Summary
هنا، نحن نقدم بروتوكول للتحديد الكمي وتأهيل كل الأنواع سفينجوميلين باستخدام رصد رد فعل متعددة ووضع MS/MS/MS، على التوالي.
Abstract
نحن نقدم طريقة تحليل سفينجوميلين (SM) نوعيا وكمياً عن طريق التأين-جنبا إلى جنب كروماتوغرافيا سائلة-اليكتروسبراي الكتلي (LC-ESI-MS/MS). خ سفينجوليبيد مشتركة تتألف من فوسفوريلتشوليني والسيراميد كعنصر ماء ومسعور، على التوالي. عدد من الأنواع SM موجودة في خلايا الثدييات بسبب مجموعة متنوعة في سفينجويد طويلة السلسلة الأساسية (لكب) و نون-اشيل moiety في السيراميد. في هذا التقرير، نعرض طريقة لتقدير عدد الكربون وسندات مزدوجة في لكب و نون-moiety اشيل استناداً على أيونات المنتج المطابق في تجارب MS/MS/MS (3من مرض التصلب العصبي المتعدد). وبالإضافة إلى ذلك، نقدم أسلوب تحليل الكمي ل SM استخدام اثنين مستقرة نظير المسمى SM الأنواع، مما يسهل تحديد النطاق المستخدمة في كوانتيتيشن ن خ. الأسلوب الحالي سيكون مفيداً في وصف مجموعة متنوعة من أنواع SM في العينات البيولوجية والمنتجات الصناعية مثل مستحضرات التجميل.
Introduction
سفينجوميلين (SM) سفينجوليبيد مشتركة في خلايا الثدييات. SM هو المركب إينتراسيلولارلي1 والحاضر تمهيدا لأخرى سفينجوليبيدس مثل سفينجوسيني-1-فوسفات، والسيراميد، لها أدوار حاسمة في جهاز المناعة الخليوي الاتجار والجلد حاجز التوازن، على التوالي2، 3. وبالتالي، من المهم تحليل دقيق من الأيض SM لتوضيح أدوار سفينجوليبيدس الفسيولوجية والمرضية.
يتكون SM السيراميد وفوسفوريلتشوليني مرتبط بمجموعة السيراميد، وهي كذلك مؤلفة من سفينجوسيني و ن1-هيدروكسي-مجموعة الأسيل. مجموعة متنوعة في أرقام الكربون والرابطة المزدوجة في كل من سفينجوسيني و نون-مجموعة الأسيل ينتج الأنواع عدد السيراميد (و SM). وقد مكن التقدم الذي أحرز مؤخرا في LC-ESI-MS/MS التحليل الكمي والنوعي من خ4،5. في التحليل النوعي، حددت عدد الكربون وسندات مزدوجة من سفينجويد "لكب ن خ" تعيين المنتج أطياف أيون لكب. ومع ذلك، المعلومات الهيكلية من N-اشيل moiety لم يتم مباشرة الحصول عليه لأنه لم يبلغ الأيونات المنتج المطابق، وذلك ن-اشيل مويتيس تم استخلاصه بتحليل تفاضلي بين أيونات السلائف و المنتج أيونات تناظر لكب في4،وسائط أيون إيجابية وسلبية على حد سواء5. وفي هذا التقرير، نقدم وسيلة للكشف عن الأيونات المنتج لكب و نون-اشيل moiety في نفس الوقت في وضع3 مرض التصلب العصبي المتعدد باستخدام الرباعي الثلاثي والرباعي الخطي أيون فخ الكتلي، مما يسهل الهيكلية الدقيقة المضاربة من كل الأنواع خ6.
أيون قمع (أو تعزيز) الآثار الناجمة عن المصفوفة في عينات بيولوجية تعوق القياس الكمي الدقيق في تحليل LC-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد، وذلك، من المستصوب إنشاء منحنيات المعايرة لجميع التحاليل للفائدة في مصفوفة متماثلة العينة البيولوجية. بيد أن هذه الاستراتيجية غير مجدية لأنه يكاد يكون من المستحيل أن تعد جميع الأنواع SM في العينات البيولوجية، لا سيما في تحليل شامل. وبالتالي، فمن العملي لإنشاء منحنى معايرة وتحديد النطاق الكمي باستخدام أنواع ممثل SM ارتفعت في العينات البيولوجية. استخدمنا نوعين من أنواع SM المسمى نظير لإنشاء منحنى معايرة؛ واحد كان يستخدم لمعيار داخلية والآخر لمعيار مركب. أننا نكتشف كمية صغيرة من الأنواع المسماة نظير SM كمجمع قياسية بنجاح الحصول على منحنى معايرة و تتراوح الكمية6وارتفعت في العينات البيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
راجع صحائف بيانات السلامة المادية ذات الصلة (MSDS) قبل الاستخدام. ارتداء قفازات للتقليل من تلوث العينة ب SM المستمدة من الجلد. تم تطبيق هذا البروتوكول على خلايا هيلا نمت في المتوسطة النسر الأساسية الدنيا وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، 2 مم لالجلوتامين و 1,000 U/L البنسلين والستربتوميسين 100 مغ/لتر.
1-إعداد العينات الدهنية
ملاحظة: من المهم أن تكون جميع الأواني الزجاجية بما فيها أنابيب الاختبار مع برغي قبعات مبطنة خالية من المنظفات.
- استخراج جزء مجموع الدهن من هوموجيناتي الخلية باستخدام أسلوب بلاي & داير7
- إزالة الثقافة (أو مكيفة) وسائط الإعلام من طبق استنبات الأنسجة 10 سم والشطف مرتين مع 6 مل من برنامج تلفزيوني المثلج.
- إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني المثلج إلى طبق استنبات الأنسجة 10 سم بواسطة ماصة P1000. حصاد الخلايا مع خلية كاشطات وجمع في أنابيب بلاستيكية siliconized 2.0 مل.
- بعد الطرد المركزي (1,000 ز ×، دقيقة 5، 4 درجة مئوية)، إزالة المادة طافية ماصة P1000.
- أضف 1 مل ميثانول. دوامة الأنابيب بإيجاز و sonicate في 200 ث لمدة 5 دقائق في سونيكاتور حمام من نوع.
ملاحظة: ضبط منسوب المياه في سونيكاتور حمام من نوع حيث كفاءة هو تجانس بيليه الخلية. - نقل هوموجيناتي خلية في الميثانول ماصة في أنابيب الاختبار (13 مم × 100 مم) مع برغي قبعات مبطنة.
- أضف 1 مل ميثانول، 1 مل كلوروفورم و 0.8 مل من الماء المقطر مزدوجة 50 ميليلتر من 10 µmol/L d18:1 القياسية الداخلية/(D31)-16:0 SM في كل أنبوب اختبار.
- دوامة أنابيب الاختبار بشدة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: عند هذه النقطة، مرحلة واحدة (كلوروفورم/الميثانول/الماء = 1/2/0.8 (v/v/v)) يتم تشكيلها. - أضف 1 مل من كلوروفورم و 1.0 مل من الماء المقطر مزدوجة.
- دوامة الأنابيب بقوة في 2,500 لفة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: عند هذه النقطة، مائي مرحلة (العلوي) والعضوية (أقل) يتم فصل. - بعد الطرد المركزي (2,150 ز ×، 5 دقيقة، 25 درجة مئوية)، جمع ونقل في مرحلة انخفاض في أنابيب زجاجية المتاح (المرحلة الأولى أقل).
ملاحظة: جمع في مرحلة انخفاض استخدام ماصة باستور وعامل تصفية ماصة سلامة. إدراج تلميح الماصة في المرحلة الدنيا والضغط لمبة صغيرة بجوار صمام 'ه' لتسليم المرحلة العليا وزغب السطح البيني داخل غيض من الماصة ثم سيفون في المرحلة الدنيا إلى الماصة. - إضافة 2 مل كلوروفورم في أنابيب الاختبار، ودوامه الأنابيب بقوة في 2,500 لفة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لخلط بما فيه الكفاية مع المرحلة العليا وزغب السطح البيني.
- بعد الطرد المركزي (2,150 ز ×، 5 دقيقة، 25 درجة مئوية)، جمع ونقل في مرحلة انخفاض معدلة في أنابيب زجاجية المتاح مع المرحلة الأولى السفلي كما هو موضح في الخطوة 1.1.10.
- وضع أنابيب زجاجية ضمن تيار نيتروجين، وإزالة المذيبات العضوية في المرحلة الدنيا التي تم جمعها.
- إعادة تشكيل العينات مع 500 ميليلتر من الميثانول أو الإيثانول، فيلتراتي مع عامل تصفية 0.02-ميكرومتر، وتخزينها في قنينات زجاجية في-20 درجة مئوية.
- إعداد نموذج لإنشاء منحنى المعايرة والتحقق من صحة الأسلوب
- إضافة 50 ميليلتر من 0.1، 0.5، 1، 5، 10 أو 50 µmol/L من مجمع القياسية (d18:1/(D9)-18:1 خ) في أنابيب الاختبار مع برغي قبعات مبطنة.
- إضافة خلية هوموجيناتي في كل أنبوب اختبار وإضافة الميثانول إلى 1 مل.
ملاحظة: يختلف مقدار هوموجيناتي الخلية كمصفوفة وفقا لكل تجربة. إذا كان يتم بصورة روتينية تحليل الأنواع SM في العينات المستمدة من الخلايا في صحن ثقافة 10 سم، ينبغي أن يكون مقدار هوموجيناتي خلية في كل أنبوبة الاختبار قريب من الخلايا في صحن ثقافة 10 سم. - استخراج الكسر الدهن الكلي كما هو موضح في الخطوات 1.1.6-1.1.14.
- إعداد فحص الجودة (QC) عينات للتحقق من صحة الأسلوب كما اصفا في 1.2.1-1.2.3 الخطوات. تحضير ثلاث عينات مراقبة الجودة بتركيزات مختلفة من مركب القياسية (d18:1/(D9)-18:1 SM): واحدة داخل 3 × الحد السفلي من المنحنى المعياري (مراقبة الجودة المنخفضة، مراقبة الجودة-L)، واحد قرب المركز (الأوسط ومراقبة الجودة، ومراقبة الجودة-م)، وواحد قرب الحدود العليا المنحنى المعياري (مراقبة الجودة عالية، مراقبة الجودة-H).
2-SM تحليل LC-ESI-MS/MS
- التحضير للمرحلة المتنقلة
- مزيج من المذيبات (الاسيتو الانيتريل/الميثانول/ddH2س = 2/2/1 (v/v/v) للمرحلة المائية والايزوبروبانول للمرحلة العضوية) في زجاج زجاجات مع برغي قبعات مبطنة و sonicate لمدة 5 دقائق في سونيكاتور حمام من نوع.
- إضافة حمض الفورميك (التركيز النهائي 26.4 ملمول/لتر) وأوه NH4(14.9 ملمول/لتر) في كل مرحلة المتنقلة.
- التحليل النوعي من SM LC-ESI-MS3
- تنشيط النظام اللوني السائل ([هبلك]) عالية الأداء ووضع أنابيب مدخل في الزجاجات التي تحتوي على مراحل المتنقلة، وتطهير الخطوط [هبلك]. ربط عمود [هبلك]18 ج (معرف 1.5 مم × 100 مم طول، والجسيمات الحجم 3.0 ميكرومتر) إلى النظام [هبلك] والحفاظ على درجة الحرارة في الفرن العمود عند 50 درجة مئوية، وشرط العمود مع المرحلة المتنقلة مائي في 100 ميليلتر/دقيقة وضع العينات في رف عينة في أوتوسامبل أية.
- تعيين معلمات الرباعي الثلاثي والرباعي الخطي أيون فخ الكتلي نظام لتحليل3 مرض التصلب العصبي المتعدد كما هو موضح في الجدول 1 و الجدول 2 ، فضلا عن السلائف الأولى والثانية أيونات الأنواع SM للفائدة.
- انقر نقراً مزدوجاً فوق رمز برنامج للحصول على البيانات، انقر نقراً مزدوجاً فوق '"تكوين الأجهزة"'، حدد 'LC + QTRAP4500 + صمام' وانقر فوق '"تنشيط الشخصية"'.
- قم بإنشاء مجلد فرعي جديد بواسطة النقر فوق 'المشروع الفرعي جديد' و 'موافق'.
- انقر فوق علامة التبويب 'ملف' وحدد 'جديد' وحدد 'اكتساب أسلوب' و 'موافق'. انقر فوق الرمز '"كتلة المواصفات"' و 'MS' علامة التبويب "حدد مسح" نوع ك 'MS/MS/MS (MS3)'، تفحص معدل 10,000 دا/s وقطبية ك 'السلبية' و 'المدة' طوال الوقت أن تم تحليلها (دقيقة). تعيين m/z من 'ابدأ (دا)' و 'إيقاف (دا)' النطاق فحصها. تعيين m/z من الأيونات السلائف 1st و 2nd هدف SM الأنواع ذات الأهمية.
ملاحظة: لتحليل متعددة الأنواع SM، تسليط الضوء على '-MS3' رمز، انقر بالزر الأيمن واختر 'نسخة من هذه التجربة'، وثم وضع m/z من الأيونات السلائف 1st و 2nd SM الأنواع الأخرى. - حدد علامة التبويب 'خيارات متقدمة MS'، وتعيين كل معلمة كما يلي: وضع المسح الضوئي ك 'الشخصية'، خطوة حجم 0.12 (دا)، القرار Q1 و Q3 'وحدة' و 'مضاءة'، على التوالي، عتبة كثافة كوقت الإعداد 0، 50 (مللي ثانية)، وقفه بين النطاقات الشامل ك 1.5 ms، حدد ' ديناميكية ملء الوقت '، Q3 حاجز الدخول ك 8 V، ووقت الإثارة 25 مللي ثانية.
- انقر فوق الزر 'تحرير' "معلمات" في علامة التبويب 'MS' وتحديد 'المصدر/الغاز' علامة التبويب تعيين المعلمات ستارة الغاز والغاز الاصطدام، الجهد إيونسبراي، ودرجة الحرارة، وأيون مصدر gas1 و gas2 كما هو موضح في الجدول 1. ثم حدد علامة التبويب 'مجمع' تعيين المعلمات إمكانات ديكلوستيرينج إمكانات مدخل، الطاقة الاصطدام، والإثارة والطاقة والطاقة الاصطدام انتشرت كما هو موضح في الجدول 2.
- تسليط الضوء على 'صمام فالكو المتكاملة' وحدد '"اسم الموضع"للخطوة 0' ك 'ب' على النحو الموضع لمجموع الوقت دقيقة 5.0. أيضا تعيين 'A' كموقف لمجموع الوقت 70.0 دقيقة.
- تسليط الضوء على 'نظام LC شيمادزو'. حدد علامة التبويب 'مضخة' وتعيين وضع ضخ تدفق ثنائي، والتدفق الإجمالي 0.28 مل/دقيقة، والحد الأقصى لحدود الضغط ك 20.0 الآلام والكروب الذهنية. قم بتحديد علامة التبويب 'أوتوسامبلير' وتعيين وحدة التخزين الشطف ك 200 ميليلتر، إبرة السكتة الدماغية ك 52 مم، الشطف السرعة ك 35 ميليلتر/s، وأخذ عينات من السرعة ك 5.0 ميليلتر/s، تطهير وقت 25.0 دقيقة، شطف الوقت تراجع 5 s، ووضع شطف ك 'قبل وبعد التطلع'.
- وبالإضافة إلى ذلك، تمكن الوحدة من برودة وضبط درجة حرارة برودة تصل إلى 4 درجة مئوية والسكتة الدماغية إبرة قنينة التحكم كما 52 مم. قم بتحديد علامة التبويب 'الفرن'، تمكين الفرن وضبط درجة حرارة الفرن ودرجة الحرارة القصوى ك 50 درجة مئوية و 85 درجة مئوية، على التوالي.
- حدد علامة التبويب 'تحكم'، وحدد المربع الاختيار 'السلطة في'. حدد علامة التبويب '"الوقت برنامج"' وتعيين التدرجات المذيبات كما يلي: المذيبات A/ب بنسبة 100/0 لمدة 5 دقائق، برنامج تعديلات خطية إلى 80/20 ما يزيد على 4 دقيقة، 35/65 أكثر من 50 دقيقة، وإلى 25/75 ما يزيد على 1 دقيقة بعد ذلك ، تعقد لهم في 25/75 لمدة 10 دقائق، ثم خطيا إلى 100/0 ما يزيد على 4 دقيقة. قم بحفظ الأسلوب.
- إنشاء ملف دفعي
- انقر نقراً مزدوجاً فوق الرمز 'بناء' "اقتناء الدفعي"، انقر فوق '"إضافة تعيين"'، 'إضافة عينات'، قم بتعيين عدد عينات جديدة، وانقر فوق 'موافق'.
- انقر فوق الزر 'تحرير الأسلوب' وحدد الأسلوب المراد استخدامه. إذا استخدمت أساليب متعددة في ملف دفعي واحد، حدد المربع 'استخدام أساليب متعددة' وحدد أسلوب الحصول على الأصل لكل عينة. إعادة تسمية '"اسم العينة"' وتعيين العدد المناسب ل '"موقف فيال"' ووضع حجم الحقن. قم بحفظ الملف الدفعي.
- الحصول على المنتج3 مرض التصلب العصبي المتعدد الأطياف أيون الأنواع SM الاهتمام بتحليل3 LC-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد
- حدد علامة التبويب "إرسال" في ملف دفعي، قم بتمييز سطر عينات تحليلها، وانقر فوق الزر 'إرسال'.
- انقر فوق '' "كين عرض" 'رمز، رمز' اكويليبراتي '، حدد أسلوب الحصول على استخدامها وتعيين الوقت ك 1 دقيقة، وانقر فوق' موافق '.
- قم بإلغاء تنشيط '"أداة الاحتياطي"لضبط' عن طريق النقر فوق الرمز المطابق. ثم تنفيذ تسلسل المجموعة بواسطة النقر فوق رمز '"نموذج بدء تشغيل"'.
- تعيين كل مرض التصلب العصبي المتعدد3 أطياف أيون المنتج SM بمقارنة الكتلة تهمة نسبة (m/z) للمنتج الأطياف أيون وكتلة سفينجويد الضبط لكب و نون-مجموعة الأسيل للفائدة. تحديد العدد من الكربونات ومزدوجة السندات في سفينجويد لكب و نون-مجموعة الأسيل وفقا للايونات المنتج المطابق.
- تأكد من تحديد مجلد المشروع الفرعي المناسب، ثم انقر نقراً مزدوجاً فوق الرمز '"فتح ملف البيانات"'، وحدد العينات لتحليلها. اسحب الذروة في chromatogram لكل هدف الأنواع SM وثم انقر نقراً مزدوجاً فوق. وسيقدم حصل على ماجستير3 المنتج أيون الأطياف داخل منطقة المسحوبة.
- التحليل الكمي من SM قبل LC-ESI-MS/MS
- تعيين مراحل المتنقلة والعمود [هبلك] كما هو موضح في الخطوة 2-1 و 2.2.1.
- تعيين معلمات الرباعي الثلاثي والرباعي الخطي أيون فخ النظام الكتلي لرد فعل متعددة الرصد والتحليل (MRM) كما هو موضح في الجدول 1 و الجدول 2.
- القيام الإجراءات كما هو موضح في الخطوة 2.2.2.1 و 2.2.2.2.
- انقر فوق علامة التبويب 'ملف' وحدد 'جديد' وحدد 'اكتساب أسلوب' و 'موافق'. انقر فوق الرمز '"كتلة المواصفات"' و 'MS' علامة التبويب "حدد مسح" نوع ك 'الآلية'، قطبية 'إيجابية'. تعيين 'المدة' طوال الوقت تحليلها. تعيين m/z من [M + H]+ و 184 'الكتلة Q1 (دا)' و 'كتلة Q3 (دا)' الهدف SM الأنواع ذات الاهتمام، على التوالي. تعيين 'الوقت' 10 مللي ثانية و 'ID' كاسم SM الأنواع المستهدفة.
- حدد علامة التبويب 'خيارات متقدمة MS'، وتعيين كل معلمة كما يلي: كل من القرار Q1 و Q3 ك 'وحدة'، عتبة كثافة 0، إعداد الوقت ك 0 (مللي ثانية)، ووقفه بين النطاقات الشامل ك 5 مللي ثانية.
- انقر فوق الزر 'تحرير' "معلمات" في علامة التبويب 'MS' ثم حدد علامة التبويب 'المصدر/غاز' وضع المعلمة ستارة الغاز والغاز الاصطدام، الجهد إيونسبراي، ودرجة الحرارة، وأيون gas1 المصدر و gas2 كما هو موضح في الجدول 1. ثم حدد علامة التبويب 'مجمع' وضع بارامترات ديكلوستيرينج إمكانات وإمكانات مدخل والطاقة الاصطدام والتصادم خلية إمكانات الخروج كما هو موضح في الجدول 2.
- تعيين الصمام كما هو موضح في الخطوة 2.2.2.6.
- تعيين الشرط LC كما هو موضح في الخطوة 2.2.2.7. قم بحفظ الأسلوب.
- قم بإنشاء ملف دفعي كما هو موضح في الخطوة 2.2.3.
- الحصول على البيانات إليه الرصد والإبلاغ لكل نوع من الأنواع SM بتحليل LC-ESI-MS/MS كما هو موضح في الخطوة 2.2.4.
- معالجة البيانات الآلية باستخدام البرمجيات من أجل تكامل البيانات والحصول على بيانات منطقة الذروة ل chromatogram أيون المستخرجة من كل الأنواع SM.
- انقر نقراً مزدوجاً فوق رمز برنامج لدمج البيانات في التحليل الكمي، وانقر فوق علامة التبويب 'تحرير' وحدد "المستخدم التكامل الافتراضيات". تعيين "العرض السلس الضبابي" كنقطة 1.0، وانقر فوق 'موافق'. انقر فوق علامة التبويب 'تحرير' وتحديد '"جدول نتائج جديدة"'. حدد عينة لدمج، وانقر فوق زر سهم، وانقر فوق 'التالي'. حدد '"إنشاء أسلوب جديد"' وتعيين اسم الأسلوب وانقر فوق 'التالي'. انقر فوق 'التالي' وحدد مربع d18:1/(D31)-16:0 SM كما هي، انقر فوق 'التالي' وانقر فوق 'إنهاء'.
- انقر فوق 'عرض استعراض الذروة' وتأكيد أن قمم chromatogram يتم التعرف عليها على نحو ملائم. تجدر أن الوقت الاحتفاظ d18:1/(D31)-16: SM يكون عادة أصغر من 0 ~ مين 0.3 مقارنة بواحدة SM 34-1 (وعادة ما تتألف من d18:1/16:0 SM).
- تحديد كمية كل نوع من الأنواع SM وفقا للنسبة الذروة من كل الأنواع SM d18:1/(D31)-16:0 SM الداخلية القياسية.
- انقر فوق علامة التبويب 'ملف'، حدد 'تصدير'، حدد '"نتائج الجدول"'، وتأكيد التنسيق كأعمدة كما 'تصدير كافة الأعمدة' 'مولتيكوانت'، الصفوف 'تصدير كافة الصفوف باستثناء تلك صراحة المخفية'، ومن ثم انقر فوق 'موافق'.
- قم بفتح الملف الذي تم تصديره في برنامج Excel. تطبيع المنطقة المستهدفة الأنواع SM مجال هو (d18:1/(D31)-16:0 SM). ثم ضرب بمقدار النظري هو في العينة حقن حساب كمية الأنواع SM في حقن العينة المستهدفة.
- إنشاء المنحنى المعياري
- الحصول على البيانات الآلية من d18:1/(D9)-18:1 SM و d18:1/(D31)-16:0 SM في عينات لإنشاء المنحنى المعياري بتحليل LC-ESI-MS/MS كما هو موضح في الخطوة 2.3.1-2.3.4.
- الحصول على بيانات منطقة ذروة d18:1/(D9)-18:1 SM و d18:1/(D31)-16:0 SM كما هو موضح في الخطوة 2.3.5.
- حساب كمية d18:1/(D9)-18:1 SM في حقن العينة كما هو موضح في الخطوة 2.3.6.
- تشييد خط الاتجاه بإعداد على المحور السيني والصادي كمبلغ رمزي والمبلغ المحسوب من d18:1/(D9)-18:1 SM والحصول على الصيغة خط الاتجاه.
- التحقق من صحة الأسلوب الكمي باستخدام برنامج Excel
- للتحقق من صحة الأسلوب، تحديد مقدار d18:1/(D9)-18:1 SM و d18:1/(D31)-16:0 عينات SM في مراقبة الجودة من خلال تحليل كل QC العينة على الأقل ثلاث مرات في يوم واحد، وكرر 3 أيام على الأقل كما هو موضح في الخطوة 2.3.1-2.3.4.
- الحصول على بيانات منطقة الذروة وحساب كمية d18:1/(D9)-18:1 SM في حقن العينة كما هو موضح في الخطوة 2.3.5 و 2.3.6.
- ووفقا لمنحنى المعايرة التي تم الحصول عليها، حساب كمية d18:1/(D9)-18:1 SM في حقن العينة.
- تقييم الدقة
- حساب المتوسط والانحراف المعياري لمبلغ d18:1/(D9)-18:1 SM التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.5.3 في dataset من داخلها-اليوم واليوم بين الوكالات باستخدام برنامج Excel.
- المتوسط التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.5.4.1 مقسوماً على الانحراف المعياري، وعبر عن كنسبة مئوية.
- تقييم الدقة
- حساب دقة كل البيانات على النحو التالي:
[(المبلغ المحسوب التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.5.3.) /(مبلغ رمزي)-1] × 100(%) - حساب متوسط القيمة المطلقة للدقة في dataset اليوم داخل وبين اليوم.
- حساب دقة كل البيانات على النحو التالي:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تصنيعه كيميائيا d18:1/SM (الشكل 1أ) 24:0 و d18:1/24:0 SM في عينات الدهون المستخرجة من خلايا هيلا (الشكل 1ب) تم تحليلها بواسطة LC-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد توظيف3 [م + هكوو]– و [م-CH3]- أيونات السلائف الأولى والثانية، على التوالي. لاحظ أن كثافة الطيف ديميثيلاتيد-سفينجوسيلفوسفوريلتشوليني (SPC) (m/z 449) أكبر من أن ن خ ن-مجموعة الأسيل (m/z 378). وبالإضافة إلى ذلك الطيف يناظر [م-الكولين-CH3 (سفينجوسيني-1-فوسفات) [– مفيد أيضا لتعيين لكب SM. كما أكدنا أن طيف باولو ديميثيلاتيد (m/z 449) ينتج أساسا من d18:1 توافق آراء ساو باولو بشرط تحليلنا3 مللي ثانية (الشكل 1ج).
وأبدى منحنى المعايرة استخدام اثنين نظير المسمى SM الأنواع في الشكل 2أ. خط الاتجاه تم الحصول عليها بتطبيق (1) ×2كعامل الترجيح. نتيجة لتحليل بقايا كان هو مبين في الشكل 2ب. لاحظ أن القيمة المتبقية قريبة من الحد الأدنى من كوانتيتيشن (0.1 بمول في هذه الدراسة الحالية) كان أصغر عن طريق تطبيق 1/x2كعامل الترجيح.
المعلمات من منحنى المعايرة التي تم الحصول عليها، ونتيجة للتحقق من صحة مبين في الجدول 3. وكانت قيمة الدقة ودقة داخل ± 15%، تبين أن الدراسة الحالية تفي بالمعايير كطريقة كوانتيتيشن باستخدام LC-MS8.
وأبدى كمية كل نوع من الأنواع SM في خلايا هيلا في الجدول 4. كانت تزرع خلايا هيلا في ثقافة وسائل الإعلام التي تحتوي على 10% FBS وحصادها. d18:1/16:0 SM و d18:1/24:1 SM كانت معظم والثانية الأكثر وفرة الأنواع SM الهيكل التي حددت، ويتألف من 54% و 14% من مجموع SM، على التوالي
الشكل 1 . مرض التصلب العصبي المتعدد الأطياف3 إشارات محددة m/z من SM في خلايا هيلا. أطياف3 مللي d18:1 مركباً كيميائيا/24:0 SM (A) و d18:1/24:0 SM في عينات الدهون المستخرجة من خلايا هيلا (ب) ترد. وكانت النتائج مقتبسة من حماة et al. 6 لاحظ أن كثافة الطيف توافق آراء ساو باولو أكبر من N-moiety اشيل الدمتوسط مرض التصلب العصبي المتعدد الأطياف3 من d18:1 مركباً كيميائيا توافق آراء ساو باولو وترد في (ج) باستخدام الأيونات مع مطابقة m/z ([م + هكوو]-، م /z 499) كالأيونات السلائف 1st و 2nd. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . منحنيات المعايرة من استخدام نوعين من أنواع SM المسمى نظير SM. (A) منحنى المعايرة باستخدام المسمى اثنين نظير الأنواع SM (d18:1/(D9)-18:1 SM و d18:1/(D31)-16:0 SM). وشيدت منحنيات المعايرة باستخدام عامل الترجيح = 1/x2. وترد في الجدول 3نتائج التحقق من الصحة. (ب) تحليل المتبقية للتقييم للخير من منحنى المعايرة المشيدة. البواقي في منحنى المعايرة باستخدام عامل الترجيح = 1/x2 أصغر من تلك باستخدام عامل الترجيح = 1/x أو 1، لا سيما في كمية أقل من d18:1/(D9)-18:1 الدمتوسط الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الشكل.
| إعدادات توربويونسبراي | ||||||
| وضع | ستارة الغاز (psi) | الغاز الاصطدام | أيون رذاذ الجهد (V) | درجة الحرارة (درجة مئوية) | أيون مصدر الغاز 1 (psi) | أيون مصدر الغاز 2 (psi) |
| مرض التصلب العصبي المتعدد3 | 40 | عالية | -4500 | 200 | 40 | 80 |
| إليه الرصد والإبلاغ | 40 | 10 | 5500 | 300 | 40 | 80 |
الجدول 1. شروط مصدر أيون اليكتروسبراي المستخدمة لتحليل كمي ونوعي- وكان هذا الجدول مقتبس من حماة et al. 6
| وضع | قطبية | السلائف أيون (Q1) | أيون المنتج أو 2nd السلائف أيون (Q3) | إمكانات ديكلوستيرينج (V) | مدخل المحتملة (V) | الطاقة الاصطدام (V) | الاصطدام إمكانات خروج الخلية (V) | انتشار الطاقة الاصطدام (V) | وقت الإثارة (مللي ثانية) | السرعة (دا/sec) | الوقت (s) | قرار |
| إليه الرصد والإبلاغ | إيجابية | [M + H] + | 184 | 1 | 10 | 35 | 12 | - | - | - | 5.364 | وحدة |
| مرض التصلب العصبي المتعدد3 | السلبية | [م + هكوو] - | M-15 | -26 | -10 | -40 | - | 0 | 25 | 10000 | كالوكولاتيد تلقائياً | وحدة |
الجدول 2. المعلمات من مرض التصلب العصبي المتعدد3 ووضع إليه الرصد والإبلاغ في الرباعي الثلاثي والرباعي الخطي أيون فخ الكتلة قياس الطيف الكتلي المستخدمة للتحليل الكمي والنوعي، على التوالي. وكان هذا الجدول مقتبس من حماة et al. 6
الجدول 3. المعلمات من منحنى المعايرة التي تم الحصول عليها، ونتيجة للتحقق من الصحة- وكانت النتائج مقتبسة من حماة et al. 6
| الأنواع الجزيئية من SM | المبلغ (بروتين pmol/mg) |
| d18:1/14:0 | 115.5 |
| d16:1/16:0 | 115.5 |
| d17:1/16:0 | 239.8 |
| d18:2/16:0 | 449.9 |
| d18:1/16:0 | 3355.1 |
| d18:0/16:0 | 203.8 |
| d18:1/17:0 | 106.3 |
| d18:2/18:0 | 26.5 |
| d20:0/16:1 | 94.9 |
| d18:1/18:0 | 94.9 |
| d18:2/22:0 | 102.3 |
| d18:1/22:0 | 235 |
| d18:1/23:1 | 83.3 |
| d18:1/23:0 | 23.9 |
| d18:1/24:2 | 286.5 |
| d18:2/24:1 | 286.5 |
| d18:1/24:1 | 853.2 |
| d18:1/24:0 | 94.6 |
| d18:1/25: 1 | 12.9 |
الجدول 4. مقدار كل نوع من الأنواع SM في خلايا هيلا. كانت تزرع خلايا هيلا في ثقافة وسائل الإعلام التي تحتوي على 10% FBS. كانت تحصد الخلايا، وتم استخراج جزء ضئيل من إجمالي الدهون بطريقة بلاي & داير. وكانت النتائج مقتبسة من حماة et al. 6
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا الأسلوب النوعي، حصلنا على مرض التصلب العصبي المتعدد3 أيونات المنتج توافق آراء ساو باولو و نون-مجموعة الأسيل. من الأهمية بمكان لتعيين بشكل صحيح توافق آراء ساو باولو و نون-مجموعة الأسيل. وتحقيقا لهذه الغاية، تجدر الإشارة إلى أن يمكن أيضا الكشف عن الجزيئات الأخرى التي تحتوي على فوسفوريلتشوليني أيونات المنتج3 مللي ثانية. دياسيل-فوسفاتيديلتشوليني (PC) وأجهزة الكمبيوتر بلاسمالوجين موجودة تماما في خلايا الثدييات، وعلى hydrophobicity مماثلة لتلك التي SM. ولذلك، دياسيل-كمبيوتر وكمبيوتر بلاسمالوجين بنظائر (عادة 13ج) يمكن نظرياً كشف في وقت واحد مع SM. في تجاربنا، لوحظت الأيونات المنتج3 مللي ثانية من بلاسمالوجين--جهاز كمبيوتر في نفس الوقت في تحليل SM. أنها مفيدة لتحديد بشكل صحيح الأيونات المنتج3 مللي ثانية من SM أن نعرف أن كثافة الطيف توافق آراء ساو باولو أكبر من أن ن خ ن-مجموعة الأسيل (الشكل 1أ وب). على النقيض من ذلك، أكبر من كثافة moiety اشيل الدهنية (أو تقريبا نفس) التي ديميثيلاتيد ليسوبلاسمالوجين--جهاز الكمبيوتر (البيانات لا تظهر).
في هذا الأسلوب الكمي، من الضروري التحديد إعداد العينات لإنشاء منحنى المعايرة والتحقق من الأسلوب. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تستخدم عامل الترجيح بشكل صحيح لإنشاء منحنى المعايرة؛ ومفيد لتحسين منحنى المناسب خاصة بتركيز منخفض. نحن مقارنة منحنيات المعايرة باستخدام عوامل الترجيح المختلفة. المنحنى المناسب في التركيزات المنخفضة قد تحسن واضح باستخدام معامل الترجيح = 1/x2 مقارنة بذلك باستخدام عامل الترجيح = 1 أو 1/x (الشكل 2ب). ينبغي أن تكون القيمة الضبط والدقة داخل ± 15%. إذا كان تركيز QC-L متطابقة إلى حد أدنى من المنحنى المعياري (الحد الأدنى من كوانتيتيشن)، فإنه ينبغي أن يكون داخل ± 20%8.
استخدمنا الأسلوب بلاي & داير لاستخراج الكسر مجموع الدهن من الخلايا المستزرعة في هذه الدراسة. طرق أخرى لاستخراج الدهن مثل طريقة فولتش هي أيضا مفيدة9. من المهم لاستخراج الدهن الكسر باستخدام الأسلوب المناسب وفقا لكمية و/أو خصائص العينات. لا ينبغي أن تكون عدد الأنواع SM تحليلها في وقت واحد في كل حقن كبيرة جداً للحيلولة دون الإفراط في تحميل البرنامج للحصول على البيانات. هذه الآلية المقررة ستكون مفيدة كوانتيتاتينج عدد من الأنواع SM في وقت واحد.
أسلوبنا الحالي باستخدام MS3 تحليل مفيد للتكهن بعدد الكربون وسندات مزدوجة من لكب و نون-مجموعة الأسيل من SM دون أجهزة إضافية. ومع ذلك، لا يمكن الحصول على معلومات أخرى هيكلية مثل الموقع سندات مزدوجة، ايزومير (رابطة الدول المستقلة أو عبر) والشكل (مستقيمة أو متفرعة). من الضروري استخدام الطاقة أعلى للحصول على أيونات المنتج والمعلومات الهيكلية الخاصة بهم باستخدام أدوات إضافية10،11،،من1213. الصيغة الجزيئية من الأيونات المنتج يناظر N-مويتيس اشيل كان [الأرامل2] أيونات– التي لا تحتوي على النيتروجين. كيف الاصطدام الناجم عن تفكك العائدات غير معروف حاليا.
لتحليل3 مللي ثانية، من المهم لضبط معايير الطاقة الاصطدام (CE) ووقت الإثارة لمرض التصلب العصبي المتعدد3 تجزئة (تحويله). م أعلى سوف يسبب تجزئة الزائد والحد من كثافة أيون المنتج من demethylated SM كأيون السلائف 2nd . وبالإضافة إلى ذلك، نمط تجزئة تعتمد إلى حد كبير على تحويله قبل التجارب، من المستصوب تحديد الشرط المناسب CE وتحويله إلى أقصى حد كثافة الأيونات المنتج SM demethylated وتوافق آراء ساو باولو، و نون-حله اشيل moiety عن طريق غرس SM الاصطناعية في مراحل المتنقلة.
وكنا d18:1/(D9)-18:1 SM و d18:1/(D31)-16:0 SM كنوعين من أنواع SM المسمى نظير لإنشاء منحنى المعايرة. يمكن أن تختلف كفاءة التأين وفقا للأنواع SM وظروف المرحلة المتنقلة. وهكذا، وإذا كان العدد SM للفائدة المحدودة، من المستصوب إعداد الأنواع SM المسمى نظير الاهتمام كوانتيتيشن أكثر دقة.
وقد تحدد هيكل SM حتى الآن وفقا لايون السلائف وأيون المنتج المطابق لتوافق آراء ساو باولو ديميثيلاتيد. وعلاوة على ذلك، فإنه كان يعرقل أحياناً لدقة تحديد الحد الأدنى من كوانتيتيشن في وجود نموذج المصفوفة منذ المركبات المستهدفة للفائدة كانت موجودة تماما في مصفوفة عينة.
هذه الدراسة مفيدة لتقدير العدد من الكربون وسندات مزدوجة في لكب و نون-moiety اشيل استناداً على أيونات المنتج المطابق في مرض التصلب العصبي المتعدد3 تجارب دون صكوك إضافية. وبالإضافة إلى ذلك، نقدم أسلوب تحليل الكمي ل SM استخدام اثنين مستقرة نظير المسمى SM الأنواع، مما يسهل تحديد النطاق المستخدمة في كوانتيتيشن ن خ. الأسلوب الحالي سيكون مفيداً في وصف مجموعة متنوعة من أنواع SM فريدة في العينات البيولوجية والمنتجات الصناعية المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن أي تعارض في المصالح.
Acknowledgments
كان يؤيد هذا العمل بمنحه بحثية من وزارة التعليم، الثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا من اليابان (كاكينهي) إلى ك. أ. (#15 ك 01691)، المجلس (#15 ك 08625)، (#26461532)، والحصول على منحة لدراسة "مشروع الأمراض المستعصية" من وزارة الصحة والعمل والرعاية الاجتماعية (#201510032A). ونحن نشكر مجموعة ادانز (www.edanzediting.com/ac) لتحرير مسودة لهذه المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100 mm tissue culture dish | IWAKI | 3020-100 | |
| Cell scraper | IWAKI | 9000-220 | |
| Siliconized 2.0 mL tube | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Test tube | IWAKI | TST SCR 16-100 | |
| Teflon-lined screw cap | IWAKI | 9998CAP415-15 | |
| Disposable glass tube | IWAKI | 9832-1310 | |
| CAPCELL PAK C18 ACR 3 µm 1.5 mm I.D. x 100 mm | Shiseido | 92223 | Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column |
| CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE | Shiseido | 12197 | |
| Cartridge holder | Shiseido | 12415 | |
| Acetonitrile | Wako | 018-19853 | |
| 2-Propanol (Isopropyl Alcohol) | Wako | 161-09163 | |
| Methanol | Wako | 134-14523 | |
| Formic acid | Wako | 066-00466 | |
| 28% Ammonia water | Wako | 016-03146 | |
| Sonicator (bath type) | SHARP | UT-206H | |
| Vortex mixer for glass test tube | TAITEC | Mix-EVR | |
| 1.4 mL glass vial | Tomsic | 500-1982 | Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20°C |
| 8 mm septum | Tomsic | 200-3322 | When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum |
| Screw cap for 1.4 mm glass vial | Tomsic | 500-2762 | |
| Screw cap with slit septum | Shimadzu GLC | GLCTV-803 | |
| PVDF 0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
| Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry | SCIEX | QTRAP4500 | |
| The software for data acquisition and analysis of product ion spectra | SCIEX | Analyst | |
| The software for data integration in quantitative analysis | SCIEX | MultiQuant | |
| HPLC system | Shimadzu | Nexera | |
| Glass bottle | Sansyo | 85-0002 | |
| d18:1/24:0 sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860592P | |
| Sphingosylphosphorylcholine | Merck | 567735 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| L-glutamine | ThermoFisher | 25030081 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Eagle’s minimum essential medium | Sigma | M4655 |
References
- Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. Identification of a family of animal sphingomyelin synthases. EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).
- Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J.
- Kihara, A. Synthesis and degradation pathways, functions, and pathology of ceramides and epidermal acylceramides. Prog Lipid Res. 63, 50-69 (2016).
- Merrill, A. H., Sullards, M. C., Allegood, J. C., Kelly, S., Wang, E. Sphingolipidomics: high-throughput, structure-specific, and quantitative analysis of sphingolipids by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Methods. 36 (2), 207-224 (2005).
- Houjou, T., et al. Rapid and selective identification of molecular species in phosphatidylcholine and sphingomyelin by conditional neutral loss scanning and MS3. Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (24), 3123-3130 (2004).
- Hama, K., Fujiwara, Y., Tabata, H., Takahashi, H., Yokoyama, K. Comprehensive Quantitation Using Two Stable Isotopically Labeled Species and Direct Detection of N-Acyl Moiety of Sphingomyelin. Lipids. , (2017).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Gu, H., Liu, G., Wang, J., Aubry, A. F., Arnold, M. E. Selecting the correct weighting factors for linear and quadratic calibration curves with least-squares regression algorithm in bioanalytical LC-MS/MS assays and impacts of using incorrect weighting factors on curve stability, data quality, and assay performance. Anal Chem. 86 (18), 8959-8966 (2014).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Thomas, M. C., et al. Ozone-induced dissociation: elucidation of double bond position within mass-selected lipid ions. Anal Chem. 80 (1), 303-311 (2008).
- Baba, T., Campbell, J. L., Le Blanc, J. C., Baker, P. R. In-depth sphingomyelin characterization using electron impact excitation of ions from organics and mass spectrometry. J Lipid Res. 57 (5), 858-867 (2016).
- Ryan, E., Nguyen, C. Q. N., Shiea, C., Reid, G. E. Detailed Structural Characterization of Sphingolipids via 193 nm Ultraviolet Photodissociation and Ultra High Resolution Tandem Mass Spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. , (2017).
- Pham, H. T., Ly, T., Trevitt, A. J., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. Differentiation of complex lipid isomers by radical-directed dissociation mass spectrometry. Anal Chem. 84 (17), 7525-7532 (2012).
