Summary
Hier presenteren we een protocol te kwantificeren en kwalificeren van elke soort van de sphingomyelinase met behulp van meerdere reactie controle en MS/MS/MS mode, respectievelijk.
Abstract
Presenteren we een methode voor het analyseren van sphingomyelinase (SM) kwalitatief en kwantitatief door vloeibare chromatografie-electrospray ionisatie-tandem massaspectrometrie (LC-ESI-MS/MS). SM is een gemeenschappelijk sfingolipiden samengesteld uit een phosphorylcholine en een ceramide als de hydrofiele en hydrofobe component, respectievelijk. Een aantal soorten SM in zoogdiercellen wegens een verscheidenheid in de sphingoid lange keten base (LCB) aanwezig zijn en een N-acyl deel in het ceramide. In dit verslag, tonen we een methode voor het schatten van het aantal koolstof en dubbele bindingen in een LCB en een N-acyl groep op basis van hun overeenkomstige product-ionen in MS/MS/MS (MS3) experimenten. Daarnaast presenteren wij een kwantitatieve analysemethode voor SM met behulp van twee stabiele ionenpaar gelabelde SM soorten, dat vergemakkelijkt het meetbereik in SM kwantificatie bepalen. De huidige methode zal zitten nuttig in karakterisering van een verscheidenheid van SM soorten in biologische monsters en industriële producten zoals cosmetica.
Introduction
Sphingomyelinase (SM) is een gemeenschappelijk sfingolipiden bij zoogdiercellen. SM is gesynthetiseerde intracellulair1 en heden als een voorloper voor andere sfingolipiden zoals een sphingosine-1-fosfaat en een ceramide, die hebben een cruciale rol in immuun cel mensenhandel en huid barrière homeostase, respectievelijk2, 3. De nauwkeurige analyse van de SM-metabolisme is dus belangrijk voor het ophelderen van de functies van het fysiologische en pathologische van sfingolipiden.
SM is samengesteld uit een ceramide en een phosphorylcholine die is gekoppeld aan de 1-hydroxy groep van het ceramide, dat verder uit een sphingosine en een N bestaat-acyl deel daarvan. Een verscheidenheid in de koolstof- en dubbele binding getallen in zowel de sphingosine en N-acyl deel daarvan resulteert in het aantal ceramide (en SM) soorten. Recente vooruitgang in LC-ESI-MS/MS heeft kwantitatieve en kwalitatieve analyse van SM4,5. In de kwalitatieve analyse, werd het aantal koolstof en dubbele bindingen van een sphingoid LCB van SM geïdentificeerd door product ion spectra van LCB toe te wijzen. Echter structuurgegevens van de N-acyl deel daarvan was niet direct verkregen omdat de bijbehorende product-ionen zijn niet gemeld, en dan ook N-acyl wordt werden afgeleid door differentiële analyse tussen voorloper ionen en product ionen overeenkomt met LCB in zowel positieve als negatieve ion modi4,5. In dit rapport presenteren we een methode voor het detecteren van de product-ionen van LCB zowel N-acyl groep gelijktijdig in MS3 modus met behulp van triple vierpolige en vierpolige lineaire ion trap massaspectrometrie, dat de precieze structuur vergemakkelijkt speculatie van elke SM soorten6.
De ion onderdrukking (of toebehoren) effecten, veroorzaakt door de matrix in biologische monsters belemmeren de nauwkeurige kwantificering in LC-ESI-MS-analyse, en daarom is het wenselijk voor de bouw van de kalibratiekrommen voor alle analyten van belang in de identieke matrix van het biologische monster. Deze strategie is echter niet haalbaar omdat het bijna onmogelijk om te bereiden alle SM soorten in biologische monsters, met name in de uitgebreide analyse is. Dus, het is praktisch om te bouwen van een kalibratiekromme en de kwantitatieve bereik met behulp van een representatieve soorten van de SM in de biologische monsters spiked bepalen. Wij twee ionenpaar-geëtiketteerden SM soorten gebruikt voor de constructie van een ijkcurve; een werd gebruikt voor een interne standaard en de andere voor een samengestelde norm. We een kleine hoeveelheid ionenpaar-geëtiketteerden SM soorten gedetecteerd als een standaard compound spiked in biologische monsters en verkregen met succes een kalibratiekromme en de kwantitatieve bereik6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Raadpleeg alle relevante veiligheidsinformatiebladen (MSDS) vóór gebruik. Draag handschoenen om te minimaliseren van monster besmetting door huid-afgeleide SM. Dit protocol werd toegepast op HeLa cellen gekweekt in Eagle's minimale essentiële medium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 1.000 U/L penicilline en streptomycine van 100 mg/L.
1. bereiding van de monsters van de lipide
Opmerking: Het is belangrijk dat alle glaswerk waaronder reageerbuisjes met Teflon beklede schroefdoppen wasmiddel-vrij zijn.
- Extractie van totale lipide breuk van cel homogenaat met behulp van de Bligh & Dyer methode7
- Verwijderen van de cultuur (of geconditioneerd) media van de 10-cm weefselkweek schotel en spoel tweemaal met 6 mL ijskoud PBS.
- Voeg 1 mL ijskoud PBS in de weefselkweek 10-cm schotel P1000 Pipetteer. Oogst van de cellen met cel schrapers en verzamelen in 2.0-mL gesiliconiseerd plastic buizen.
- Na het centrifugeren (1000 × g, 5 min, 4 ° C), verwijder het supernatant door een pipet P1000.
- Voeg vervolgens 1 mL van methanol. Vortex buizen kort en bewerk ultrasone trillingen ten bij 200 W gedurende 5 min. in een bad-type ultrasoonapparaat.
Opmerking: De waterstand in een bad-type ultrasoonapparaat zodanig aanpassen dat de cel pellet is efficiënt gehomogeniseerd. - Breng de cel homogenaat in methanol Pipetteer in proefbuizen (13 mm x 100 mm) met Teflon beklede schroefdeksels.
- Voeg vervolgens 1 mL van methanol, 1 mL chloroform, 0,8 mL dubbel gedestilleerd water en 50 µL van 10 µmol/liter voor interne standaard d18:1 /(D31)-16:0 SM in elke proefbuis.
- Vortex reageerbuisjes krachtig gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: op dit punt, een enkele fase (chloroform/methanol/water = 1/2/0.8 (v/v/v)) wordt gevormd. - Voeg vervolgens 1 mL chloroform en 1,0 mL dubbel gedestilleerd water.
- Vortex buizen krachtig bij 2500 rpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: op dit punt, de waterige fase van de (bovenste) en organische (lagere) fase zijn gescheiden. - Na het centrifugeren (2,150 × g, 5 min, 25 ° C), verzamelen en breng de lagere fase in wegwerp glazen buizen (lagere beginfase).
Opmerking: Verzamelen de lagere fase met behulp van een pipet van Pasteur en een pipet beveiligingsfilter. Breng de tip van de pipet in de lagere fase, knijp de kleine lamp naast de klep van de "E" om de bovenste fase en Interfaciale pluis binnen het uiteinde van de pipet te leveren, en vervolgens de lagere fase sifon in de pipet. - Voeg 2 mL chloroform in de reageerbuisjes, en vortex de buizen krachtig bij 2500 rpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te voldoende mengen met de bovenste fase en Interfaciale pluis.
- Na het centrifugeren (2,150 × g, 5 min, 25 ° C), verzamelen en breng de gemodificeerde lagere fase in de wegwerp glazen buizen met de lagere beginfase zoals beschreven in stap 1.1.10.
- Plaats de glazen buizen onder een stroom van stikstof en volledig verwijderen van de organische oplosmiddelen in de verzamelde lagere fase.
- Reconstrueren van de monsters met 500 µL van methanol of ethanol, filtraat met een 0.02-µm filter, en op te slaan in glazen flesjes bij-20 ° C.
- Bereiding van de monsters voor de bouw van de kalibratiekromme en valideren van de methode
- Voeg 50 µL van 0.1, 0.5, 1, 5, 10 of 50 µmol/liter standaard compound (d18:1 /(D9)-18:1 SM) in reageerbuisjes met schroefdoppen Teflon-bekleed.
- Voeg cel homogenaat in elke proefbuis en meng 1 mL methanol.
Nota: Het bedrag van de cel homogenaat als een matrix is afhankelijk van elk experiment. Als de SM soort in de monsters die zijn afgeleid van cellen in een schaal 10-cm cultuur routinematig worden geanalyseerd, moet het bedrag van de cel homogenaat in elke proefbuis dicht bij die van cellen in een cultuur van 10-cm schotel. - Pak de Fractie van de totale lipide zoals beschreven in stappen 1.1.6-1.1.14.
- Kwaliteitscontrole (QC) monsters voor de validatie van de methode, zoals lood in stappen 1.2.1-1.2.3 bereiden. Bereiden van drie QC-monsters met verschillende concentraties van standaard compound (d18:1 /(D9)-18:1 SM): een binnen 3 x de ondergrens van de standaard curve (QC-laag, QC-L), een in de buurt van het centrum (QC-midden, QC-M), en één in de buurt van de bovenste grens van de standaard curve (QC-hoog, QC-H).
2. SM analyse door LC-ESI-MS/MS
- Voorbereiding van de mobiele fase
- Meng de oplosmiddelen (acetonitril/methanol/ddH2O = 2/2/1 (v/v/v) voor de waterige fase en isopropanol voor de organische fase) in glazen flessen met Teflon beklede schroefdoppen en bewerk ultrasone trillingen ten gedurende 5 min. in een bad-type ultrasoonapparaat.
- Toevoegen van mierenzuur (eindconcentratie 26.4 mmol/L) en NH4OH (14.9 mmol/L) in elke mobiele fase.
- Kwalitatieve analyse van SM door LC-ESI-MS3
- De krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) systeem activeren, inlaat buizen gestoken door de glazen flessen waarin mobiele fasen en zuiveren de HPLC-lijnen. Een C18 HPLC-kolom (1,5 mm i.d. × 100 mm lengte, deeltje grootte 3.0 µm) een koppeling naar het HPLC-systeem, houden de temperatuur in de kolom oven bij 50 ° C en de conditie van de kolom met de mobiele waterfase bij 100 µL/min. de monsters gestoken een monster rek in de autosampl eh.
- Instellen van de parameters van de triple vierpolige en vierpolige lineaire ion trap massaspectrometrie systeem p.a. MS3 zoals vermeld in tabel 1 en tabel 2 , alsmede de voorloper van de eerste en tweede ionen van de SM-soorten van belang.
- Dubbelklik op het pictogram software voor data-acquisitie, dubbel klik op de 'hardwareconfiguratie', 'LC + QTRAP4500 + klep' te selecteren en klik op 'Profiel activeren'.
- Maak een nieuwe submap door te klikken op 'Nieuwe deelproject' en 'OK'.
- Klik op het tabblad 'bestand', selecteer 'Nieuw' en selecteer 'Overname methode' en 'OK'. Klik op het pictogram 'Massa Spec' en 'MS' tab. Selecteer Scan type als 'MS/MS/MS (MS3)', scannen tarief als 10.000 Da/s, polariteit als 'Negatief' en 'Duur' als de hele tijd te worden geanalyseerd (min). Stel de m/z van de 'Start (Da)' en 'Stop (Da)' als het bereik dat moet worden gescand. Stel de m/z van de voorloper van de 1ste en 2de ionen van het streefcijfer SM soorten van belang.
Opmerking: Als u wilt analyseren meerdere SM-soorten, Markeer de '-MS3' pictogram, klik met de rechtermuisknop, selecteer 'Kopiëren dit experiment' en zet dan de m/z van de 1ste en 2de voorloper ionen van andere soorten SM. - Selecteer het tabblad 'Geavanceerd MS', en elke parameter als volgt instellen: scanmodus als 'Profiel', stap-grootte als 0.12 (Da), resolutie Q1 en Q3 'Unit' en 'Verlichte', respectievelijk intensiteit drempel zo instelling tijd 0, 50 (ms), pauze tussen massa bereiken als 1,5 ms, selecteert u ' dynamische Vul de tijd ', Q3 toetredingsdrempel als 8 V, en excitatie tijd als 25 ms.
- Klik op de knop 'Parameters bewerken' in het tabblad 'MS' en selecteer 'bron/Gas' tab. Stel de parameters van de gordijn gas, botsing gas, ionspray spanning, temperatuur, ion bron gas1 en de gas2 zoals vermeld in tabel 1. Selecteer de tab 'Samengestelde' Stel de parameters van de declustering mogelijkheden, ingang potentieel botsing energie, excitatie energie en botsing energie verspreiden zoals vermeld in tabel 2.
- Markeer 'Geïntegreerde Valco klep' en selecteer 'Positie naam voor stap 0' als A en 'B' instellen als positie voor totaal 5.0 min tijd. Ook het instellen van 'A' als standpunt voor totaal 70,0 min tijd.
- Markeer 'Shimadzu LC systeem'. Selecteer het tabblad 'Pump' en stel pompen modus als binaire stroom, totale stroom als 0,28 mL/min en maximum van druk grenzen als 20,0 MPa. Selecteer het tabblad 'Autosampler' en het spoeldouche volume instellen als 200 µL naald lijn als 52 mm, spoelen als 35 µL/s snelheid, snelheid als 5.0 µL/s bemonstering, purge tijd 25.0 min, spoel duik tijd als 5 s, en spoelen modus als 'Voor en na aspiratie'.
- Daarnaast de koeler unit inschakelen, stellen de koelere temperatuur als 4 ° C en de controle flacon naald lijn 52 mm. Selecteer het tabblad 'Oven' inschakelen van de oven en bepalen de oventemperatuur en maximale temperatuur 50 ° C en 85 ° C, respectievelijk.
- Selecteer het tabblad 'Controller' en vink het vakje 'Inschakelen'. Selecteer het tabblad 'Programma' en stel de oplosmiddelen verlopen als volgt: oplosmiddelen A / B bij een verhouding van 100/0 voor 5 min, program lineaire aanpassingen tot en met 80/20 meer dan 4 min, tot en met 35/65 meer dan 50 min, en tot 25/75 meer dan 1 min. daarna , houd ze op 25/75 voor 10 min, dan lineair op 100/0 meer dan 4 min. Sla de methode.
- Maak batchbestand
- Dubbelklik op het pictogram 'Bouwen overname Batch', klikt u op ' Voeg toe ', 'Voeg monsters', stel het aantal nieuwe monsters, en klik op 'OK'.
- Klik op de knop ' Method Editor' en selecteer de methode moet worden gebruikt. Indien meerdere methoden worden gebruikt in een batch-bestand, schakel het selectievakje 'Gebruiken meerdere methodes' en selecteer de methode van de overname voor elk monster. Naam van ' monster ', het juiste nummer voor 'Vial positie' ingesteld en zetten de hoeveelheid geïnjecteerde volume. Sla de batch-bestand.
- Verkrijgen van het product van de3 MS ion spectra van de SM-soorten van belang door LC-ESI-MS3 analyse
- Selecteer het tabblad 'Verzenden' in batch-bestand, Markeer de regel monsters worden geanalyseerd, en klik op de knop 'Verzenden'.
- Klik op de '' weergave Quene' pictogram, pictogram 'Uitgebalanceerd', selecteer de methode van de overname worden gebruikt, het instellen van Time 1 min, en klik op 'OK'.
- Deactiveren 'Reserve Instrument voor Tuning' door te klikken op het bijbehorende pictogram. Vervolgens batch-reeks uitvoeren door te klikken op het pictogram "Start monster".
- Elke MS3 product ion spectra van de SM toewijzen door het vergelijken van de massa te rekenen verhouding (m/z) van het product ion spectra en de exacte massa van de sphingoid LCB en N-acyl deel daarvan van belang. Bepalen van het aantal koolstofatomen en dubbele obligaties in de sphingoid LCB en N-acyl deel daarvan volgens de bijbehorende product-ionen.
- Bevestig dat de juiste deelproject map is geselecteerd, klik tweemaal klikken het pictogram 'Open bestand' en selecteer de monsters te analyseren. Sleep de piek in het chromatogram voor elk doel SM soorten en vervolgens tweevoudig tikken. De verkregen MS3 product ion spectra binnen het versleepte gebied zal worden gepresenteerd.
- Kwantitatieve analyse van de SM door LC-ESI-MS/MS
- Stel de mobiele fasen en de HPLC-kolom zoals beschreven in stap 2.1 en 2.2.1.
- Instellen van de parameters van de triple vierpolige en vierpolige lineaire ion trap massaspectrometrie systeem voor meerdere reactie monitoring (MRM) analyse, zoals vermeld in tabel 1 en tabel 2.
- Het gedrag van de procedures zoals beschreven in stap 2.2.2.1 en 2.2.2.2.
- Klik op het tabblad 'bestand', selecteer 'Nieuw' en selecteer 'Overname methode' en 'OK'. Klik op het pictogram 'Massa Spec' en 'MS' tab. Selecteer Scan type als 'MRM', polariteit 'Positief'. 'Duur' instellen als de hele tijd te analyseren. Stel de m/z van [M + H]+ en 184 als 'Q1 massa (Da)' en 'Q3 massa (Da)' van het streefcijfer SM soorten van belang, respectievelijk. 'Tijd' als 10 ms en 'ID' als de naam van het doel SM soorten ingesteld.
- Selecteer het tabblad 'Geavanceerd MS', en elke parameter als volgt instellen: zowel van de resolutie Q1 en Q3 als 'Eenheid', intensiteit drempel als 0, instellen van de tijd als 0 (ms), en pauzeren tussen massa bereiken als 5 ms.
- Klik op de knop 'Parameters bewerken' in het tabblad 'MS' en selecteer de ' Bron/Gas' tab. Zet de parameter van gordijn gas, botsing gas, ionspray spanning, temperatuur, ion bron gas1 en gas2 zoals vermeld in tabel 1. Selecteer vervolgens de 'Samengestelde' tab. zetten de parameters van het declustering potentieel, ingang potentieel, botsing energie en botsing cel afrit potentieel zoals vermeld in tabel 2.
- Stel de klep zoals beschreven in stap 2.2.2.6.
- De LC-voorwaarde zoals beschreven in stap 2.2.2.7 instellen Sla de methode.
- De batch-bestand zoals beschreven in stap 2.2.3 maken
- Het verkrijgen van de gegevens van de MRM van elke soort van SM langs LC-ESI-MS/MS analyse zoals beschreven in stap 2.2.4.
- Verwerken van de gegevens van de MRM met behulp van de software voor gegevensintegratie en verkrijgen van de gegevens van piekoppervlakte voor de uitgepakte ion chromatogram van elke soort van SM.
- Dubbelklik op het pictogram software voor gegevensintegratie in kwantitatieve analyse, klik op het tabblad 'Bewerken' en selecteer gebruiker integratie in gebreke blijft. Gaussiaanse glad breedte als 1,0 punt instellen, en klik op 'OK'. Klik op het tabblad 'Bewerken' en selecteer 'Nieuwe resultaten tafel'. Selecteer het monster te worden geïntegreerd, klikt u op een knop met de pijl en klik op 'Next'. Selecteer 'Maak nieuwe methode', zet de naam van de methode en klik op 'Next'. Klik op 'Next' en vink het vakje van de d18:1 /(D31)-16:0 SM as IS, klik op 'Next' en klik op 'Voltooien'.
- Klik op 'Toont de piek herziening' en bevestig dat de chromatografische pieken naar behoren worden erkend. Opgemerkt moet worden dat de retentietijd van d18:1 /(D31)-16:0 SM is meestal kleiner door ~ 0,3 min ten opzichte van één van de 34-1-SM (bestaat meestal van d18:1 / 16:0 SM).
- Kwantificeren van elke soort van SM volgens de verhouding van de piek van elke soort die SM zullen de d18:1 /(D31)-16:0 SM interne standaard.
- Klik op het tabblad 'Bestand', selecteer 'Exporteren', selecteer 'Resultaten tafel', bevestigen als 'MultiQuant', 'Alle kolommen exporteren' kolommen, rijen als 'Export alle rijen behalve die expliciet verborgen', en klik vervolgens op 'OK'.
- Open het geëxporteerde bestand in de Excel-software. Normaliseren van het gebied van het doel SM soorten door het gebied van IS (d18:1 /(D31)-16:0 SM). Vervolgens vermenigvuldigt u met het theoretische bedrag van de IS in de ingespoten steekproef voor het berekenen van de hoeveelheid doel SM soort(en) in het ingespoten monster.
- Bouw van de standaard curve
- Verkrijgen van de gegevens van de MRM van d18:1 /(D9)-18:1 SM en d18:1 /(D31)-16:0 SM in de monsters voor de bouw van de standaard curve door LC-ESI-MS/MS-analyse, zoals beschreven in stap 2.3.1-2.3.4.
- Verkrijgen van de gegevens van de piekoppervlakte van d18:1 /(D9)-18:1 SM en d18:1 /(D31)-16:0 SM zoals beschreven in stap 2.3.5.
- Berekent het bedrag van d18:1 /(D9)-18:1 SM in de ingespoten steekproef als beschreven in stap 2.3.6.
- De trendlijn construeren door de x-as en de y-as als de nominale bedrag en de berekende hoeveelheid d18:1 /(D9)-18:1 SM en het verkrijgen van de formule van de trendlijn.
- Het valideren van de kwantitatieve methode met behulp van Excel software
- Voor de validatie van de methode, het kwantificeren van het bedrag van de d18:1 /(D9)-18:1 SM en d18:1 /(D31)-16:0 SM in de QC monsters door het analyseren van elke QC proef ten minste driemaal in 1 dag, en ten minste 3 dagen herhalen, zoals beschreven in stap 2.3.1-2.3.4.
- Verkrijgen van de piek gebied gegevens en het berekenen van de hoeveelheid d18:1 /(D9)-18:1 SM in de ingespoten steekproef als beschreven in stap 2.3.5 en 2.3.6.
- Volgens de ijkcurve die is verkregen, berekent het bedrag van d18:1 /(D9)-18:1 SM in de ingespoten steekproef.
- Evaluatie van precisie
- Berekenen van het gemiddelde en de standaardafwijking van de hoeveelheid d18:1 /(D9)-18:1 SM verkregen in 2.5.3 stap op de dataset voor de intra-day en inter dag met behulp van Excel software.
- De gemiddelde verkregen in stap 2.5.4.1 gedeeld door de standaardafwijking, en uitgedrukt als %.
- Evaluatie van nauwkeurigheid
- De nauwkeurigheid van elke gegevens als volgt berekenen:
[(Het berekende bedrag verkregen in stap 2.5.3.) / (Nominale bedrag) - 1] × 100(%) - Bereken het gemiddelde van de absolute waarde van de nauwkeurigheid van de dataset van de intra- en inter dag.
- De nauwkeurigheid van elke gegevens als volgt berekenen:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Chemisch gesynthetiseerd d18:1 / 24:0 SM (Figuur 1A) en d18:1 / 24:0 SM in lipide monsters HeLa cellen (Figuur 1B) is onttrokken werden geanalyseerd door LC-ESI-MS3 tewerkstellen [M + HCOO]- en [M-CH3]- als eerste en tweede voorloper ionen, respectievelijk. Merk op dat de intensiteit van het spectrum van demethylated-sphingosylphosphorylcholine (SPC) (m/z 449) groter dan dat van de SM N is-acyl deel daarvan (m/z 378). Voorts is het spectrum overeenkomt met [M-choline-CH3 (sphingosine-1-fosfaat)]- is ook nuttig om de LCB voor de SM toewijzen. We hebben ook bevestigd dat het spectrum van de demethylated-SPC (m/z 449) wordt voornamelijk geproduceerd uit d18:1 SPC onder de voorwaarde van onze MS3 analyse (Figuur 1C).
De kalibratiecurve met behulp van twee-ionenpaar gelabelde SM soorten werd getoond in Figuur 2. De trendlijn is verkregen door 1 / x2als de wegingsfactor toe te passen. Het resultaat van de resterende analyse werd getoond in Figuur 2B. Merk op dat de restwaarde dichtbij ondergrens van kwantificatie (0.1 pmol in deze huidige studie) kleiner was door het toepassen van 1 / x2als de wegingsfactor.
De parameters van de verkregen kalibratiekromme en het resultaat van validatie werden getoond in tabel 3. De waarde van de precisie en nauwkeurigheid werden binnen ± 15%, waaruit blijkt dat de huidige studie de criteria voldaan als een methode van de kwantificatie met LC-MS8.
Het bedrag van elke soort van de SM in de HeLa cellen werd getoond in tabel 4. HeLa cellen werden gekweekt in kweekmedia bevattende 10 gewichtspercenten FBS en geoogst. D18:1 / 16:0 SM en d18:1 / 24:1 SM waren de meeste en de tweede meest voorkomende SM soorten waarvan de structuur werden vastgesteld en bestaat uit 54% en 14% van de totale SM, respectievelijk
Figuur 1 . MS3 spectra van specifieke m/z signalen van de SM in HeLa cellen. MS3 spectra van chemisch gesynthetiseerde d18:1 / 24:0 SM (A) en d18:1 / 24:0 SM in lipide monsters geëxtraheerd uit HeLa cellen (B) worden weergegeven. De resultaten waren aangepast van Hama et al. 6 er rekening mee dat de intensiteit van het Spectrum van de SPC groter dan dat van de N is-acyl deel van SM MS3 spectra van chemisch gesynthetiseerde d18:1 SPC staan in (C) door gebruik te maken van ionen met identieke m/z ([M + HCOO]-, m /z 499) als de 1e en 2e voorloper ionen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Kalibratiekrommen van SM met behulp van twee soorten van ionenpaar-label SM. (A) de kalibratie curve met behulp van twee-ionenpaar met het label SM soorten (d18:1 /(D9)-18:1 SM en d18:1 /(D31)-16:0 SM). Kalibratiekrommen werden gebouwd met behulp van de wegingsfactor = 1 / x2. De resultaten van de validatie zijn vermeld in tabel 3. (B) residuele analyse voor de beoordeling van de goedheid van een geconstrueerde kalibratiekromme. De storingswaarden in de ijkcurve door de wegingsfactor = 1 / x2 is kleiner dan degene met de wegingsfactor = 1 / x of 1, met name in een lagere hoeveelheid d18:1 /(D9)-18:1 SM Klik hier voor een grotere versie van deze figuur.
| TurboIonSpray instellingen | ||||||
| Modus | Gordijn Gas (psi) | Botsing Gas | Ion spray spanning (V) | Temperatuur (° C) | Ion bron gas 1 (psi) | Ion bron gas 2 (psi) |
| MS3 | 40 | Hoge | -4500 | 200 | 40 | 80 |
| MRM | 40 | 10 | 5500 | 300 | 40 | 80 |
Tabel 1. De voorwaarden van electrospray ion bron gebruikt voor zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyse. Deze tabel werd aangepast van Hama et al. 6
| modus | polariteit | voorloper ion (Q1) | product-ion- of 2e voorloper ion (Q3) | declustering potentieel (V) | ingang potentiële (V) | botsing energie (V) | botsing cel afrit potentieel (V) | botsing energie verspreid (V) | Excitatie tijd (ms) | Snelheid (Da/sec) | tijd (s) | resolutie |
| MRM | positieve | [M + H] + | 184 | 1 | 10 | 35 | 12 | - | - | - | 5.364 | Eenheid |
| MS3 | negatieve | [M + HCOO] - | M-15 | -26 | -10 | -40 | - | 0 | 25 | 10000 | automatisch caluculated | Eenheid |
Tabel 2. De parameters van MS3 en MRM modus in triple vierpolige en vierpolige lineaire ion trap massaspectrometrie voor kwalitatieve en kwantitatieve analyse, respectievelijk gebruikt. Deze tabel werd aangepast van Hama et al. 6
Tabel 3. De parameters van de verkregen kalibratiekromme en het resultaat van validatie. De resultaten waren aangepast van Hama et al. 6
| moleculaire soorten SM | bedrag (pmol/mg eiwit) |
| D18:1 / 14:0 | 115,5 |
| D16:1 / 16:0 | 115,5 |
| D17:1 / 16:0 | 239,8 |
| D18:2 / 16:0 | 449,9 |
| D18:1 / 16:0 | 3355.1 |
| D18:0 / 16:0 | 203.8 |
| D18:1 / 17:0 | 106,3 |
| D18:2 / 18:0 | 26.5 |
| d20:0 / 16:1 | 94,9 |
| D18:1 / 18:0 | 94,9 |
| D18:2 / 22:0 | 102,3 |
| D18:1 / 22:0 | 235 |
| D18:1 / 23:1 | 83,3 |
| D18:1 / 23:0 | 23,9 |
| D18:1 / 24:2 | 286.5 |
| D18:2 / 24:1 | 286.5 |
| D18:1 / 24:1 | 853.2 |
| D18:1 / 24:0 | 94,6 |
| D18:1 / 25:1 | 12.9 |
Tabel 4. Het bedrag van elke soort van SM in HeLa cellen. HeLa cellen werden gekweekt in kweekmedia bevattende 10 gewichtspercenten FBS. Cellen zijn geoogst, en totale lipide breuk werd gewonnen door Bligh & Dyer methode. De resultaten waren aangepast van Hama et al. 6
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de huidige kwalitatieve methode, verkregen we MS3 product ionen een SPC en een N-acyl deel daarvan. Het is essentieel voor het correct toewijzen van zowel een SPC en een N-acyl deel daarvan. Te dien einde moet opgemerkt worden dat andere phosphorylcholine-bevattende moleculen kunnen ook worden gedetecteerd als MS3 product ionen. Diacyl-dunlaag (PC) en plasmalogen-PC zijn overvloedig aanwezig in cellen van zoogdieren, en hun hydrophobicity is vergelijkbaar met die van SM. Daarom, diacyl-PC en plasmalogen-PC met een isotoop (meestal 13C) kunnen theoretisch gedetecteerd worden gelijktijdig door SM. In onze experimenten, werden de MS3 product ionen voor plasmalogen-PC gelijktijdig waargenomen in de SM-analyse. Het is handig om te goed selecteren de MS3 product ionen voor SM te weten dat de intensiteit van het spectrum van de SPC groter dan dat van de SM N is-acyl groep (Figuur 1A en B). In tegenstelling, de intensiteit van vette acyl-deel daarvan groter is dan (of bijna hetzelfde als) die voor de demethylated lysoplasmalogen-PC (gegevens niet worden weergegeven).
In de huidige kwantitatieve methode is het van cruciaal belang om te bereiden juist monsters voor de bouw van de kalibratiekromme en valideren van de methode. Bovendien, moet de wegingsfactor correct worden gebruikt om te teken de ijkcurve; het is nuttig om de curve passend vooral bij een lage concentratie. We vergeleken de kalibratiekrommen met behulp van verschillende wegingsfactoren. De curve passend bij lage concentratie was duidelijk verbeterd met behulp van de wegingsfactor = 1 / x2 ten opzichte van dat het gebruik van de wegingsfactor = 1 of 1 / x (Figuur 2B). De waarde van de precisie en nauwkeurigheid moet binnen ± 15%. Als de concentratie van de QC-L is identiek aan de ondergrens van de standaard curve (ondergrens van kwantificatie), moet binnen ± 20%8.
We werken de Bligh & Dyer methode om uit te pakken van de Fractie van de totale lipide uit gekweekte cellen in deze studie. Andere methoden voor het lipide extractie zoals de Folch methode zijn ook nuttig9. Het is belangrijk om op te halen van het lipide-breuk met de juiste methode volgens het bedrag en/of de eigenschappen van de monsters. Het aantal SM soorten tegelijkertijd geanalyseerd in elke injectie mag niet te groot om te voorkomen dat overbelasting van de software voor data-acquisitie. De geplande MRM zal nuttig zijn voor een aantal soorten SM gelijktijdig quantitating.
Onze huidige methode met behulp van MS3 analyse is handig om te speculeren op het aantal koolstof en dubbele bindingen van LCB en N-acyl deel van SM zonder extra apparaten. Echter, andere structurele informatie zoals de locatie van dubbele bindingen, isomeer (cis of trans) en vorm (rechte of vertakte) kan niet worden verkregen. Het is nodig om hogere energie te verkrijgen product ionen en hun structurele informatie met behulp van aanvullende instrumenten10,11,12,13. De molecuulformule van de product-ionen overeenkomt met N-acyl wordt was [KCO2]- -ionen die geen stikstof bevatten. Het is onbekend hoe de botsing veroorzaakte dissociatie opbrengst.
Voor MS3 analyse is het belangrijk om de parameters van de botsing energie (CE) en excitatie tijd voor MS3 fragmentatie (ExT). Een hogere CE zal leiden tot bovenmatige versnippering en verminderen de intensiteit van het ion product voor de demethylated SM als de 2nd voorloper ion. Bovendien, is de fragmentatie patroon sterk afhankelijk van de ExT. Voordat de experimenten, het wenselijk is te bepalen van de juiste conditie van het CE en ExT die maximaliseren van de intensiteit van de product-ionen van het demethylated SM, SPC en N-acyl deel daarvan door de infusie van synthetische SM opgelost in de mobiele fasen.
We gebruikten d18:1 /(D9)-18:1 SM en d18:1 /(D31)-16:0 SM als twee ionenpaar-geëtiketteerden SM soorten te teken de ijkcurve. De efficiëntie van ionisatie kan variëren naargelang de SM-soorten en de conditie van de mobiele fase. Dus, als het aantal SM van belang beperkt is, is het wenselijk voor te bereiden op het ionenpaar-label SM soorten van belang nauwkeuriger kwantificatie.
De SM-structuur is tot dusver vastgesteld volgens de voorloper ion en het product-ion overeenkomt met demethylated SPC. Bovendien werd het soms gehinderd om te precies bepalen de ondergrens van kwantificatie in de monstermatrix aanwezigheid aangezien de doelgroep verbindingen van belang overvloedig aanwezig in de monstermatrix waren.
De huidige studie is handig voor het schatten van het aantal koolstof en dubbele bindingen in een LCB en een N-acyl groep op basis van hun overeenkomstige product-ionen in MS3 experimenten zonder aanvullende instrumenten. Daarnaast presenteren wij een kwantitatieve analysemethode voor SM met behulp van twee stabiele ionenpaar gelabelde SM soorten, dat vergemakkelijkt het meetbereik in SM kwantificatie bepalen. De huidige methode zal zitten nuttig in karakterisering van een verscheidenheid van unieke SM soorten in verschillende biologische monsters en industriële producten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen conflict van belang hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een onderzoek subsidie van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie van Japan (KAKENHI) naar K.H. (#15 K 01691), Y.F. (#15 K 08625), K.Y. (#26461532) en een subsidie voor de studie van hardnekkige ziekte Project van het ministerie van Gezondheid, arbeid en welzijn (K.Y. #201510032A). Wij danken de Edanz groep (www.edanzediting.com/ac) voor het bewerken van een ontwerp van dit manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100 mm tissue culture dish | IWAKI | 3020-100 | |
| Cell scraper | IWAKI | 9000-220 | |
| Siliconized 2.0 mL tube | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Test tube | IWAKI | TST SCR 16-100 | |
| Teflon-lined screw cap | IWAKI | 9998CAP415-15 | |
| Disposable glass tube | IWAKI | 9832-1310 | |
| CAPCELL PAK C18 ACR 3 µm 1.5 mm I.D. x 100 mm | Shiseido | 92223 | Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column |
| CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE | Shiseido | 12197 | |
| Cartridge holder | Shiseido | 12415 | |
| Acetonitrile | Wako | 018-19853 | |
| 2-Propanol (Isopropyl Alcohol) | Wako | 161-09163 | |
| Methanol | Wako | 134-14523 | |
| Formic acid | Wako | 066-00466 | |
| 28% Ammonia water | Wako | 016-03146 | |
| Sonicator (bath type) | SHARP | UT-206H | |
| Vortex mixer for glass test tube | TAITEC | Mix-EVR | |
| 1.4 mL glass vial | Tomsic | 500-1982 | Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20°C |
| 8 mm septum | Tomsic | 200-3322 | When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum |
| Screw cap for 1.4 mm glass vial | Tomsic | 500-2762 | |
| Screw cap with slit septum | Shimadzu GLC | GLCTV-803 | |
| PVDF 0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
| Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry | SCIEX | QTRAP4500 | |
| The software for data acquisition and analysis of product ion spectra | SCIEX | Analyst | |
| The software for data integration in quantitative analysis | SCIEX | MultiQuant | |
| HPLC system | Shimadzu | Nexera | |
| Glass bottle | Sansyo | 85-0002 | |
| d18:1/24:0 sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860592P | |
| Sphingosylphosphorylcholine | Merck | 567735 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| L-glutamine | ThermoFisher | 25030081 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Eagle’s minimum essential medium | Sigma | M4655 |
References
- Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. Identification of a family of animal sphingomyelin synthases. EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).
- Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J.
- Kihara, A. Synthesis and degradation pathways, functions, and pathology of ceramides and epidermal acylceramides. Prog Lipid Res. 63, 50-69 (2016).
- Merrill, A. H., Sullards, M. C., Allegood, J. C., Kelly, S., Wang, E. Sphingolipidomics: high-throughput, structure-specific, and quantitative analysis of sphingolipids by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Methods. 36 (2), 207-224 (2005).
- Houjou, T., et al. Rapid and selective identification of molecular species in phosphatidylcholine and sphingomyelin by conditional neutral loss scanning and MS3. Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (24), 3123-3130 (2004).
- Hama, K., Fujiwara, Y., Tabata, H., Takahashi, H., Yokoyama, K. Comprehensive Quantitation Using Two Stable Isotopically Labeled Species and Direct Detection of N-Acyl Moiety of Sphingomyelin. Lipids. , (2017).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Gu, H., Liu, G., Wang, J., Aubry, A. F., Arnold, M. E. Selecting the correct weighting factors for linear and quadratic calibration curves with least-squares regression algorithm in bioanalytical LC-MS/MS assays and impacts of using incorrect weighting factors on curve stability, data quality, and assay performance. Anal Chem. 86 (18), 8959-8966 (2014).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Thomas, M. C., et al. Ozone-induced dissociation: elucidation of double bond position within mass-selected lipid ions. Anal Chem. 80 (1), 303-311 (2008).
- Baba, T., Campbell, J. L., Le Blanc, J. C., Baker, P. R. In-depth sphingomyelin characterization using electron impact excitation of ions from organics and mass spectrometry. J Lipid Res. 57 (5), 858-867 (2016).
- Ryan, E., Nguyen, C. Q. N., Shiea, C., Reid, G. E. Detailed Structural Characterization of Sphingolipids via 193 nm Ultraviolet Photodissociation and Ultra High Resolution Tandem Mass Spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. , (2017).
- Pham, H. T., Ly, T., Trevitt, A. J., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. Differentiation of complex lipid isomers by radical-directed dissociation mass spectrometry. Anal Chem. 84 (17), 7525-7532 (2012).
