Summary
Qui, presentiamo un protocollo per quantificare e qualificare ogni specie di sfingomielina utilizzando Monitoraggio multiplo di reazione e la modalità di MS/MS/MS, rispettivamente.
Abstract
Presentiamo un metodo di analisi di sfingomielina (SM) qualitativamente e quantitativamente di liquido cromatografia-electrospray ionizzazione-spettrometria di massa (LC-ESI-MS/MS). SM è un comuni sfingolipidi formato da un fosforilcolina e una ceramide come le componenti idrofile e idrofobe, rispettivamente. Un numero di specie di SM è presente in cellule di mammiferi a causa di una varietà della sfingoide lunga catena base (LCB) e un N-frazione di acil nella ceramide. In questo rapporto, indichiamo un metodo per stimare il numero di carbonio e legami doppi in un LCB e un N-frazione di acil basato su loro corrispondenti ioni prodotto negli esperimenti di MS/MS/MS (MS3). Inoltre, presentiamo un metodo di analisi quantitativa per SM usando due isotopicamente etichettato SM specie stabili, che facilita la determinazione l'intervallo utilizzato nella quantificazione di SM. Il presente metodo sarà utile nella caratterizzazione di una varietà di specie di SM in campioni biologici e prodotti industriali come cosmetici.
Introduction
Sfingomielina (SM) è un comuni sfingolipidi in cellule di mammifero. SM è sintetizzato intracellulare1 e presente come precursore per altri sfingolipidi come un sfingosina-1-fosfato e una ceramide, che hanno un ruolo cruciale nella immunitario cellulare traffico e omeostasi della barriera, rispettivamente2, la pelle 3. Pertanto, l'analisi precisa del metabolismo SM è importante per chiarire i ruoli fisiologici e patologici degli sfingolipidi.
SM è composto di una ceramide e un fosforilcolina che è collegato al 1-idrossi gruppo di ceramide, che ulteriormente si compone di un sfingosina e un N-frazione di acil. Una varietà nei numeri carbonio e doppio legame nella sfingosina e N-frazione di acil risultati nelle specie numero di ceramide (e SM). Gli avanzamenti recenti nella LC-ESI-MS/MS ha permesso un'analisi quantitativa e qualitativa di SM4,5. Nell'analisi qualitativa, il numero di carbonio e doppi legami di un sfingoide LCB di SM è stati identificati tramite l'assegnazione di spettri di ioni prodotto di LCB. Tuttavia, informazioni strutturali della N-frazione di acil non è stata ottenuta direttamente perché non sono stati segnalati relativi ioni prodotto corrispondente e quindi N-moiety acil sono state dedotte da analisi differenziale tra ioni precursori e ioni di prodotto corrispondente a LCB in entrambi ioni positivi e negativi modalità4,5. In questo rapporto, presentiamo un metodo per rilevare gli ioni prodotto di LCB e di N-frazione di acil simultaneamente in modalità di3 MS utilizzando triplo quadrupolo e spettrometria di massa quadrupole lineare trappola ionica, che facilita la precisa strutturale speculazioni di ogni specie di SM6.
Gli effetti di soppressione (o aumento) di ioni causati dalla matrice in campioni biologici ostacolano la quantificazione accurata in analisi LC-ESI-MS e pertanto, è auspicabile per costruire curve di calibrazione per tutti gli analiti di interesse nella matrice identica del campione biologico. Tuttavia, questa strategia non è fattibile perché è quasi impossibile preparare tutte le specie di SM nei campioni biologici, soprattutto in un'analisi completa. Così, è pratico costruire una curva di taratura e determinare l'intervallo quantitativa mediante una specie rappresentativa di SM a spillo nei campioni biologici. Abbiamo usato due specie di SM isotopicamente etichettato per costruire una curva di taratura; uno è stato usato per uno standard interno e l'altro per uno standard composto. Abbiamo rilevato una piccola quantità di specie di SM isotopicamente etichettato come un composto standard a spillo in campioni biologici e ottenuto con successo una curva di calibrazione e la gamma quantitativa6.
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Protocol
Consultare tutte le schede di dati di sicurezza (MSDS) prima dell'uso. Indossare guanti per ridurre al minimo la contaminazione del campione di pelle-derivato SM. Il presente protocollo è stato applicato alle cellule HeLa sviluppate in minimo essenziale supplementato dell'Aquila con 10% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutammina, 1.000 U/L penicillina e streptomicina 100 mg/L.
1. preparazione dei campioni del lipido
Nota: È importante che tutte le Vetrerie artistiche tra cui provette con tappo a vite in Teflon-foderato essere privo di detersivo.
- Estrazione della frazione lipidica totale da omogeneato cella utilizzando il metodo Bligh & Dyer7
- Rimuovere la cultura (o condizionata) media dalla piastra di coltura di tessuto di 10 cm e sciacquare due volte con 6 mL di PBS ghiacciata.
- Aggiungere 1 mL di PBS ghiacciata nella piastra di coltura del tessuto 10 cm mediante pipetta P1000. Raccogliere le cellule con raschietti di cella e raccogliere in tubi di plastica siliconate 2,0 mL.
- Dopo la centrifugazione (1.000 × g, 5 min, 4 ° C), è necessario eliminare il surnatante mediante una pipetta P1000.
- Aggiungere 1 mL di metanolo. Vortice tubi brevemente e Sonicare a 200 W per 5 min in un sonicatore bagno-tipo.
Nota: Regolare il livello dell'acqua in un sonicatore bagno-tipo in modo che il pellet cellulare in modo efficiente è omogeneizzato. - Trasferire l'omogenato di cella in metanolo mediante pipetta in provette (13 x 100 mm) con tappo a vite Teflon-allineato.
- Aggiungere 1 mL di metanolo, 1 mL di cloroformio, 0,8 mL di acqua distillata doppia e 50 µ l di 10 µmol/L di standard interno d18:1 /(D31)-16:0 SM in ogni provetta.
- Vortice provette vigorosamente per 5 min a temperatura ambiente.
Nota: A questo punto, una sola fase (cloroformio/metanolo/acqua = 1/2/0,8 (v/v/v)) è formata. - Aggiungere 1 mL di cloroformio e 1,0 mL di acqua distillata doppia.
- Tubi di vortice vigorosamente a 2.500 rpm per 5 min a temperatura ambiente.
Nota: A questo punto, l'acquoso fase (superiore) e la fase organica (inferiore) è separato. - Dopo la centrifugazione (2.150 × g, 5 min, 25 ° C), raccogliere e trasferire la fase inferiore in provette monouso (fase iniziale inferiore).
Nota: Raccogliere la fase inferiore utilizzando una pipetta di Pasteur e di un filtro di pipetta di sicurezza. Inserire la punta della pipetta nella fase inferiore, comprimere il bulbo piccolo accanto la valvola 'E' di fornire la fase superiore e lanugine interfacciale dentro la punta della pipetta e poi sifone la fase inferiore nella pipetta. - Aggiungere 2 mL di cloroformio nelle provette e vortexare i tubi vigorosamente a 2.500 rpm per 5 min a temperatura ambiente per sufficientemente mescolare con la fase superiore e lanugine interfacciale.
- Dopo la centrifugazione (2.150 × g, 5 min, 25 ° C), raccogliere e trasportare la fase inferiore modificata nelle provette di vetro monouso con la fase iniziale inferiore come descritto nel passaggio 1.1.10.
- Posizionare i tubi di vetro sotto un flusso di azoto e rimuovere completamente i solventi organici nella fase inferiore raccolta.
- Ricostituire i campioni con 500 µ l di metanolo o etanolo, filtrato con un filtro di 0,02-µm e memorizzare in fiale di vetro a-20 ° C.
- Preparazione del campione per costruire la curva di calibrazione e la validazione del metodo
- Aggiungere 50 µ l di 0,1, 0,5, 1, 5, 10 o 50 µmol/L del composto standard (d18:1 /(D9)-18:1 SM) in provette con tappo a vite Teflon-allineato.
- Aggiungere cella omogeneato in ogni provetta e aggiungere 1 mL di metanolo.
Nota: La quantità di omogenato di cella come una matrice varia secondo ogni esperimento. Se le specie di SM nei campioni derivati da cellule in un piatto di 10 cm cultura ordinariamente sono analizzate, la quantità di omogenato di cella in ogni provetta dovrebbe essere simile a quello delle cellule in una piastra di coltura di 10 cm. - Estrarre la frazione lipidica totale come descritto nella procedura 1.1.6-1.1.14.
- Preparare il controllo qualità (QC) campioni per la convalida del metodo, come descritto nella procedura 1.2.1-1.2.3. Preparare i campioni con differenti concentrazioni di standard composto tre-QC (d18:1 /(D9)-18:1 SM): uno all'interno di 3 x il limite inferiore della curva standard (QC-basso, QC-L), uno vicino al centro (QC-middle, QC-M) e uno vicino al confine superiore della curva standard (QC-alta, QC-H).
2. SM analisi mediante LC-ESI-MS/MS
- Preparazione della fase mobile
- Mescolare i solventi (acetonitrile/metanolo/ddH2O = 2/2/1 (v/v/v) per la fase acquosa e isopropanolo per la fase organica) in bottiglie di vetro con tappi a vite Teflon-allineato e Sonicare per 5 min in un sonicatore bagno-tipo.
- Aggiungere acido formico (concentrazione finale 26,4 mmol/L) e NH4OH (14,9 mmol/L) in ogni fase mobile.
- Analisi qualitativa di SM da LC-ESI-MS3
- Attivare il sistema di cromatografia liquida (HPLC) ad alte prestazioni, mettere i tubi di aspirazione in bottiglie di vetro contenenti fasi mobili e pulire le linee di HPLC. Collegare una colonna HPLC di18 C (1,5 mm i.d. × 100 mm lunghezza, particella 3.0 µm) per il sistema HPLC, mantenere la temperatura nel forno a colonna a 50 ° C e condizionare la colonna con la fase mobile acquosa a 100 µ l/min., mettere i campioni in un rack di campione nella autosampl er.
- Impostare i parametri del sistema di spettrometria di massa quadrupole lineare trappola ionica per analisi di3 MS come elencato nella tabella 1 e tabella 2 così come il precursore di primo e secondo gli ioni delle specie di interesse SM e triplo quadrupolo.
- Fare doppio clic sull'icona del software per l'acquisizione dati, fare doppio clic su 'Configurazione Hardware', selezionare 'LC + QTRAP4500 + valvola' e fare clic su 'Attiva profilo'.
- Creare una nuova sottocartella facendo clic su 'Nuovo sottoprogetto' e 'OK'.
- Fare clic sulla scheda 'file', selezionare 'Nuovo' e selezionare 'Acquisizione Metodo' e 'OK'. Clicca sull'icona 'Spettrometro di massa' e 'MS' scheda selezionare Scan tipo come 'MS/MS/MS (MS3)', velocità di scansione come Da 10.000/s, polarità come 'Negativo' e 'Durata' come tutto il tempo per essere analizzati (min). Impostare il m/z del 'Start (Da)' e 'Stop (Da)' come l'intervallo da analizzare. Impostare il m/z degli ioni del precursore di 1a e 2a del bersaglio specie di SM di interesse.
Nota: Per analizzare più specie di SM, evidenziare la '-MS3' icona, fare clic destro, selezionare 'Copia questo esperimento' e poi mettere la m/z degli ioni del precursore 1 ° e 2 ° di altre specie di SM. - Selezionare la scheda 'Avanzate MS' e impostare ogni parametro come segue: modalità di scansione come 'Profilo', dimensioni di passaggio come 0,12 (Da), risoluzione Q1 e Q3 'Unità' e 'Illuminato', rispettivamente, soglia di intensità come 0, tempo di impostazione come 50 (ms), pausa tra intervalli di massa come 1,5 ms, selezionare ' dinamica riempire il tempo ', Q3 barriera all'ingresso come 8 V e il tempo di eccitazione come 25 ms.
- Fare clic sul pulsante 'Modifica parametri' nella scheda 'MS' e selezionare 'origine/Gas' Tab. impostare i parametri della tenda gas, gas di collisione, ionspray tensione, temperatura, ione fonte gas1 e gas2 come elencato nella tabella 1. Quindi selezionare la scheda 'Compound' impostare i parametri del declustering potenziale, potenziale ingresso, energia di collisione, energia di eccitazione e l'energia di collisione diffondere come elencato nella tabella 2.
- Evidenziare 'Valvola integrata Valco' e selezionare 'Posizione nome per passo 0' come A impostare 'B' come posizione per totale tempo 5,0 min. Anche impostare 'A' come posizione per totale tempo 70,0 min.
- Evidenziare 'Shimadzu LC sistema'. Selezionare la scheda 'Pompa' e impostare la modalità di pompaggio come flusso binario, flusso totale come 0,28 mL/min e massimo di limiti di pressione come 20.0 MPa. Selezionare la scheda 'Autocampionatore' e impostare il volume di risciacquo fino a 200 µ l, ago colpo come 52mm, risciacquo velocità come 35 µ l/s, velocità come 5,0 µ l/s di campionamento, eliminare tempo come 25,0 min, sciacquare tuffo tempo come 5 s e modalità di risciacquo come 'Prima e dopo l'aspirazione'.
- Inoltre, attivare il refrigeratore, impostare la temperatura di raffreddamento fino a 4 ° C e la corsa di ago flacone di controllo come 52 mm. Selezionare la scheda 'Forno', abilitare il forno e impostare la temperatura del forno e la temperatura massima di 50 ° C e 85 ° C, rispettivamente.
- Selezionare la scheda 'Controller' e spunta la casella 'Accendere'. Selezionare la scheda 'Time Program' e impostare come segue i gradienti di solventi: solventi A / B con un rapporto di 100/0 per 5 min, programma lineare alterazioni a 80/20 in 4 minuti, fino a 35/65 in 50 minuti e a 25/75 in seguito oltre 1 min. , li tengono a 25/75 per 10 min, poi linearmente a 100/0 oltre 4 min. Quindi salvare il metodo.
- Creare file batch
- Fare doppio clic sull'icona 'Costruire acquisizione Batch', fare clic su 'Aggiungi Set', 'Aggiungi Samples', impostare il numero di nuovi campioni e fare clic su 'OK'.
- Fare clic sul pulsante ' Method Editor' e selezionare il metodo da utilizzare. Se più metodi sono utilizzati in un file batch, selezionare la casella di 'Uso più metodi' e selezionare il metodo di acquisizione per ogni campione. Rinominare ' campione ', impostare il numero appropriato per 'Flaconcino posizione' e mettere la quantità di volume di iniezione. Quindi salvare il file batch.
- Ottenere il prodotto di3 MS ione spettri delle specie di interesse SM di analisi LC-ESI-MS3
- Selezionare la scheda 'Invia' in file batch, evidenziare la riga di campioni da analizzare e fare clic sul pulsante 'Invia'.
- Scegliere il ' vista que ', 'Equilibrato' icona, selezionare il metodo di acquisizione da utilizzare, impostare ora come 1 min e fare clic su 'OK'.
- Disattivare 'Strumenti di riserva per Tuning' facendo clic sull'icona corrispondente. Quindi eseguire sequenza batch facendo clic sull'icona 'Avvia Sample'.
- Assegnare ogni MS3 spettri di ioni prodotto della ESM confrontando la massa per caricare il rapporto (m/z) del prodotto spettri dello ione e la massa esatta della sfingoide LCB e N-frazione dell'acilico di interesse. Determinare il numero di atomi di carbonio e doppia obbligazioni nello sfingoide LCB e N-frazione di acil secondo gli ioni prodotto corrispondente.
- Verificare che sia selezionata la cartella appropriata sotto-progetto, quindi fare doppio clic sull'icona 'Apri File di dati' e selezionare i campioni da analizzare. Trascinare il picco nel cromatogramma per ogni specie di SM di destinazione e quindi fare doppio clic. Saranno presentati gli ottenuti spettri dello ione prodotto di3 MS entro l'area trascinata.
- Analisi quantitativa di SM da LC-ESI-MS/MS
- Impostare le fasi mobili e colonna HPLC come descritto al punto 2.1 e 2.2.1.
- Impostare i parametri del sistema di spettrometria di massa quadrupolo lineare trappola ionica per monitoraggio analisi (MRM) come indicato nella tabella 1 e tabella 2multiple della reazione e triplo quadrupolo.
- Effettuare le procedure come descritto al punto 2.2.2.1 e 2.2.2.2.
- Fare clic sulla scheda 'file', selezionare 'Nuovo' e selezionare 'Acquisizione Metodo' e 'OK'. Clicca l'icona 'Spettrometro di massa' e 'MS' scheda selezionare Scan tipo come 'MRM', 'Positivo' la polarità. Impostare 'Durata' come tutto il tempo per essere analizzati. Impostare il m/z [M + H]+ e 184 come 'Q1 massa (Da)' e 'Q3 massa (Da)' del bersaglio specie di SM di interesse, rispettivamente. Impostare 'Tempo' come 10 ms e 'ID' come il nome della destinazione specie di SM.
- Selezionare la scheda 'Avanzate MS' e impostare ogni parametro come segue: entrambi la risoluzione Q1 e Q3 come 'Unit', soglia di intensità come 0, impostazione ora come 0 (ms) e pausa tra intervalli di massa come 5 ms.
- Fare clic sul pulsante 'Modifica parametri' nella scheda 'MS' e selezionare la scheda ' Origine/Gas' inserire il parametro di tenda gas, gas di collisione, ionspray tensione, temperatura, ione fonte gas1 e gas2 come elencato nella tabella 1. Quindi selezionare la scheda 'Compound' mettere i parametri di declustering potenziale, ingresso potenziale, energia di collisione e potenziale di uscita di cella di collisione come elencato nella tabella 2.
- Impostare la valvola come descritto nel passaggio 2.2.2.6.
- Impostare la condizione di LC come descritto nel passaggio 2.2.2.7. Quindi salvare il metodo.
- Creare il file batch come descritto al punto 2.2.3.
- Ottenere i dati di gestione record di messaggistica di ogni specie di SM da analisi LC-ESI-MS/MS come descritto al punto 2.2.4.
- Elaborare i dati di gestione record di messaggistica utilizzando il software per l'integrazione dei dati e ottenere i dati dell'area di picco per il cromatogramma di ioni estratti di ciascuna specie di SM.
- Fare doppio clic sull'icona del software per l'integrazione di dati in analisi quantitativa, fare clic sulla scheda 'Edit' e selezionare impostazioni predefinite utente integrazione. Impostare larghezza liscio gaussiana come 1,0 punto e fare clic su 'OK'. Fare clic sulla scheda 'Edit' e selezionare 'Nuova tabella risultati'. Selezionare il campione per essere integrato, fare clic su un pulsante freccia e fare clic su 'Avanti'. Selezionare 'Crea nuovo metodo', impostare il nome del metodo e fare clic su 'Avanti'. Fare clic su 'Avanti' e selezionare la casella di d18:1 /(D31)-16:0 SM così com'è, fare clic su 'Avanti' e fare clic su 'Fine'.
- Fare clic su 'Visualizza la recensione di picco' e confermare che i picchi del cromatogramma sono riconosciuti in modo appropriato. Va notato che il tempo di ritenzione di d18:1 /(D31)-16:0 SM è solitamente più piccolo di ~ min 0,3 rispetto a quella del MS 34-1 (di solito consiste di d18:1 / 16:0 SM).
- Quantificare ogni specie di SM in base al rapporto del picco di ciascuna specie SM d18:1 /(D31)-16:0 standard interno di SM.
- Fare clic sulla scheda 'File', selezionare 'Esporta', selezionare 'Risultati Table', confermare il formato come 'MultiQuant', 'Esporta tutte le colonne' di colonne, righe come 'Esporta tutte le righe ad eccezione di quelli esplicitamente nascosti' e quindi fare clic su 'OK'.
- Aprire il file esportato nel software Excel. Normalizzare l'area del bersaglio specie SM per la zona di IS (d18:1 /(D31)-16:0 SM). Quindi moltiplicare per l'importo teorico dell'IS nel campione iniettato per calcolare la quantità di bersaglio specie di SM nel campione iniettato.
- Costruire la curva standard
- Ottenere i dati di gestione record di messaggistica di d18:1 /(D9)-18:1 SM e d18:1 /(D31)-16:0 SM nei campioni per costruire la curva standard di analisi LC-ESI-MS/MS come descritto nel passo 2.3.1-2.3.4.
- Ottenere i dati della zona di picco di d18:1 /(D9)-18:1 SM e d18:1 /(D31)-16:0 SM come descritto al punto 2.3.5.
- Calcolare la quantità di d18:1 /(D9)-18:1 SM nel campione iniettato come descritto nel passo 2.3.6.
- Costruire la linea di tendenza impostando l'asse x e y come l'importo nominale e la quantità calcolata di d18:1 /(D9)-18:1 SM e ottenere la formula di linea di tendenza.
- Convalida del metodo quantitativo utilizzando Excel software
- Per la convalida del metodo, quantificare la quantità di d18:1 /(D9)-18:1 SM e d18:1 /(D31)-16:0 SM in QC campioni analizzando ogni QC assaggiare almeno tre volte in un giorno e ripetere almeno 3 giorni come descritto nel passo 2.3.1-2.3.4.
- Ottenere i dati di zona di picco e calcolare la quantità di d18:1 /(D9)-18:1 SM nel campione iniettato come descritto nel passo 2.3.5 e 2.3.6.
- Secondo la curva di calibrazione ottenuta, calcolare la quantità di d18:1 /(D9)-18:1 SM nel campione iniettato.
- Valutazione di precisione
- Calcolare la media e la deviazione standard della quantità di d18:1 /(D9)-18:1 SM ottenuti nel passaggio 2.5.3 sul set di dati del giorno intra- e Inter-day utilizzando Excel software.
- La media ottenuta al passaggio 2.5.4.1 è divisa per la deviazione standard ed espresso in %.
- Valutazione dell'accuratezza
- Calcolare la precisione di ogni dati come segue:
[(L'importo calcolato ottenuto nel passaggio 2.5.3.) / (Importo nominale) - 1] × 100(%) - Calcolare la media del valore assoluto della precisione sul set di dati del intra- e Inter-giorno.
- Calcolare la precisione di ogni dati come segue:
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Representative Results
Sintetizzato chimicamente d18:1 / 24:0 SM (Figura 1A) e d18:1 / 24:0 SM in campioni di lipidi estratti da cellule HeLa (Figura 1B) sono stati analizzati da LC-ESI-MS che impiegano3 [M + HCOO]– e [M-CH3]- come ioni precursori di primo e secondo, rispettivamente. Si noti che l'intensità dello spettro di demetilato-sphingosylphosphorylcholine (SPC) (m/z 449) è più grande di quello della SM N-frazione dell'acilico (m/z 378). In aggiunta, lo spettro corrispondente a [M-Colina-CH3 (sfingosina-1-fosfato)]– è anche utile per assegnare il LCB di ESM. Inoltre abbiamo confermato che lo spettro del demetilato-SPC (m/z 449) pricipalmente è prodotto da d18:1 SPC sotto la condizione della nostra analisi di3 MS (Figura 1C).
La curva di calibrazione utilizzando due-isotopicamente etichettato SM specie è stata mostrata in Figura 2A. La linea di tendenza è stata ottenuta applicando 1 / x2come il fattore di ponderazione. Il risultato dell'analisi residua è stato mostrato in Figura 2B. Si noti che il valore residuo vicino al limite inferiore di quantizzazione (0,1 pmol in questo studio presente) era più piccolo applicando 1 / x2come il fattore di ponderazione.
I parametri della curva di calibrazione ottenuta e il risultato della convalida sono stati indicati nella tabella 3. Il valore della precisione e accuratezza sono stati entro ± 15%, risultati che lo studio presente ha soddisfatto i criteri come un metodo di quantificazione mediante LC-MS8.
La quantità di ciascuna specie di SM nelle cellule HeLa è stata indicata nella tabella 4. Cellule HeLa sono state coltivate in terreno di coltura contenente 10% FBS e raccolto. D18:1 / 16:0 SM e d18:1 / 24:1 SM sono stati i secondo più abbondante e la maggior parte delle specie di SM cui struttura sono stati determinati e sono composti da 54% e 14% del totale SM, rispettivamente
Figura 1 . MS3 spettri dei segnali specifici m/z di SM in cellule HeLa. MS3 spettri di chimicamente sintetizzato d18:1 / 24:0 SM (A) e d18:1 / 24:0 SM in campioni di lipidi estratti da cellule HeLa (B) sono mostrati. I risultati sono stati adattati da Hama et al. 6 nota che l'intensità dello spettro del SPC è più grande di quello della N-frazione di acil mq. MS3 spettri di chimicamente sintetizzato d18:1 SPC sono mostrati in (C) impiegando gli ioni con identica m/z ([M + HCOO]-, m /z 499) come gli ioni di precursore di 1a e 2a. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Curve di calibrazione di SM utilizzando due specie di SM isotopicamente etichettato. (A) la curva di calibrazione utilizzando due-isotopicamente etichettato specie SM (d18:1 /(D9)-18:1 SM e d18:1 /(D31)-16:0 SM). Curve di calibrazione sono state costruite utilizzando il fattore di ponderazione = 1 /X2. I risultati della convalida sono riportati nella tabella 3. (B) analisi residua per la valutazione della bontà di una curva di calibrazione costruita. I residui della curva di calibrazione utilizzando il fattore di ponderazione = 1 /X2 è più piccolo di quelli che utilizzano il fattore di ponderazione = 1 / x o 1, soprattutto in una quantità inferiore di d18:1 /(D9)-18:1 mq. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questo figura.
| TurboIonSpray impostazioni | ||||||
| Modalità | Tenda Gas (psi) | Gas di collisione | tensione di spruzzo dello ione (V) | Temperatura (° C) | gas di origine dello ione 1 (psi) | gas di origine dello ione 2 (psi) |
| MS3 | 40 | Alta | -4500 | 200 | 40 | 80 |
| GESTIONE RECORD DI MESSAGGISTICA | 40 | 10 | 5500 | 300 | 40 | 80 |
Tabella 1. Le condizioni della sorgente di ioni electrospray utilizzati per l'analisi qualitativa e quantitativa. Questa tabella è stata adattata da Hama et al. 6
| modalità | polarità | ione precursore (Q1) | ione del prodotto o 2 ° ione precursore (Q3) | Declustering potenziale (V) | ingresso potenziale (V) | energia di collisione (V) | potenziale di collisione cellula uscita (V) | energia di collisione diffusa (V) | Tempo di eccitazione (ms) | Velocità (Da/sec) | tempo (s) | risoluzione |
| GESTIONE RECORD DI MESSAGGISTICA | positivo | [M + H] + | 184 | 1 | 10 | 35 | 12 | - | - | - | 5.364 | Unità |
| MS3 | negativo | [M + HCOO] - | M-15 | -26 | -10 | -40 | - | 0 | 25 | 10000 | automaticamente calcolata da | Unità |
Tabella 2. I parametri di MS3 e modalità di gestione record di messaggistica in triplo quadrupolo e presa Quadrupole lineare dello ione di massa spettrometria utilizzata rispettivamente per l'analisi qualitativa e quantitativa,. Questa tabella è stata adattata da Hama et al. 6
Tabella 3. I parametri della curva di calibrazione ottenuta e il risultato della convalida. I risultati sono stati adattati da Hama et al. 6
| specie molecolari di SM | importo (pmol/mg di proteina) |
| D18:1 / 14:0 | 115,5 |
| D16:1 / 16:0 | 115,5 |
| D17:1 / 16:0 | 239.8 |
| D18:2 / 16:0 | 449.9 |
| D18:1 / 16:0 | 3355.1 |
| D18:0 / 16:0 | 203,8 |
| D18:1 / 17:0 | 106.3 |
| D18:2 / 18:0 | 26,5 |
| D20:0 / 16:1 | 94.9 |
| D18:1 / 18:0 | 94.9 |
| D18:2 / 22:0 | 102.3 |
| D18:1 / 22:0 | 235 |
| D18:1 / 23:1 | 83,3 |
| D18:1 / 23:0 | 23,9 |
| D18:1 / 24:2 | 286,5 |
| D18:2 / 24:1 | 286,5 |
| D18:1 / 24:1 | 853,2 |
| D18:1 / 24:0 | 94,6 |
| D18:1 / 25: 1 | 12,9 |
Tabella 4. La quantità di ciascuna specie di SM in cellule HeLa. Cellule HeLa sono state coltivate in terreno di coltura contenente 10% FBS. Le cellule sono state raccolte, e frazione lipidica totale è stato estratto con metodo Bligh & Dyer. I risultati sono stati adattati da Hama et al. 6
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Discussion
Nel presente metodo qualitativo, abbiamo ottenuto MS3 ioni prodotto di un SPC e un N-frazione di acil. È fondamentale per assegnare correttamente sia un SPC e un N-frazione di acil. A tal fine, si deve osservare che altre molecole contenenti fosforilcolina possono anche essere rilevati come gli ioni prodotto di3 MS. Diacil-fosfatidilcolina (PC) e del plasmalogeno-PC sono abbondantemente presenti in cellule di mammifero, e loro idrofobicità è simile a quello della SM. Di conseguenza, diacil-PC e PC plasmalogeno con un isotopo (solitamente 13C) possono essere teoricamente rilevati simultaneamente con SM. Nei nostri esperimenti, gli ioni di prodotto3 MS del plasmalogeno-PC simultaneamente sono stati osservati nell'analisi SM. È utile selezionare correttamente gli ioni di prodotto3 MS di SM di sapere che l'intensità dello spettro del SPC è più grande di quello della SM N-frazione dell'acilico (Figura 1A e B). Al contrario, l'intensità di grassi acil-frazione è più grande (o quasi identico) che del PC demethylated lysoplasmalogen (dati non mostrati).
Nel presente metodo quantitativo, è fondamentale per preparare proprio campioni per costruire la curva di calibrazione e la validazione del metodo. Inoltre, il fattore di ponderazione deve essere correttamente utilizzato per costruire la curva di taratura; è utile migliorare la curva di raccordo soprattutto a bassa concentrazione. Abbiamo confrontato le curve di calibrazione utilizzando i fattori di ponderazione diversa. La curva di raccordo a bassa concentrazione è stata chiaramente migliorata utilizzando il fattore di ponderazione = 1 / x2 rispetto a quella con il fattore di ponderazione = 1 o 1 / x (Figura 2B). Il valore della precisione e accuratezza deve essere entro ± 15%. Se la concentrazione del QC-L è identica al limite inferiore della curva standard (limite inferiore di quantificazione), dovrebbe essere entro ± 20%8.
Abbiamo impiegato il metodo Bligh & Dyer per estrarre la frazione lipidica totale da cellule coltivate in questo studio. Altri metodi per l'estrazione dei lipidi ad esempio il metodo Folch sono anche utili9. È importante per estrarre la frazione lipidica utilizzando il metodo appropriato secondo la quantità e/o proprietà dei campioni. Il numero di specie di SM analizzati simultaneamente in ogni iniezione non deve essere troppo grande per evitare un sovraccarico del software per l'acquisizione dati. La MRM pianificata sarà utile per quantificazione simultaneamente un numero di specie di SM.
Il nostro metodo presente utilizzando MS3 analisi è utile per speculare il numero di carbonio e doppi legami di LCB e N-frazione dell'acilico di SM senza dispositivi aggiuntivi. Tuttavia, non è possibile ottenere altre informazioni strutturali come la posizione dei doppi legami, isomero (cis o trans) e forma (dritto o ramificata). È necessario utilizzare maggiore energia per ottenere ioni prodotto e le informazioni strutturali utilizzando strumenti supplementari10,11,12,13. La formula molecolare degli ioni prodotto corrispondente a N-moiety acil era [RCO2] ioni di– non contenenti azoto. Non è attualmente noto come la collisione indotta dissociazione proventi.
Per analisi di3 MS, è importante regolare i parametri dell'energia di collisione (CE) e tempo di eccitazione per MS3 frammentazione (ExT). Un più alto CE verrà causare la frammentazione in eccesso e ridurre l'intensità dello ione prodotto della ESM demethylated come lo ione precursore 2nd . Inoltre, il modello di frammentazione dipende significativamente dalla porta EXT. Prima degli esperimenti, è opportuno determinare la condizione appropriata del CE ed ExT che massimizzare l'intensità degli ioni prodotto del demethylated SM, SPC e N-frazione di acil infondendo SM sintetico sciolto in fasi mobili.
Abbiamo usato d18:1 /(D9)-18:1 SM e d18:1 /(D31)-16:0 SM come due specie di SM isotopicamente etichettato per costruire la curva di calibrazione. L'efficienza di ionizzazione può variare a seconda della specie di SM e la condizione della fase mobile. Così, se il numero di SM di interesse è limitato, è preferibile preparare la specie di SM isotopicamente etichettato di interesse per più accurata quantificazione.
La struttura di SM è stata determinata finora secondo lo ione precursore e lo ione prodotto corrispondente demethylated SPC. Inoltre, essa è stata a volte ostacolata per determinare precisamente il limite inferiore di quantificazione nella matrice del campione di presenza, poiché i composti target di interesse erano abbondantemente presenti nella matrice del campione.
Lo studio presente è utile per stimare il numero di carbonio e di legami doppi in un LCB e un N-frazione di acil basato su loro corrispondenti ioni prodotto in MS3 esperimenti senza ulteriori strumenti. Inoltre, presentiamo un metodo di analisi quantitativa per SM usando due isotopicamente etichettato SM specie stabili, che facilita la determinazione l'intervallo utilizzato nella quantificazione di SM. Il presente metodo sarà utile nella caratterizzazione di una varietà di specie uniche di SM in vari campioni biologici e prodotti industriali.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da un assegno di ricerca dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia del Giappone (KAKENHI) a K.H. (#15 K 01691), Y.F. (#15 K 08625), K.Y. (#26461532) e una sovvenzione per lo studio del progetto di malattia intrattabile dal Ministero dell'economia Salute, lavoro e Welfare (K.Y. n. 201510032A). Ringraziamo il gruppo Esposito (www.edanzediting.com/ac) per la modifica di un progetto di questo manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100 mm tissue culture dish | IWAKI | 3020-100 | |
| Cell scraper | IWAKI | 9000-220 | |
| Siliconized 2.0 mL tube | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Test tube | IWAKI | TST SCR 16-100 | |
| Teflon-lined screw cap | IWAKI | 9998CAP415-15 | |
| Disposable glass tube | IWAKI | 9832-1310 | |
| CAPCELL PAK C18 ACR 3 µm 1.5 mm I.D. x 100 mm | Shiseido | 92223 | Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column |
| CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE | Shiseido | 12197 | |
| Cartridge holder | Shiseido | 12415 | |
| Acetonitrile | Wako | 018-19853 | |
| 2-Propanol (Isopropyl Alcohol) | Wako | 161-09163 | |
| Methanol | Wako | 134-14523 | |
| Formic acid | Wako | 066-00466 | |
| 28% Ammonia water | Wako | 016-03146 | |
| Sonicator (bath type) | SHARP | UT-206H | |
| Vortex mixer for glass test tube | TAITEC | Mix-EVR | |
| 1.4 mL glass vial | Tomsic | 500-1982 | Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20°C |
| 8 mm septum | Tomsic | 200-3322 | When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum |
| Screw cap for 1.4 mm glass vial | Tomsic | 500-2762 | |
| Screw cap with slit septum | Shimadzu GLC | GLCTV-803 | |
| PVDF 0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
| Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry | SCIEX | QTRAP4500 | |
| The software for data acquisition and analysis of product ion spectra | SCIEX | Analyst | |
| The software for data integration in quantitative analysis | SCIEX | MultiQuant | |
| HPLC system | Shimadzu | Nexera | |
| Glass bottle | Sansyo | 85-0002 | |
| d18:1/24:0 sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860592P | |
| Sphingosylphosphorylcholine | Merck | 567735 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| L-glutamine | ThermoFisher | 25030081 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Eagle’s minimum essential medium | Sigma | M4655 |
References
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