by radical-directed dissociation mass spectrometry. Anal Chem. 84 (17), 7525-7532 (2012).
