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Biochemistry

नियंत्रण रेखा से Sphingomyelin के लिए मात्रात्मक और गुणात्मक विधि-MS दो स्थिर Isotopically लेबल Sphingomyelin प्रजातियों का उपयोग

Published: May 7, 2018 doi: 10.3791/57293
Automatic Translation
1, 1, 1
1Faculty of Pharmaceutical Sciences, Teikyo University

Summary

यहां, हम एक प्रोटोकॉल को यों तो क्रमशः और कई प्रतिक्रिया निगरानी और एमएस/ms/ms मोड, का उपयोग कर प्रत्येक sphingomyelin प्रजातियों के योग्य वर्तमान ।

Abstract

हम sphingomyelin (SM) गुणात्मक और मात्रात्मक द्वारा तरल क्रोमैटोग्राफी-electrospray Ionization-मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-ईएसआई-ms/ms) का विश्लेषण करने की एक विधि प्रस्तुत करते हैं । SM एक phosphorylcholine और हाइड्रोफिलिक और hydrophobic घटक के रूप में एक ceramide से बना एक आम sphingolipid है, क्रमशः । sphingoid लांग चेन बेस (LCB) और moiety में एक N-acyl ceramide में कई प्रकार के कारण स्तनधारी कोशिकाओं में एसएम प्रजातियों के एक नंबर मौजूद हैं । इस रिपोर्ट में, हम एक LCB में कार्बन और दोहरे बांड की संख्या का आकलन करने की एक विधि दिखाते हैं और एक N-acyl moiety में उनके इसी उत्पाद आयनों के आधार पर ms/ms/ms (ms3) प्रयोगों में । इसके अतिरिक्त, हम sm प्रजातियों के लेबल वाले दो स्थिर isotopically का उपयोग करके sm के लिए एक मात्रात्मक विश्लेषण विधि प्रस्तुत करते हैं, जो sm quantitation में प्रयुक्त श्रेणी का निर्धारण करने की सुविधा देता है । वर्तमान पद्धति जैविक नमूनों और औद्योगिक उत्पादों जैसे सौंदर्य प्रसाधनों में एसएम प्रजातियों की एक किस्म निस्र्पक में उपयोगी होगी ।

Introduction

Sphingomyelin (SM) स्तनधारी कोशिकाओं में एक आम sphingolipid है । SM intracellularly1 संश्लेषित और एक sphingosine-1-फॉस्फेट और एक ceramide, जो प्रतिरक्षा कोशिका तस्करी और त्वचा बाधा homeostasis, क्रमशः2में महत्वपूर्ण भूमिका है के रूप में अंय sphingolipids के लिए एक अग्रदूत के रूप में प्रस्तुत है, 3. इस प्रकार, एसएम चयापचय का सटीक विश्लेषण sphingolipids की शारीरिक और रोग भूमिकाओं elucidating के लिए महत्वपूर्ण है ।

एसएम एक ceramide और एक phosphorylcholine है कि ceramide के 1-hydroxy समूह से जुड़ा हुआ है, जो आगे एक sphingosine और एक N-acyl moiety से बना है से बना है । sphingosine और N-acyl moiety दोनों में कार्बन और दोहरे बांड संख्या में एक किस्म ceramide (और SM) प्रजातियों की संख्या में परिणाम है । LC-ईएसआई-ms/ms में हाल ही में अग्रिमों की मात्रात्मक और गुणात्मक विश्लेषण SM4,5के लिए सक्षम किया गया है । गुणात्मक विश्लेषण में, LCB के उत्पाद आयन स्पेक्ट्रा असाइन करके SM के एक sphingoid LCB के कार्बन और दोहरे बांड की संख्या की पहचान की गई । हालांकि, n-acyl moiety की संरचनात्मक जानकारी सीधे प्राप्त नहीं किया गया था क्योंकि इसके इसी उत्पाद आयनों की सूचना नहीं दी गई है, और इसलिए N-acyl moieties के प्रणेता आयनों के बीच विभेदक विश्लेषण द्वारा मुजे किया गया और उत्पाद आयनों दोनों सकारात्मक और नकारात्मक आयन मोड4,5में LCB करने के लिए इसी । इस रिपोर्ट में, हम दोनों LCB और N-acyl moiety के उत्पाद आयनों का पता लगाने के लिए एक विधि वर्तमान में एक साथ एमएस3 मोड का उपयोग ट्रिपल quadrupole और quadrupole रैखिक आयन जाल जन स्पेक्ट्रोमेट्री, जो सटीक संरचनात्मक सुविधा प्रत्येक SM प्रजातियों की अटकलें6।

आयन दमन (या वृद्धि) जैविक नमूनों में मैट्रिक्स की वजह से प्रभाव नियंत्रण रेखा में सटीक ठहराव-ईएसआई-एमएस विश्लेषण में बाधा, और इसलिए, यह समान मैट्रिक्स में ब्याज की सभी analytes के लिए अंशांकन curves का निर्माण करने के लिए वांछनीय है जैविक नमूना है । हालांकि, इस रणनीति संभव नहीं है क्योंकि यह जैविक नमूनों में सभी एसएम प्रजातियों, विशेष रूप से व्यापक विश्लेषण में तैयार करने के लिए लगभग असंभव है । इस प्रकार, यह एक अंशांकन वक्र का निर्माण करने के लिए व्यावहारिक है और जैविक नमूनों में नुकीला एक प्रतिनिधि एसएम प्रजातियों का उपयोग मात्रात्मक श्रृंखला का निर्धारण । हम एक अंशांकन वक्र का निर्माण करने के लिए दो isotopically-लेबल एसएम प्रजातियों का इस्तेमाल किया; एक एक मानक यौगिक के लिए एक आंतरिक मानक और दूसरे के लिए इस्तेमाल किया गया था । हम isotopically की एक छोटी राशि का पता लगाया-लेबल SM प्रजातियों के रूप में एक मानक यौगिक जैविक नमूनों में नुकीला और सफलतापूर्वक एक अंशांकन वक्र और मात्रात्मक श्रेणी6प्राप्त ।

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Protocol

उपयोग करने से पहले सभी प्रासंगिक सामग्री सुरक्षा डेटा शीट (MSDS) से परामर्श करें । त्वचा व्युत्पन्न एसएम द्वारा नमूना संदूषण को कम करने के लिए दस्ताने पहनें । वर्तमान प्रोटोकॉल ईगल के न्यूनतम आवश्यक माध्यम में उगाया हेला कोशिकाओं के लिए लागू किया गया था 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 2 मिमी L-glutamine, १,००० U/l पेनिसिलिन, और १०० mg/l streptomycin के साथ पूरक.

1. लिपिड नमूनों की तैयारी

नोट: यह महत्वपूर्ण है कि Teflon के साथ परीक्षण ट्यूबों-लाइन में पेंच टोपियां डिटर्जेंट-मुक्त हो सहित सभी कांच के हैं ।

  1. Bligh और डायर विधि का उपयोग करते हुए कक्ष homogenate से कुल लिपिड अंश का निष्कर्षण7
    1. संस्कृति (या वातानुकूलित) मीडिया से 10-सेमी टिशू कल्चर डिश निकालें और दो बार बर्फ के साथ 6 मिलीलीटर ठंडे पंजाबियों कुल्ला ।
    2. P1000 पिपेट द्वारा 10 सेमी टिशू कल्चर डिश में बर्फ ठंडा पंजाबियों की 1 मिलीलीटर जोड़ें । सेल खुरचनी के साथ कोशिकाओं फसल और २.०-एमएल में एकत्र प्लास्टिक ट्यूबों सिलिकॉन ।
    3. केंद्रापसारक (१,००० × जी, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) के बाद, एक P1000 पिपेट द्वारा supernatant हटा दें ।
    4. मेथनॉल की 1 मिलीलीटर जोड़ें । भंवर ट्यूबों संक्षेप में और sonicate २०० डब्ल्यू में 5 मिनट के लिए एक स्नान प्रकार sonicator में ।
      नोट: एक स्नान-प्रकार sonicator में पानी के स्तर को समायोजित करें ताकि सेल गोली कुशलता से homogenized है ।
    5. Teflon-लाइन में पेंच टोपियां के साथ परीक्षण ट्यूबों (13 मिमी x १०० मिमी) में पिपेट द्वारा मेथनॉल में सेल homogenate स्थानांतरण ।
    6. मेथनॉल के 1 मिलीलीटर, क्लोरोफॉर्म के 1 मिलीलीटर, डबल आसुत जल के ०.८ मिलीलीटर, और ५० µ एल के 10 µmol/एल के आंतरिक मानक d18:1/(D31)-16:0 SM प्रत्येक टेस्ट ट्यूब में जोड़ें ।
    7. भंवर टेस्ट ट्यूब कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए जोरदार ।
      नोट: इस बिंदु पर, एक एकल चरण (क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल/पानी = 1/2/0.8 (v/v/v)) का गठन किया है ।
    8. क्लोरोफॉर्म के 1 मिलीलीटर और डबल आसुत जल के १.० मिलीलीटर जोड़ें ।
    9. भंवर ट्यूबों जोरदार २,५०० rpm पर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ।
      नोट: इस बिंदु पर, जलीय (ऊपरी) चरण और कार्बनिक (कम) चरण अलग कर रहे हैं ।
    10. केंद्रापसारक (२,१५० × जी, 5 मिनट, 25 डिग्री सेल्सियस) के बाद, इकट्ठा करने और डिस्पोजेबल ग्लास ट्यूब (प्रारंभिक निचले चरण) में निचले चरण हस्तांतरण ।
      नोट: एक पाश्चर पिपेट और एक सुरक्षा पिपेट फिल्टर का उपयोग कर निचले चरण लीजिए. निचले चरण में पिपेट के टिप डालें, छोटे बल्ब ' ई ' वाल्व के बगल में निचोड़ करने के लिए ऊपरी चरण और पिपेट की नोक के अंदर चेहरे के समान रोयां उद्धार, और फिर पिपेट में निचले चरण अपनाना ।
    11. परीक्षण ट्यूबों में क्लोरोफॉर्म के 2 मिलीलीटर जोड़ें, और भंवर ट्यूबों जोरदार २,५०० rpm पर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पर्याप्त रूप से ऊपरी चरण और चेहरे की फुलाना के साथ मिश्रण के लिए ।
    12. केंद्रापसारक (२,१५० × जी, 5 मिनट, 25 डिग्री सेल्सियस) के बाद, इकट्ठा करने और चरण 1.1.10 में वर्णित के रूप में प्रारंभिक निचले चरण के साथ डिस्पोजेबल ग्लास ट्यूबों में संशोधित निचले चरण हस्तांतरण ।
    13. एक नाइट्रोजन धारा के तहत कांच ट्यूबों प्लेस और पूरी तरह से एकत्र निचले चरण में कार्बनिक सॉल्वैंट्स हटा दें ।
    14. मेथनॉल या इथेनॉल के ५०० µ एल के साथ नमूनों का पुनर्गठन, एक ०.०२-µm फिल्टर के साथ छानने का और-20 डिग्री सेल्सियस पर ग्लास शीशियों में स्टोर.
  2. अंशांकन वक्र के निर्माण और विधि मांय करने के लिए नमूना तैयारी
    1. जोड़ें ५० µ एल के ०.१, ०.५, 1, 5, 10, या ५० µmol/l के मानक यौगिक (d18:1/(D9)-18:1 SM) Teflon के साथ परीक्षण ट्यूबों में पेंच टोपियां ।
    2. प्रत्येक टेस्ट ट्यूब में सेल homogenate जोड़ें और मेथनॉल 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
      नोट: एक मैट्रिक्स के रूप में सेल homogenate की राशि प्रत्येक प्रयोग के अनुसार भिन्न होता है. यदि एक 10-मुख्यमंत्री संस्कृति पकवान में कोशिकाओं से व्युत्पंन नमूनों में एसएम प्रजातियों नियमित रूप से विश्लेषण कर रहे हैं, प्रत्येक परीक्षण ट्यूब में सेल homogenate की मात्रा एक 10-मुख्यमंत्री संस्कृति पकवान में कोशिकाओं के करीब होना चाहिए ।
    3. 1.1.6-1.1.14 चरणों में वर्णित के रूप में कुल लिपिड अंश निकालें ।
    4. 1.2.1-1.2.3 चरणों में descried के रूप में विधि मान्य करने के लिए गुणवत्ता जाँच (QC) नमूने तैयार करें । मानक यौगिक के विभिन्न सांद्रता के साथ तीन QC नमूने तैयार करें (d18:1/(D9)-18:1 एसएम): 3x के भीतर एक मानक वक्र (qc-कम, qc-एल), केंद्र के पास एक (qc-मध्य, qc-एम) के निचले सीमा, और एक के ऊपरी सीमा के पास मानक वक्र (qc-उच्च, qc-एच) ।

2. नियंत्रण रेखा द्वारा एसएम विश्लेषण-ईएसआई-ms/

  1. मोबाइल फेज की तैयारी
    1. मिश्रण सॉल्वैंट्स (acetonitrile/मेथनॉल/ddH2O = 2/2/1 (v/v/v) जलीय चरण के लिए और isopropanol कार्बनिक चरण के लिए) Teflon के साथ कांच की बोतलों में पेंच टोपियां और sonicate के लिए 5 मिनट में एक स्नान प्रकार sonicator ।
    2. एक मोबाइल चरण में (अंतिम एकाग्रता २६.४ mmol/एल) और NH4ओह (१४.९ mmol/
  2. नियंत्रण रेखा-ईएसआई द्वारा SM का गुणात्मक विश्लेषण-MS3
    1. उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) प्रणाली को सक्रिय करें, कांच की बोतलों में प्रवेश ट्यूबों डाल कि मोबाइल चरणों में होते हैं, और HPLC लाइनों पर्ज । एक सी18 HPLC कॉलम (१.५ mm आईडी × १०० mm लंबाई लिंक, कण आकार ३.० µm) HPLC प्रणाली के लिए, स्तंभ ओवन में ५० डिग्री सेल्सियस पर तापमान रखने के लिए, और शर्त १०० µ एल पर जलीय मोबाइल चरण के साथ कॉलम और/नमूना में एक नमूना रैक में नमूने रखो एर.
    2. तालिका 1 और तालिका 2 में सूचीबद्ध के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ब्याज की एसएम प्रजातियों के पहले और दूसरे अग्रदूत आयनों के रूप में ट्रिपल quadrupole और quadrupole रैखिक आयन जाल जन स्पेक्ट्रोमेट्री प्रणाली के लिए एमएस3 विश्लेषण के मापदंडों सेट करें ।
      1. डबल क्लिक करें डेटा अधिग्रहण के लिए सॉफ्टवेयर आइकन, डबल क्लिक करें ' हार्डवेयर विंयास ', चुनें ' नियंत्रण रेखा + QTRAP4500 + वाल्व ', और ' पर क्लिक करें सक्रिय प्रोफ़ाइल ' ।
      2. ' नया उप-प्रोजेक्ट ' और ' ठीक ' क्लिक करके एक नया सबफ़ोल्डर बनाएं ।
      3. ' फ़ाइल ' टैब पर क्लिक करें, ' नया ' चुनें, और ' अधिग्रहण विधि ' और ' ठीक ' चुनें । ' जन ' कल्पना आइकन और ' एमएस ' टैब पर क्लिक करें. चुनें स्कैन प्रकार के रूप में ' एमएस/एमएस/ms (MS3) ', स्कैन दर के रूप में १०,००० Da/s, ' के रूप में ' नकारात्मक, और ' अवधि ' विश्लेषण किया जा करने के लिए पूरे समय के रूप में (min) । स्कैन की जाने वाली श्रेणी के रूप में ' प्रारंभ (दा) ' और ' स्टॉप (दा) ' के m/z सेट करें । 1 और लक्ष्य SM प्रजातियों के हित के 2 अग्रदूत आयनों के m/z सेट करें ।
        नोट: कई एसएम प्रजातियों का विश्लेषण करने के लिए, '-MS3 ' आइकन पर प्रकाश डाला, ठीक क्लिक करें, ' इस प्रयोग की प्रतिलिपि बनाएँ ' का चयन करें, और फिर अन्य एसएम प्रजातियों के 1 और 2 अग्रदूत आयनों के एम/
      4. ' उन्नत MS ' टैब का चयन करें, और प्रत्येक पैरामीटर निम्नानुसार सेट: स्कैन मोड के रूप में ' प्रोफ़ाइल ', चरण आकार के रूप में ०.१२ (दा), संकल्प Q1 और Q3 ' इकाई ' और ' जलाया ', क्रमशः, तीव्रता दहलीज के रूप में 0, ५० के रूप में समय की स्थापना (एमएस), जन पर्वतमाला के बीच के रूप में ठहराव १.५ ms, का चयन करें ' गतिशील भरण समय ', Q3 प्रविष्टि 8 V, और उत्तेजना समय के रूप में 25 ms के रूप में बाधा ।
      5. ' MS ' टैब में ' संपादन पैरामीटर ' बटन पर क्लिक करें और ' स्रोत/गैस ' टैब का चयन करते हैं । तालिका 1में सूचीबद्ध के रूप में पर्दा गैस, टक्कर गैस, ionspray वोल्टेज, तापमान, आयन स्रोत gas1 और gas2 के मापदंडों को सेट करें । फिर ' यौगिक ' टैब का चयन करें । तालिका 2में सूचीबद्ध के रूप में, क्लस्टरिंग क्षमता, प्रवेश क्षमता, टक्कर ऊर्जा, उत्तेजना ऊर्जा, और टक्कर ऊर्जा के मापदंडों को निर्धारित करना ।
      6. हाइलाइट ' एकीकृत Valco वाल्व ' और ' का चयन करें ' एक के रूप में 0 कदम के लिए स्थिति नाम, और सेट ' बी ' कुल समय ५.० मिनट के लिए स्थिति के रूप में । इसके अलावा कुल समय ७०.० मिनट के लिए स्थिति के रूप में ' ए ' सेट ।
      7. हाइलाइट ' Shimadzu एलसी सिस्टम ' । ' पंप ' टैब का चयन करें और बाइनरी प्रवाह के रूप में पंपिंग मोड सेट, ०.२८ एमएल के रूप में कुल प्रवाह/न्यूनतम, और २०.० MPa के रूप में दबाव सीमा की अधिकतम । ' ' नमूना टैब का चयन करें और २०० µ एल के रूप में कुल्ला मात्रा सेट, सुई स्ट्रोक के रूप में ५२ mm, धोने की गति के रूप में ३५ µ l/s, नमूना गति के रूप में ५.० µ l/s, के रूप में समय पर्ज करें २५.० मिनट, कुल्ला डुबकी समय के रूप में 5 एस, और कुल्ला मोड के रूप में ' से पहले और आकांक्षा के बाद '.
        1. इसके अलावा, कूलर इकाई सक्षम, 4 डिग्री सेल्सियस और नियंत्रण शीशी सुई स्ट्रोक के रूप में कूलर तापमान सेट ५२ mm । ' ओवन ' टैब का चयन करें, ओवन सक्षम और ओवन तापमान और ५० डिग्री सेल्सियस और ८५ डिग्री सेल्सियस, क्रमशः के रूप में अधिकतम तापमान सेट ।
        2. ' नियंत्रक ' टैब का चयन करें और बॉक्स ' पावर ऑन ' चेक । ' समय ' कार्यक्रम टैब का चयन करें और इस प्रकार के रूप में विलायक ढाल सेट: सॉल्वैंट्स a/5 मिनट के लिए एक 100/0 अनुपात में, कार्यक्रम रैखिक परिवर्तन करने के लिए 80/20 पर 4 मिनट, 35/65 करने के लिए ५० मिनट से अधिक, और 25/75 पर 1 मिनट. बाद में , उंहें 10 मिनट के लिए 25/75 पर पकड़, तो 4 मिनट से अधिक 100/0 रैखिकता । उसके बाद विधि को सहेजें ।
    3. बैच फ़ाइल बनाएं
      1. डबल क्लिक करें ' निर्माण अधिग्रहण बैच ' आइकन, क्लिक करें ' सेट जोड़ें ', ' नमूने जोड़ें ', नए नमूनों की संख्या सेट, और ' ठीक ' पर क्लिक करें ।
      2. ' मेथड एडिटर ' बटन पर क्लिक करें और इस्तेमाल की जाने वाली विधि का चुनाव करें । एक बैच फ़ाइल में एक से अधिक विधियाँ उपयोग किए जाते हैं, तो ' का उपयोग करें एकाधिक विधियाँ ' बॉक्स की जाँच करें और प्रत्येक नमूने के लिए प्राप्ति विधि का चयन करें । ' नमूना नाम ' का नाम बदलें, ' शीशी स्थिति ' के लिए उपयुक्त संख्या सेट, और इंजेक्शन की मात्रा की मात्रा में डाल दिया । उसके बाद बैच फ़ाइल सहेजें ।
    4. नियंत्रण रेखा-ईएसआई-ms3 विश्लेषण द्वारा एम एस ब्याज की SM प्रजातियों के एमएस3 उत्पाद आयन स्पेक्ट्रा प्राप्त करें
      1. बैच फ़ाइल में ' submit ' टैब का चयन करें, विश्लेषण किया जा करने के लिए नमूनों की लाइन पर प्रकाश डाला, और ' submit ' बटन पर क्लिक करें ।
      2. ' ' दृश्य Quene ' ' चिह्न, ' Equilibrate ' चिह्न पर क्लिक करें, उपयोग की जाने वाली प्राप्ति विधि चुनें, 1 मिनट के रूप में समय निर्धारित करें और ' ठीक ' पर क्लिक करे.
      3. इसी आइकन पर क्लिक करके ' ट्यूनिंग के लिए आरक्षित साधन ' निष्क्रिय. फिर ' शुरू नमूना ' आइकन पर क्लिक करके बैच अनुक्रम निष्पादित ।
    5. एक एमएस3 उत्पाद आयन स्पेक्ट्रा SM के अनुपात (एम/जेड) उत्पाद आयन स्पेक्ट्रा और sphingoid LCB और एन-acyl moiety ब्याज की सटीक द्रव्यमान की तुलना चार्ज करने के लिए आवंटित । sphingoid LCB और N-acyl moiety में इसी उत्पाद आयनों के अनुसार कार्बन और दोहरे बांड की संख्या निर्धारित करें ।
      1. पुष्टि करें कि उपयुक्त उप-प्रोजेक्ट फ़ोल्डर चयनित है, तो ' खोलें डेटा फ़ाइल ' चिह्न डबल क्लिक, और विश्लेषण करने के लिए नमूनों का चयन करें । प्रत्येक लक्ष्य एसएम प्रजातियों के लिए वर्णलेख में चोटी खींचें और फिर डबल क्लिक करें । प्राप्त एमएस3 उत्पाद आयन स्पेक्ट्रा के भीतर घसीटा क्षेत्र प्रस्तुत किया जाएगा ।
  3. नियंत्रण रेखा द्वारा SM का मात्रात्मक विश्लेषण-ईएसआई-ms/
    1. चरण २.१ और 2.2.1 में वर्णित के रूप में मोबाइल चरणों और HPLC स्तंभ सेट करें ।
    2. एकाधिक रिएक्शन मॉनिटरिंग (MRM) विश्लेषण के लिए ट्रिपल quadrupole और quadrupole रेखीय आयन ट्रैप मास स्पेक्ट्रोमेट्री सिस्टम के मापदंडों को तालिका 1 और तालिका 2में सूचीबद्ध के रूप में सेट करें ।
      1. चरण 2.2.2.1 और 2.2.2.2 में वर्णित प्रक्रियाओं का संचालन करें ।
      2. ' फ़ाइल ' टैब पर क्लिक करें, ' नया ' चुनें, और ' अधिग्रहण विधि ' और ' ठीक ' चुनें । ' जन कल्पना ' आइकन और ' एमएस ' टैब पर क्लिक करें. ' MRM ' के रूप में स्कैन प्रकार का चयन करें, ' सकारात्मक ' के रूप में ध्रुवीयता । ' अवधि ' सेट के रूप में पूरे समय के लिए विश्लेषण किया जाएगा । [m + H]+ और १८४ के रूप में ' Q1 मास (da) ' और ' Q3 मास (da) ' के लक्ष्य SM प्रजातियों का, क्रमशः के m/z सेट करें । लक्ष्य एसएम प्रजातियों के नाम के रूप में ' समय ' 10 एमएस और ' आईडी ' के रूप में सेट करें ।
      3. ' उन्नत MS ' टैब का चयन करें, और प्रत्येक पैरामीटर निम्नानुसार सेट: दोनों संकल्प Q1 और ' इकाई ' के रूप में Q3, 0 के रूप में तीव्रता थ्रेशोल्ड, 0 (ms) के रूप में समय की स्थापना, और 5 ms के रूप में मास पर्वतमाला के बीच ठहराव ।
      4. ' MS ' टैब में ' संपादित पैरामीटर ' बटन पर क्लिक करें और ' स्रोत/गैस ' टैब का चयन करे । तालिका 1में सूचीबद्ध के रूप में पर्दा गैस, टक्कर गैस, ionspray वोल्टेज, तापमान, आयन स्रोत gas1 और gas2 का पैरामीटर रखें । फिर ' यौगिक ' टैब का चयन करें. तालिका 2में सूचीबद्ध के रूप में संभावित, प्रवेश क्षमता, टकराव ऊर्जा, और टक्कर सेल से बाहर निकलने की क्षमता के लिए क्लस्टरिंग के मापदंडों रखो ।
      5. चरण 2.2.2.6 में वर्णित के रूप में वाल्व सेट करें ।
      6. चरण 2.2.2.7 में वर्णित के रूप में नियंत्रण रेखा शर्त सेट करें । उसके बाद विधि को सहेजें ।
    3. चरण 2.2.3 में वर्णित के रूप में बैच फ़ाइल बनाएँ ।
    4. चरण 2.2.4 में वर्णित के रूप में LC-ईएसआई-ms/एमएस विश्लेषण द्वारा प्रत्येक एसएम प्रजातियों के MRM डेटा प्राप्त करें ।
    5. डेटा एकीकरण के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग कर MRM डेटा की प्रक्रिया और प्रत्येक एसएम प्रजातियों के निकाले आयन वर्णलेख के लिए चोटी क्षेत्र के डेटा प्राप्त करते हैं ।
      1. मात्रात्मक विश्लेषण में डेटा एकीकरण के लिए सॉफ़्टवेयर आइकन डबल क्लिक करें, ' संपादन ' टैब पर क्लिक करें और उपयोगकर्ता एकीकरण डिफ़ॉल्ट्स चुनें. सेट गाऊसी चिकनी चौड़ाई १.० बिंदु के रूप में, और ' ठीक ' पर क्लिक करें । ' संपादन ' टैब पर क्लिक करें और ' नई परिणाम तालिका ' चुनें । एकीकृत होने के लिए नमूना चुनें, एक तीर बटन क्लिक करें, और ' अगला ' क्लिक करें । ' नई विधि बनाएं ' का चयन करें, विधि का नाम सेट करें, और ' अगला ' क्लिक करे । ' अगला ' क्लिक करें और d18:1/(D31)-16:0 SM जैसा है, ' अगला ' क्लिक करें, और ' समाप्त ' क्लिक करें ।
      2. ' पीक समीक्षा प्रदर्शित करता है ' पर क्लिक करें और वर्णलेख चोटियों उचित रूप से मान्यता प्राप्त कर रहे हैं कि पुष्टि. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि d18 के अवधारण समय: 1/(D31)-16:0 sm आमतौर पर ~ ०.३ मिनट के रूप में एक 34-1 SM (आमतौर पर d18 के होते है के साथ तुलना में छोटा है: 1/
    6. d18 के लिए प्रत्येक sm प्रजातियों के शिखर के अनुपात के अनुसार प्रत्येक एसएम प्रजातियों को बढ़ाता है: 1/(D31)-16:0 SM आंतरिक मानक ।
      1. ' फ़ाइल ' टैब पर, ' निर्यात करें ' चुनें, ' परिणाम तालिका ' चुनें, ' MultiQuant ' के रूप में, स्तंभ ' सभी स्तंभ निर्यात ' के रूप में, पंक्तियाँ ' सभी पंक्तियाँ निर्यात करें ' के रूप में स्पष्ट रूप से छुपी हुई, और फिर ' ठीक ' पर क्लिक करने के रूप में प्रारूप की पुष्टि.
      2. Excel सॉफ़्टवेयर में निर्यात की गई फ़ाइल खोलें । के क्षेत्र द्वारा लक्ष्य SM प्रजातियों के क्षेत्र को सामान्य (d18:1/(D31)-16:0 SM) । फिर इंजेक्शन नमूने में लक्ष्य एसएम प्रजातियों की राशि की गणना करने के लिए इंजेक्शन नमूना में है की सैद्धांतिक राशि से गुणा करें ।
  4. मानक वक्र का निर्माण
    1. d18 के MRM डेटा प्राप्त करें: 1/(d9)-18:1 एसएम और d18:1/(d31)-16:0 SM-चरण 2.3.1-2.3.4 में वर्णित के रूप में नियंत्रण रेखा-ईएसआई-ms/एमएस विश्लेषण द्वारा मानक वक्र के निर्माण के लिए नमूनों में ।
    2. d18 के पीक क्षेत्र का डेटा प्राप्त करें: 1/(d9)-18:1 एसएम और d18:1/(डी31)-16:0 एसएम के रूप में चरण -6 में वर्णित.
    3. d18 की मात्रा की गणना करें: 1/(D9)-18:1 एसएम में इंजेक्शन नमूने के रूप में चरण 2.3.6 में वर्णित है ।
    4. X-अक्ष और Y-अक्ष को नाममात्र की मात्रा और d18 की परिकलित मात्रा के रूप में सेट करके ट्रेंडलाइन का निर्माण करें: 1/(D9)-18:1 SM और ट्रेंडलाइन सूत्र प्राप्त करना ।
  5. Excel सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके मात्रात्मक विधि मांय कर रहा है
    1. विधि की मांयता के लिए, d18 की मात्रा को बढ़ाता है: 1/(d9)-18:1 एसएम और d18:1/(डी31)-16:0 sm नमूनों में प्रत्येक qc नमूने का विश्लेषण करके कम से कम तीन बार 1 दिन में, और चरण 2.3.1-2.3.4 में वर्णित के रूप में कम से कम 3 दिन दोहराएं ।
    2. पीक क्षेत्र डेटा प्राप्त करें और d18:1/(D9)-18:1 SM चरण -6 और 2.3.6 में वर्णित के रूप में इंजेक्ट किया गया नमूना में की मात्रा की गणना ।
    3. प्राप्त अंशांकन वक्र के अनुसार, d18 की मात्रा की गणना: 1/(D9)-18:1 SM इंजेक्शन नमूने में ।
    4. परिशुद्धता के मूल्यांकन
      1. d18 की राशि के औसत और मानक विचलन की गणना करें: 1/(D9)-18:1 एसएम एक्सेल सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हुए इंट्रा-डे और इंटर-डे के डेटासेट पर स्टेप 2.5.3 में प्राप्त किया ।
      2. चरण 2.5.4.1 में प्राप्त औसत मानक विचलन द्वारा विभाजित है, और% के रूप में व्यक्त की है ।
    5. सटीकता का मूल्यांकन
      1. प्रत्येक डेटा की शुद्धता निम्नानुसार परिकलित करें:
        [(चरण 2.5.3 में प्राप्त परिकलित राशि.) /(नाममात्र राशि)-1] × १०० (%)
      2. इंट्रा-डे और इंटर-डे के डेटासेट पर सटीकता के निरपेक्ष मूल्य के औसत की गणना करें ।

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Representative Results

रासायनिक संश्लेषित d18:1/24:0 एसएम (चित्रा 1ए) और d18:1/24:0 हेला कोशिकाओं से निकाले गए लिपिड नमूनों में एसएम (चित्रा 1बी) नियंत्रण रेखा द्वारा विश्लेषण किया गया-ईएसआई-MS3 रोजगार [m + HCOO]- और [m-CH3]- क्रमशः पहले और दूसरे अग्रदूत आयनों के रूप में । ध्यान दें कि demethylated-sphingosylphosphorylcholine (SPC) (m/z ४४९) की स्पेक्ट्रम तीव्रता SM N-acyl moiety (m/z ३७८) से बड़ी है । इसके अलावा, [M-choline-CH3 (sphingosine-1-फास्फेट)] के लिए इसी स्पेक्ट्रम- भी एसएम के LCB आवंटित करने के लिए उपयोगी है । हम यह भी पुष्टि की है कि demethylated-spc (एम/जेड ४४९) के स्पेक्ट्रम मुख्य रूप से d18 से उत्पादन किया है: हमारे एमएस3 विश्लेषण (चित्रा 1सी) की हालत के तहत 1 spc ।

चित्रा 2में एसएम प्रजातियों लेबल दो isotopically का उपयोग कर अंशांकन वक्र दिखाया गया था । ट्रेंडलाइन 1/x2को भार कारक के रूप में लागू करके प्राप्त किया गया था । अवशिष्ट विश्लेषण का परिणाम चित्रा 2बीमें दिखाया गया था । ध्यान दें कि अवशिष्ट मान quantitation की निचली सीमा के करीब (इस वर्तमान अध्ययन में ०.१ pmol) 1/x2को भार कारक के रूप में लागू करने से छोटा था ।

प्राप्त अंशांकन वक्र के पैरामीटर और मांयता का परिणाम तालिका 3में दिखाए गए थे । परिशुद्धता और सटीकता के मूल्य ± 15% के भीतर थे, दिखा रहा है कि वर्तमान अध्ययन एक quantitation LC-MS8का उपयोग कर विधि के रूप में मानदंड से मुलाकात की ।

हेला कक्षों में प्रत्येक SM प्रजातियों की मात्रा तालिका 4में दिखाई गई थी । हेला कोशिकाओं 10% FBS और काटा युक्त संस्कृति मीडिया में बड़े हो गए थे । d18:1/16:0 sm और d18:1/24:1 sm थे सबसे अधिक और दूसरी सबसे प्रचुर मात्रा में एसएम प्रजातियों जिनकी संरचना निर्धारित किया गया, और ५४% और कुल एसएम के 14% से मिलकर बनता है, क्रमशः

Figure 1
चित्र 1 . MS3 स्पेक्ट्रा के विशिष्ट m/ हेला कोशिकाओं में SM के संकेत । MS3 स्पेक्ट्रा के रासायनिक संश्लेषित d18:1/24:0 sm (A) and d18:1/24:0 एसएम लिपिड नमूनों में हेला कोशिकाओं से निकाले गए (B) दिखाए गए हैं । परिणाम हामा एट अल से अनुकूलित किया गया । 6 ध्यान दें कि SPC के स्पेक्ट्रम की तीव्रता SM के एन-acyl moiety की तुलना में बड़ा है । एमएस3 स्पेक्ट्रा के रासायनिक संश्लेषित d18:1 SPC में दिखाए जाते हैं (C) समान m/z के साथ आयनों को रोजगार से ([m + HCOO]-, m /z ४९९) 1 और 2 अग्रदूत आयनों के रूप में । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . दो isotopically-लेबल्ड sm प्रजातियों का उपयोग कर sm के अंशांकन curves । (A) दो-isotopically लेबल वाले sm प्रजातियों (d18:1/(d9)-18:1 sm और d18:1/(d31)-16:0 sm) का उपयोग करते हुए अंशांकन वक्र । अंशांकन curves भारित कारक का उपयोग कर निर्माण किया गया = 1/ मांयता के परिणाम तालिका 3में सूचीबद्ध हैं । (ख) एक निर्माण अंशांकन वक्र की भलाई के मूल्यांकन के लिए अवशिष्ट विश्लेषण । अंशांकन वक्र में अवशिष्ट का उपयोग कर भार कारक = 1/x2 का उपयोग कर लोगों की तुलना में छोटा है भार कारक = 1/विशेष रूप से d18 की एक कम राशि में: 1/(D9)-18:1 SM. कृपया यहां क्लिक करें इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए चित्रा.

TurboIonSpray सेटिंग्स
मोड पर्दा गैस (psi) टक्कर गैस आयन स्प्रे वोल्टेज (वी) तापमान (° c) आयन स्रोत गैस 1 (साई) आयन स्रोत गैस 2 (साई)
MS3 ४० उच्च -४५०० २०० ४० ८०
Mrm ४० 10 ५५०० ३०० ४० ८०

तालिका 1. electrospray आयन दोनों गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल स्रोत की शर्तें । इस तालिका हामा एट अल से अनुकूलित किया गया था । ६

मोड Polarity प्रणेता आयन (Q1) उत्पाद आयन या 2 प्रणेता आयन (Q3) संभावित (V) क्लस्टरिंग प्रवेश क्षमता (V) टक्कर ऊर्जा (V) टक्कर सेल से बाहर निकलें संभावित (V) टकराव ऊर्जा प्रसार (वी) उत्तेजना समय (ms) स्पीड (डीए/ समय (ओं) संकल्प
Mrm सकारात्मक [एम + एच] + १८४ 1 10 ३५ 12 - - - ५.३६४ इकाई
MS3 नकारात्मक [M + HCOO] - एम-15 -26 -10 -४० - 0 25 १०००० स्वतः caluculated इकाई

तालिका 2. एमएस3 और ट्रिपल quadrupole और quadrupole रैखिक आयन जाल मास में MRM मोड के मानकों गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया स्पेक्ट्रोमेट्री, क्रमशः । इस तालिका हामा एट अल से अनुकूलित किया गया था । ६

Table 3
तालिका 3. प्राप्त अंशांकन वक्र के मापदंडों और मांयता का परिणाम है । परिणाम हामा एट अल से अनुकूलित किया गया । ६

SM की आणविक प्रजातियां राशि (pmol/मिलीग्राम प्रोटीन)
d18:1/14:0 ११५.५
d16:1/ ११५.५
d17:1/ २३९.८
d18:2/16:0 ४४९.९
d18:1/ ३३५५.१
d18:0/16:0 २०३.८
d18:1/17:0 १०६.३
d18:2/18:0 २६.५
d20:0/16:1 ९४.९
d18:1/ ९४.९
d18:2/22:0 १०२.३
d18:1/ २३५
d18:1/ ८३.३
d18:1/ २३.९
d18:1/24:2 २८६.५
d18:2/24:1 २८६.५
d18:1/24:1 ८५३.२
d18:1/24:0 ९४.६
d18:1/ १२.९

तालिका 4. हेला कोशिकाओं में प्रत्येक एसएम प्रजातियों की मात्रा । हेला कोशिकाओं 10% FBS युक्त संस्कृति मीडिया में उगाया गया । कोशिकाओं को काटा गया था, और कुल लिपिड अंश Bligh और डायर विधि द्वारा निकाला गया था । परिणाम हामा एट अल से अनुकूलित किया गया । ६

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Discussion

वर्तमान गुणात्मक विधि में, हम एक SPC और एक एन-acyl moiety के एमएस3 उत्पाद आयनों प्राप्त की । यह ठीक से दोनों एक SPC और एक N-acyl moiety असाइन करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह अंत करने के लिए, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अन्य phosphorylcholine-युक्त अणुओं को भी एमएस3 उत्पाद आयनों के रूप में पता लगाया जा सकता है । Diacyl-phosphatidylcholine (पीसी) और plasmalogen-पीसी प्रचुर मात्रा में स्तनधारी कोशिकाओं में मौजूद हैं, और उनके hydrophobicity एसएम के समान है । इसलिए, diacyl-पीसी और plasmalogen-पीसी एक आइसोटोप के साथ (आमतौर पर 13C) सैद्धांतिक रूप से एक साथ एसएम के साथ पाया जा सकता है । हमारे प्रयोगों में, plasmalogen के एमएस3 उत्पाद आयनों-पीसी एक साथ एसएम विश्लेषण में मनाया गया. यह ठीक से पता चला है कि SPC के स्पेक्ट्रम की तीव्रता एसएम एन-acyl moiety (चित्रा 1ए और बी) की तुलना में बड़ा है कि एसएम के एमएस3 उत्पाद आयनों का चयन करने के लिए उपयोगी है । इसके विपरीत, फैटी acyl की तीव्रता-moiety (या के रूप में लगभग एक ही) से बड़ा है कि demethylated lysoplasmalogen-पीसी (डेटा नहीं दिखाया गया है) ।

वर्तमान मात्रात्मक विधि में, यह ठीक अंशांकन वक्र के निर्माण और विधि मांय करने के लिए नमूनों को तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, भार कारक ठीक से अंशांकन वक्र निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए; यह विशेष रूप से एक कम एकाग्रता में वक्र फिटिंग में सुधार करने के लिए उपयोगी है । हम अंशांकन घटता अलग भार कारकों का उपयोग कर की तुलना में । कम एकाग्रता में वक्र फिटिंग स्पष्ट रूप से भारित कारक का उपयोग करके सुधार किया गया था = 1/x2 के रूप में है कि भार कारक = 1 या 1/x (चित्रा 2बी) का उपयोग कर के साथ तुलना में । परिशुद्धता और सटीकता के मूल्य ± 15% के भीतर होना चाहिए । यदि QC-L की एकाग्रता मानक वक्र (quantitation की निचली सीमा) की निचली सीमा के समान है, तो यह ± 20%8के भीतर होना चाहिए ।

हम इस अध्ययन में प्रसंस्कृत कोशिकाओं से कुल लिपिड अंश निकालने के लिए Bligh और डायर विधि कार्यरत हैं. लिपिड निष्कर्षण के लिए अन्य तरीकों जैसे Folch विधि भी9उपयोगी हैं । यह महत्वपूर्ण है के लिए लिपिड अंश निकालने के लिए उपयुक्त विधि का उपयोग कर राशि और/या नमूनों के गुण के अनुसार । एक साथ प्रत्येक इंजेक्शन में विश्लेषण एसएम प्रजातियों की संख्या भी क्रम में डेटा अधिग्रहण के लिए सॉफ्टवेयर लदान को रोकने के लिए बहुत बड़ा नहीं होना चाहिए । अनुसूचित MRM एक साथ कई एसएम प्रजातियों के quantitating के लिए उपयोगी होगा ।

एमएस3 विश्लेषण का उपयोग कर हमारे वर्तमान विधि अतिरिक्त उपकरणों के बिना LCB और एनएस के acyl moiety के कार्बन और दोहरे बांड की संख्या सट्टा करने के लिए उपयोगी है । हालांकि, इस तरह के दोहरे बांड के स्थान के रूप में अंय संरचनात्मक जानकारी, isomer (सीआईएस या ट्रांस), और आकार (सीधे या बंटी) प्राप्त नहीं किया जा सकता है । यह उच्च ऊर्जा का उपयोग करने के लिए उत्पाद आयनों और उनके संरचनात्मक अतिरिक्त उपकरणों का उपयोग कर10,11,12,13की जानकारी प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । N-acyl moieties करने के लिए इसी उत्पाद आयनों का आणविक फार्मूला था [रको2]- आयनों कि नाइट्रोजन शामिल नहीं है. यह वर्तमान में अज्ञात कैसे टक्कर पृथक्करण आय प्रेरित है ।

एमएस3 विश्लेषण के लिए, यह टकराव ऊर्जा के मापदंडों को समायोजित करने के लिए महत्वपूर्ण है (CE) और एमएस के लिए उत्तेजना समय3 विखंडन (ExT). एक उच्च CE अतिरिक्त विखंडन का कारण है और 2एन डी के प्रणेता आयन के रूप में demethylated एसएम के उत्पाद आयन की तीव्रता को कम करेगा । इसके अलावा, विखंडन पैटर्न काफी ExT पर निर्भर है । प्रयोगों से पहले, यह CE और ExT की उचित स्थिति का निर्धारण करने के लिए वांछनीय है कि demethylated एसएम, SPC, और N-acyl moiety के उत्पाद आयनों की तीव्रता को अधिकतम करने सिंथेटिक एसएम मोबाइल चरणों में भंग द्वारा ।

हम प्रयोग किया जाता d18:1/(d9)-18:1 sm और d18:1/(d31)-16:0 sm के रूप में दो isotopically-लेबल्ड sm प्रजातियों अंशांकन वक्र का निर्माण करने के लिए । ionization की दक्षता एसएम प्रजातियों और मोबाइल चरण की स्थिति के अनुसार भिन्न हो सकते हैं । इस प्रकार, अगर ब्याज की एसएम की संख्या सीमित है, यह वांछनीय है isotopically-लेबलित sm प्रजातियों और अधिक सटीक quantitation के लिए ब्याज की तैयार करने के लिए ।

SM संरचना अब तक निर्धारित किया गया है के अनुसार प्रणेता आयन और उत्पाद आयन demethylated SPC के अनुरूप । इसके अलावा, यह कई बार ठीक से उपस्थिति नमूना मैट्रिक्स में quantitation की निचली सीमा के ब्याज का लक्ष्य यौगिकों के बाद से निर्धारित करने के लिए प्रभावित था प्रचुर मात्रा में नमूना मैट्रिक्स में मौजूद थे ।

वर्तमान अध्ययन एक LCB में कार्बन और दोहरे बांड की संख्या का अनुमान लगाने के लिए उपयोगी है और एक N-acyl moiety अतिरिक्त उपकरणों के बिना एमएस3 प्रयोगों में उनके इसी उत्पाद आयनों के आधार पर । इसके अतिरिक्त, हम sm प्रजातियों के लेबल वाले दो स्थिर isotopically का उपयोग करके sm के लिए एक मात्रात्मक विश्लेषण विधि प्रस्तुत करते हैं, जो sm quantitation में प्रयुक्त श्रेणी का निर्धारण करने की सुविधा देता है । वर्तमान पद्धति विभिन्न जैविक नमूनों और औद्योगिक उत्पादों में अद्वितीय एसएम प्रजातियों की एक किस्म निस्र्पक में उपयोगी होगी ।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और जापान के प्रौद्योगिकी (KAKENHI) को K.H. (#15K01691), Y.F. (#15K08625), K.Y. (#26461532), और मंत्रालय से असभ्य रोग परियोजना के अध्ययन के लिए अनुदान के मंत्रालय से एक अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया स्वास्थ्य, श्रम और कल् याण (K.Y. #201510032A) । हम इस पांडुलिपि का एक मसौदा संपादन के लिए Edanz समूह (www.edanzediting.com/ac) का शुक्र है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS ThermoFisher 10010023
100 mm tissue culture dish IWAKI 3020-100
Cell scraper IWAKI 9000-220
Siliconized 2.0 mL tube Fisher Scientific 02-681-321
Test tube IWAKI TST SCR 16-100
Teflon-lined screw cap IWAKI 9998CAP415-15
Disposable glass tube IWAKI 9832-1310
CAPCELL PAK C18 ACR 3 µm 1.5 mm I.D. x 100 mm Shiseido 92223 Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column
CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE Shiseido 12197
Cartridge holder Shiseido 12415
Acetonitrile Wako 018-19853
2-Propanol (Isopropyl Alcohol) Wako 161-09163
Methanol Wako 134-14523
Formic acid Wako 066-00466
28% Ammonia water Wako 016-03146
Sonicator (bath type) SHARP UT-206H
Vortex mixer for glass test tube TAITEC Mix-EVR
1.4 mL glass vial Tomsic 500-1982 Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20°C
8 mm septum Tomsic 200-3322 When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum
Screw cap for 1.4 mm glass vial Tomsic 500-2762
Screw cap with slit septum Shimadzu GLC GLCTV-803
PVDF 0.22 µm filter Millipore SLGVR04NL
Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry SCIEX QTRAP4500
The software for data acquisition and analysis of product ion spectra SCIEX Analyst
The software for data integration in quantitative analysis SCIEX MultiQuant
HPLC system Shimadzu Nexera
Glass bottle Sansyo 85-0002
d18:1/24:0 sphingomyelin Avanti Polar Lipids 860592P
Sphingosylphosphorylcholine Merck 567735
Fetal bovine serum ThermoFisher  26140079
L-glutamine ThermoFisher  25030081
Penicillin and streptomycin Sigma P4333
Eagle’s minimum essential medium Sigma M4655

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References

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जैव रसायन अंक १३५ Sphingomyelin तरल क्रोमैटोग्राफी-electrospray ionization-मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री स्थिर isotopically लेबल प्रजातियों एमएस/ms मोड अंशांकन वक्र N-acyl moiety
नियंत्रण रेखा से Sphingomyelin के लिए मात्रात्मक और गुणात्मक विधि-MS दो स्थिर Isotopically लेबल Sphingomyelin प्रजातियों का उपयोग
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Hama, K., Fujiwara, Y., Yokoyama, K. Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species. J. Vis. Exp. (135), e57293, doi:10.3791/57293 (2018).

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