Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar e qualificar cada espécie de esfingomielina usando múltiplas reação monitoramento e modo de MS/MS/MS, respectivamente.
Abstract
Apresentamos um método de analisar esfingomielina (SM) qualitativamente e quantitativamente por cromatografia líquida-electrospray espectrometria de massa de ionização-em tandem (LC-ESI-MS/MS). SM é um esfingolipídeos comum, composto por um phosphorylcholine e uma ceramida como o componente hidrofílico e hidrofóbico, respectivamente. Um número de espécies de SM está presente em células de mamíferos devido a uma variedade da esfingoides longa cadeia de base (LCB) e um N-moiety de acila na ceramida. Neste relatório, vamos mostrar um método de estimar o número de carbono e ligações duplas em uma LCB e um N-grupo acila baseia seus íons de produto correspondente em experimentos de MS/MS/MS (MS3). Além disso, apresentamos um método de análise quantitativa para SM usando duas estável desvendar rotulado SM espécies, que facilita a determinação do intervalo utilizado na quantificação da SM. O presente método será útil em caracterizando uma variedade de espécies de SM em amostras biológicas e produtos industriais como cosméticos.
Introduction
Esfingomielina (SM) é um comum esfingolipídeos em células de mamíferos. SM é sintetizada intracelular1 e presente como um precursor para outros esfingolipídeos como um esfingosina-1-fosfato e uma ceramida, que têm papéis cruciais em imune celular tráfico e homeostase da barreira, respectivamente,2, a pele 3. Assim, a análise precisa do metabolismo SM é importante para elucidar as funções fisiológicas e patológicas de esfingolipídeos.
SM é composto por uma ceramida e um phosphorylcholine que está vinculada ao grupo da ceramida, composto por mais uma esfingosina e um N1-hidroxi-grupo acila. Uma variedade do número de carbono e uma ligação dupla na esfingosina e N-grupo acila resulta na espécie número de ceramida (e SM). Avanços recentes na LC-ESI-MS/MS permitiu uma análise quantitativa e qualitativa de SM4,5. Na análise qualitativa, o número de carbono e ligações duplas de um esfingoides LCB de SM foi identificadas atribuindo espectros de íon produto da LCB. No entanto, informações estruturais do N-grupo acila não foram obtida diretamente porque seus íons correspondentes do produto não foram relatados e, portanto, N-metades de acila foram deduzidas pela análise diferencial entre íons precursor e íons de produto correspondente a LCB em ambos os modos de iões positivos e negativos4,5. Neste relatório, nós apresentamos um método para detectar os íons de produto da LCB e N-moiety de acila simultaneamente em modo de3 MS usando triplo quadrupolo e espectrometria maciça linear ion trap quadrupolo, que facilita a precisão estrutural especulação de cada espécie de SM6.
Os efeitos de supressão (ou aprimoramento) do íon causados pela matriz em amostras biológicas dificultam a quantificação exata na análise de LC-ESI-MS, e portanto, é desejável para construir as curvas de calibração para todos os analitos de interesse na matriz idêntica da amostra biológica. No entanto, esta estratégia não é viável porque é quase impossível preparar todas as espécies de SM em amostras biológicas, especialmente em uma análise abrangente. Assim, é prático para construir uma curva de calibração e determinar a escala quantitativa usando uma espécie de SM representante cravada nas amostras biológicas. Usamos duas espécies de SM desvendar-etiquetados para construir uma curva de calibração; foi usada para um padrão interno e outro para um padrão composto. Detectamos uma pequena quantidade de espécies de SM desvendar-rotulado como um padrão composto cravado em amostras biológicas e obtido com êxito uma curva de calibração e a escala quantitativa6.
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Protocol
Consulte todas as fichas de dados de segurança (MSDS) antes do uso. Use luvas para minimizar a contaminação da amostra por SM derivado de pele. O presente protocolo foi aplicado às células HeLa cultivadas na mínimo essencial suplementado do águia com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM L-glutamina, 1.000 U/L penicilina e estreptomicina 100 mg/L.
1. preparação das amostras de lipídios
Nota: É importante que todos os produtos vidreiros, incluindo tubos de ensaio com tampas de rosca Teflon revestido isento de detergente.
- Extração da fração lipídica total de homogeneizado de célula usando o método de Bligh & Dyer7
- Remover a cultura (ou condicionado) meios de cultura de tecido de 10cm prato e lavar duas vezes com 6 mL de PBS gelado.
- Adicione 1 mL de PBS gelado para o prato de cultura de tecido de 10 cm, com uma pipeta P1000. Colher as células com raspadores de célula e coletar em tubos de plástico siliconizados 2,0 mL.
- Após centrifugação (1.000 × g, 5 min, 4 ° C), remova o sobrenadante por uma pipeta P1000.
- Adicione 1 mL de metanol. Vórtice tubos brevemente e proceda à sonicação em 200 W por 5 min em um sonicador de banho-tipo.
Nota: Ajuste o nível de água em um sonicador de banho-tipo para que o centrifugado eficientemente é homogeneizado. - Pipeta, transferi o homogenate de célula em metanol em tubos de ensaio (13 x 100 mm), com tampas de rosca Teflon-alinhado.
- Adicione 1 mL de metanol, 1 mL de clorofórmio, 0,8 mL de água bidestilada e 50 µ l de 10 µmol/L de d18:1 padrão interno /(D31)-16:0 SM para cada tubo de ensaio.
- Tubos de ensaio de vórtice vigorosamente por 5 min à temperatura ambiente.
Nota: A esta altura, uma única fase (clorofórmio/metanol/água = 1/2/0,8 (v/v/v)) é formado. - Adicione 1 mL de clorofórmio e 1,0 mL de água bidestilada.
- Tubos de vórtice vigorosamente a 2.500 rpm durante 5 min à temperatura ambiente.
Nota: neste ponto, o aquosa fase (superior) e a fase orgânica (inferior) é separada. - Após centrifugação (2.150 × g, 5 min, 25 ° C), coletar e transferir a fase inferior em tubos de vidro descartável (fase inicial inferior).
Nota: Recolha a fase inferior usando uma pipeta Pasteur e um filtro de pipeta de segurança. Insira a ponta da pipeta na fase inferior, aperte o bulbo pequeno ao lado da válvula de 'E' entregar-se a fase superior e cotão interfacial dentro a ponta da pipeta e em seguida a fase inferior do sifão dentro da pipeta. - Adicione 2 mL de clorofórmio em tubos de ensaio e vórtice os tubos vigorosamente a 2.500 rpm durante 5 min à temperatura ambiente suficientemente misturar com a fase superior e cotão interfacial.
- Após centrifugação (2.150 × g, 5 min, 25 ° C), coletar e transferir a fase inferior modificada para os tubos de vidro descartável com a fase inicial inferior como descrito na etapa 1.1.10.
- Coloque os tubos de vidro sob um fluxo de nitrogênio e remover completamente os solventes orgânicos na fase inferior coletada.
- Reconstituir as amostras com 500 µ l de metanol ou etanol, filtrar com um filtro de 0,02 µm e armazenar em frascos de vidro a-20 ° C.
- Preparação da amostra para construir a curva de calibração e validação do método
- Adicionar 50 µ l de 0.1, 0.5, 1, 5, 10 ou 50 µmol/L de padrão composto (d18:1 /(D9)-18:1 SM) em tubos de ensaio com tampas de rosca Teflon-alinhado.
- Adicionar homogenate de célula para cada tubo de ensaio e adicionar 1 mL metanol.
Nota: A quantidade de célula homogeneizado como uma matriz varia de acordo com cada experiência. Se a espécie de SM em amostras derivadas de células numa placa de cultura de 10 cm é rotineiramente analisada, a quantidade de células homogeneizado em cada tubo de ensaio deve ser próximo ao de células numa placa de cultura de 10 cm. - Extrato da fração lipídica total conforme descrito em etapas 1.1.6-1.1.14.
- Prepare a verificação da qualidade (QC) amostras para validar o método como descried em etapas 1.2.1-1.2.3. Preparar três QC amostras com concentrações diferentes de padrão composto (d18:1 /(D9)-18:1 SM): um dentro de 3 x o limite inferior da curva padrão (QC-baixo, QC-L), um perto do centro (QC-médio, QC-M) e um perto do limite superior da curva padrão (QC-alta, QC-H).
2. SM análise por LC-ESI-MS/MS
- Preparação da fase móvel
- Mistura de solventes (acetonitrilo/metanol/ddH2O = 2/2/1 (v/v/v) para a fase aquosa e isopropanol para a fase orgânica) em garrafas com tampas de rosca Teflon revestido de vidro e proceda à sonicação por 5 min em um sonicador de banho-tipo.
- Adicionar o ácido fórmico (concentração final 26,4 mmol/L) e NH4OH (14,9 mmol/L) em cada fase móvel.
- Análise qualitativa de SM por LC-ESI-MS3
- Ativar o sistema de cromatografia líquida (HPLC) de alto desempenho, colocar os tubos de entrada para as garrafas de vidro que contêm fases móveis e purgar as linhas HPLC. Link de uma coluna HPLC de18 C (1,5 mm identificação × 100 mm de comprimento, partícula tamanho 3,0 µm) para o sistema HPLC, manter a temperatura do forno da coluna, a 50 ° C e condicionar a coluna com a fase aquosa móvel em 100 µ l/min. colocar as amostras em um rack de amostra na autosampl -er.
- Defina os parâmetros do sistema de espectrometria de massa de linear ion trap quadrupolo para análise de3 MS conforme listado na tabela 1 e tabela 2 , bem como o precursor do primeiro e segundo íons das espécies de interesse SM e triplo quadrupolo.
- Dê um duplo clique no ícone do software para aquisição de dados, clique duas vezes a configuração de' Hardware', selecione 'LC + QTRAP4500 + válvula' e clique em 'Ativar perfil'.
- Crie uma nova subpasta clicando em 'Novo sub-projeto' e 'Okey'.
- Clique na guia 'arquivo', selecione 'Novo' e selecione 'Método de aquisição' e 'Okey'. Clique no ícone 'Mass Spec' e 'MS' Tab. Selecione Scan tipo como 'MS/MS/MS (MS3)', taxa de varredura como 10.000 Da/s, polaridade como 'Negativo' e 'Duração' como o tempo todo para ser analisado (min). Defina a m/z do 'Start (Da)' e 'Stop (Da)' como o intervalo a ser digitalizado. Defina a m/z dos iões precursor de 1ª e 2ª do alvo espécies SM de interesse.
Nota: Para analisar várias espécies de SM, destacar o '-MS3' ícone, botão direito do mouse, selecione 'Copiar este experimento' e em seguida, colocar a m/z dos 1º e 2º iões precursor de outras espécies de SM. - Selecione a guia 'Avançado MS' e definir cada parâmetro da seguinte forma: modo de varredura como 'Perfil', tamanho de passo como 0.12 (Da), resolução Q1 e Q3 'Unidade' e 'Iluminada', respectivamente, o limiar de intensidade como 0, tempo de solidificação como 50 (ms), pausa entre faixas de massa como 1,5 ms, selecione ' dinâmico preencher o tempo ', barreira de entrada Q3 como 8 V e o tempo de excitação como 25 ms.
- Clique no botão 'Editar parâmetros' na guia 'MS' e selecione 'fonte/gás' Tab definir os parâmetros do gás de cortina, gás de colisão, ionspray tensão, temperatura, íon fonte gas1 e gas2 conforme listado na tabela 1. Então selecione a guia 'Composto' definir os parâmetros do potencial declustering, potencial de entrada, energia, energia de excitação e energia de colisão espalhar conforme listado na tabela 2.
- Destaque 'Integrada da válvula Valco' e selecione 'Nome da posição para etapa 0' como A e 'B' como posição para total tempo 5,0 min. Também definido 'A' como posição para total tempo min 70,0.
- Destaca-se 'Sistema Shimadzu LC'. Selecione a guia 'Bomba' e definir o modo de bombeamento como fluxo binário, o fluxo total de 0,28 mL/min e o máximo de limites de pressão como 20,0 MPa. Selecione a guia 'Mostruário' e definir o volume de lavagem como 200 µ l agulha de traço como 52 milímetros, enxague a velocidade como 35 µ l/s, velocidade como 5,0 µ l/s de amostragem, purgar o tempo como 25,0 min, enxaguar o tempo de mergulho como 5 s e modo de lavagem como 'Antes e depois da aspiração'.
- Além disso, habilitar o aparelho refrigerador, regule a temperatura refrigerador como 4 ° C e o traço de agulha do frasco de controle como 52 mm. Selecione a guia 'Forno', permitem o forno e a temperatura do forno e a temperatura máxima definida como 50 ° C e 85 ° C, respectivamente.
- Seleccione o separador 'Controlador' e marque a caixa 'Ligar'. Seleccione o separador 'Programa' e defina os gradientes solventes como segue: solventes A / B na proporção de 100/0 por 5 min, programa lineares alterações de 80/20 mais de 4 min, 35/65 mais de 50 min e de 25/75 mais 1 min. depois , segurá-los no 25/75 por 10 min, em seguida linearmente para 100/0 mais 4 min. Então o método save.
- Criar o arquivo de lote
- Duplo clique no ícone 'Construir lote de aquisição', clique em 'Adicionar Set', 'Adicionar a amostras', defina o número de novas amostras e clique em 'Okey'.
- Clique no botão ' método Editor' e selecione o método a ser usado. Se vários métodos são usados em um arquivo em lotes, marque a caixa de 'Uso múltiplo métodos' e selecione o método de aquisição para cada amostra. Renomear 'Nome da amostra', definir o número adequado para 'Posição de frasco' e coloque a quantidade de volume de injeção. Em seguida, salve o arquivo em lotes.
- Obter o produto de3 MS espectros de íons das espécies de interesse SM por LC-ESI-MS3 análise
- Selecione a guia 'Submeter' no arquivo de lote, destaca a linha de amostras a analisar e clique no botão 'Enviar'.
- Clique no ' View Quene' ícone, o ícone 'Equilíbrio', selecione o método de aquisição a ser utilizado, definir hora como 1 min e clique em 'Okey'.
- Desactive o 'Instrumento de reserva para Tuning', clicando no ícone correspondente. Em seguida, execute sequência em lote, clicando no ícone 'Começar a amostra'.
- Atribuir a cada MS3 espectros de íon produto de SM, comparando a massa para cobrar proporção (m/z) do produto espectros de íons e a massa exata do esfingoides LCB e N-grupo acila de interesse. Determinar o número de carbonos e dois títulos no esfingoides LCB e N-grupo acila de acordo com os íons de produto correspondente.
- Verifique se a pasta apropriada sub-projeto foi selecionada, então dê um duplo clique no ícone 'Abrir arquivo de dados' e seleccionar as amostras a analisar. Arraste o pico no cromatograma, para cada espécie de SM de destino e clique duas vezes. Serão apresentados os obtidos espectros íon MS produto3 dentro da área arrastado.
- Análise quantitativa de SM por LC-ESI-MS/MS
- Defina as fases móveis e HPLC coluna conforme descrito no passo 2.1 e 2.2.1.
- Defina os parâmetros do triplo quadrupolo e sistema de espectrometria de massa linear ion trap quadrupolo para múltiplas reação (MRM) análises de monitorização, conforme listado na tabela 1 e tabela 2.
- Realizar os procedimentos conforme descrito na etapa 2.2.2.1 e 2.2.2.2.
- Clique na guia 'arquivo', selecione 'Novo' e selecione 'Método de aquisição' e 'Okey'. Clique no ícone 'Mass Spec' e 'MS' Tab. Selecione Scan tipo como 'MRM', polaridade como 'Positivo'. Defina 'Duração' como o tempo todo para ser analisado. Defina a m/z de [M + H]+ e 184 como 'Massa de Q1 (Da)' e 'Q3 massa (Da)' do alvo espécies SM de interesse, respectivamente. Definir o 'Tempo' como 10 ms e 'ID' como o nome do alvo espécies de SM.
- Selecione a guia 'Avançado MS' e definir cada parâmetro da seguinte forma: ambos da resolução Q1 e Q3 como 'Unidade', limiar de intensidade como 0, definindo o tempo como 0 (ms) e pausa entre faixas de massa como 5 ms.
- Clique no botão 'Editar parâmetros' na guia 'MS' e selecione a guia ' Fonte/gás' colocar o parâmetro de gás de cortina, gás de colisão, ionspray tensão, temperatura, íon fonte gas1 e gas2 conforme listado na tabela 1. Em seguida, selecione a guia 'Composto' colocar os parâmetros de declustering potencial, potencial de entrada, energia de colisão e potencial de saída de célula de colisão conforme listado na tabela 2.
- Conjunto da válvula, conforme descrito na etapa 2.2.2.6.
- Defina a condição de LC, conforme descrito na etapa 2.2.2.7. Então o método save.
- Crie o arquivo de lote, conforme descrito na etapa 2.2.3.
- Obter os dados MRM de cada espécie de SM por LC-ESI-MS/MS análise conforme descrito na etapa 2.2.4.
- Processar os dados MRM, usando o software de integração de dados e obter os dados da área do pico para o cromatograma de íons extraídos de cada espécie de SM.
- Dê um duplo clique no ícone do software para integração de dados em análise quantitativa, clique na guia 'Editar' e selecione padrões de integração do usuário. Definir largura liso Gaussian como 1,0 ponto e clique em 'Okey'. Clique na guia 'Editar' e selecione 'Nova tabela de resultados'. Selecione a amostra a ser integrada, clique em um botão de seta e clique em 'Avançar'. Selecione 'Criar novo método', defina o nome do método e clique em 'Avançar'. Clique em 'Avançar' e marque a caixa de d18:1 /(D31)-16:0 SM como está, clique em 'Avançar' e clique em 'Concluir'.
- Clique em 'Exibe a revisão de pico' e confirmar que os picos do cromatograma são reconhecidos adequadamente. Note-se que o tempo de retenção de d18:1 /(D31)-16:0 SM é geralmente menor por ~ 0,3 min em relação a um dos 34-1 SM (geralmente consiste de d18:1 / 16:0 SM).
- Quantificar a cada espécie de SM de acordo com a relação do pico de cada espécie de SM para o d18:1 /(D31)-16:0 padrão interno de SM.
- Clique na guia 'Arquivo', selecione 'Exportar', selecione 'Tabela de resultados', confirmando o formato do 'MultiQuant,' colunas 'Todas as colunas de exportação', linhas como 'Exportar todas as linhas exceto aqueles explicitamente ocultas' e clique em 'Okey'.
- Abra o arquivo exportado no software Excel. Normalizar a área do alvo espécies SM pela área de IS (d18:1 /(D31)-16:0 SM). Então Multiplique pela quantidade teórica do IS na amostra injetada para calcular a quantidade de alvo espécies de SM na amostra injetada.
- Construir a curva padrão
- Obter os dados MRM de d18:1 /(D9)-18:1 SM e d18:1 /(D31)-16:0 SM nas amostras para construir a curva padrão por LC-ESI-MS/MS análise, conforme descrito no passo 2.3.1-2.3.4.
- Obter os dados da área de pico de d18:1 /(D9)-18:1 SM e d18:1 /(D31)-16:0 SM conforme descrito na etapa 2.3.5.
- Calcular a quantidade de d18:1 /(D9)-18:1 SM na amostra injetada como descrito no passo 2.3.6.
- Construir a linha de tendência, definindo os eixos x e y como o valor nominal e montante calculado de d18:1 /(D9)-18:1 SM e obter a fórmula de linha de tendência.
- Validando o método quantitativo, utilizando o software Excel
- Para validação do método, quantificar a quantidade de d18:1 /(D9)-18:1 SM e d18:1 /(D31)-16:0 SM no QC amostras, analisando cada QC da amostra pelo menos três vezes em 1 dia e repita pelo menos 3 dias, conforme descrito no passo 2.3.1-2.3.4.
- Obter os dados de área de pico e calcular a quantidade de d18:1 /(D9)-18:1 SM na amostra injetada como descrito no passo 2.3.5 e 2.3.6.
- De acordo com a curva de calibração obtida, calcular a quantidade de d18:1 /(D9)-18:1 SM na amostra injetada.
- Avaliação da precisão
- Calcular a média e o desvio padrão da quantidade de d18:1 /(D9)-18:1 SM obtido na etapa 2.5.3 sobre o dataset do dia-intra e inter dia utilizando o software Excel.
- A média obtida na etapa 2.5.4.1 é dividida pelo desvio-padrão e expresso em %.
- Avaliação da precisão
- Calcule a precisão de cada dados como segue:
[(O montante calculado obtido na etapa 2.5.3.) / (Valor nominal) - 1] × 100(%) - Calcule a média do valor absoluto da precisão sobre o dataset do dia inter e intradia.
- Calcule a precisão de cada dados como segue:
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Representative Results
Sintetizados quimicamente d18:1 / 24:0 SM (Figura 1A) e d18:1 / 24:0 SM em amostras de lipídios extraídas de células HeLa (Figura 1B) foram analisados por LC-ESI-MS3 empregando– [M + HCOO] e [M-CH3]- como íons precursor de primeiro e segundo, respectivamente. Observe que a intensidade de espectro de desmetilado-sphingosylphosphorylcholine (CPE) (m/z 449) é maior do que o SM N-grupo acila (m/z 378). Além disso, o espectro correspondente [M-colina-CH3 (esfingosina-1-fosfato)]– também é útil para atribuir a LCB de SM. Também confirmamos que o espectro de desmetilado-SPC (m/z 449) é produzido principalmente de d18:1 SPC sob a condição de nossa análise de3 MS (Figura 1C).
A curva de calibração usando dois-desvendar rotulado SM espécie foi mostrada na Figura 2. A linha de tendência foi obtida pela aplicação de 1 / x2como o factor de ponderação. O resultado da análise residual foi mostrado na Figura 2B. Observe que o valor residual perto do limite inferior de quantificação (0.1 pmol no presente estudo) foi menor, aplicando-se 1 / x2como o factor de ponderação.
Os parâmetros da curva de calibração obtidos e o resultado da validação foram mostrados na tabela 3. O valor da precisão e exatidão foram ± 15%, mostrando que o presente estudo preencheram os critérios de como um método de quantificação utilizando LC-MS8.
A quantidade de cada espécie de SM nas células HeLa foi mostrada na tabela 4. Células HeLa foram cultivadas em meios de cultura contendo 10% FBS e colhida. D18:1 / 16:0 SM e d18:1 / 24:1 SM eram as segunda mais abundantes e a maioria das espécies SM cuja estrutura foram determinados e consistem em 54% e 14% do total SM, respectivamente
Figura 1 . MS3 espectros de sinais específicos m/z de SM em células HeLa. MS3 espectros de quimicamente sintetizado d18:1 / 24:0 SM (A) e d18:1 / 24:0 SM em amostras de lipídios extraídas de células HeLa (B) são mostrados. Os resultados foram adaptados de Hama et al 6 note que a intensidade de espectro do RCM é maior do que o N-grupo acila de SM MS3 espectros de d18:1 quimicamente sintetizado SPC são mostrados em (C) empregando íons com m/z idêntico ([M + HCOO]-, m /z 499) como os íons de precursor de 1º e 2º. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . As curvas de calibração de SM usando duas espécies de SM desvendar-etiquetadas. (A) a curva de calibração usando dois-desvendar rotulado espécie SM (d18:1 /(D9)-18:1 SM e d18:1 /(D31)-16:0 SM). As curvas de calibração foram construídas usando o factor de ponderação = 1 / x2. Os resultados da validação são listados na tabela 3. (B) análise Residual para a avaliação da bondade de uma curva de calibração construída. Os resíduos da curva de calibração usando o factor de ponderação de = 1 / x2 é menor do que os que usam o factor de ponderação = 1 / x ou 1, especialmente em uma menor quantidade de d18:1 /(D9)-18:1 SM , por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste Figura.
| Configurações TurboIonSpray | ||||||
| Modo de | Cortina de gás (psi) | Gás de colisão | tensão de pulverizador de íon (V) | Temperatura (° C) | gás de fonte do íon 1 (psi) | gás de fonte do íon 2 (psi) |
| MS3 | 40 | Alta | -4500 | 200 | 40 | 80 |
| MRM | 40 | 10 | 5500 | 300 | 40 | 80 |
Tabela 1. As condições de fonte de íon electrospray utilizados para análise qualitativa e quantitativa. Esta tabela foi adaptada a partir de Hama et al 6
| modo de | polaridade | íon precursor (Q1) | íon de produto ou 2 íon precursor (Q3) | declustering potencial (V) | potencial de entrada (V) | energia de colisão (V) | potencial de saída de célula de colisão (V) | propagação de energia de colisão (V) | Tempo de excitação (ms) | Velocidade (Da/seg.) | tempo (s) | resolução |
| MRM | positivo | [M + H] + | 184 | 1 | 10 | 35 | 12 | - | - | - | 5.364 | Unidade |
| MS3 | negativo | [M + HCOO] - | M-15 | -26 | -10 | -40 | - | 0 | 25 | 10000 | automaticamente caluculated | Unidade |
Tabela 2. Os parâmetros do MS3 e modo de MRM em triplo quadrupolo e quadrupolo linear ion trap massa espectrometria utilizada para análise qualitativa e quantitativa, respectivamente. Esta tabela foi adaptada a partir de Hama et al 6
Tabela 3. Os parâmetros da curva de calibração obtidos e o resultado da validação. Os resultados foram adaptados de Hama et al 6
| espécie molecular de SM | quantidade (pmol/mg de proteína) |
| D18:1 / 14:0 | 115.5 |
| D16:1 / 16:0 | 115.5 |
| D17:1 / 16:0 | 239.8 |
| D18:2 / 16:0 | 449.9 |
| D18:1 / 16:0 | 3355.1 |
| D18:0 / 16:0 | 203.8 |
| D18:1 / 17:0 | 106,3 |
| D18:2 / 0:18 | 26,5 |
| D20:0 / 16:1 | 94,9 |
| D18:1 / 0:18 | 94,9 |
| D18:2 / 22:0 | 102.3 |
| D18:1 / 22:0 | 235 |
| D18:1 / 23:1 | 83,3 |
| D18:1 / 0:23 | 23,9 |
| D18:1 / 24:2 | 286.5 |
| D18:2 / 24:1 | 286.5 |
| D18:1 / 24:1 | 853.2 |
| D18:1 / 24:0 | 94,6 |
| D18:1 / 25: 1 | 12.9 |
Tabela 4. A quantidade de cada espécie de SM em células HeLa. Células HeLa foram cultivadas em meios de cultura contendo 10% FBS. As células foram colhidas, e a fração lipídica total foi extraída pelo método de Bligh & Dyer. Os resultados foram adaptados de Hama et al 6
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Discussion
No presente método qualitativo, obtivemos MS3 íons de produto de um SPC e um N-grupo acila. É fundamental para atribuir adequadamente tanto um SPC e um N-grupo acila. Para este fim, note-se que outras moléculas contendo phosphorylcholine também podem ser detectadas como MS3 íons de produto. Diacil-fosfatidilcolina (PC) e plasmalogen-PC estão abundantemente presentes em células de mamíferos, e sua hidrofobicidade é similar de SM. Portanto, diacil-PC e PC-plasmalogen com um isótopo (geralmente 13C) podem ser teoricamente detectados simultaneamente com SM. Em nossos experimentos, os íons de produto de3 MS de plasmalogen-PC simultaneamente foram observados na análise SM. É útil para selecionar corretamente os íons de produto de3 MS de SM para saber que a intensidade do espectro do RCM é maior do que o SM N-grupo acila (Figura 1A e B). Em contraste, a intensidade da acil-moiety gordo é maior do que (ou quase iguais) que do demethylated lysoplasmalogen-PC (dados não mostrados).
No presente método quantitativo, é crítico para precisamente preparar amostras para construir a curva de calibração e validar o método. Além disso, o factor de ponderação deve ser corretamente usado para construir a curva de calibração; é útil melhorar a encaixe especialmente em uma baixa concentração de curva. Comparamos as curvas de calibração usando factores de ponderação diferente. A curva de concentração baixa se encaixam claramente foi melhorada usando o factor de ponderação = 1 / x2 em comparação com aquele usando o factor de ponderação = 1 ou 1 / x (Figura 2B). O valor da precisão e exatidão deve ser ± 15%. Se a concentração do QC-L é idêntica para o limite inferior da curva padrão (limite inferior de quantificação), que deve ser dentro de ± 20%8.
Utilizamos o método de Bligh & Dyer para extrair a fração lipídica total de células cultivadas neste estudo. Outros métodos de extração de lipídios, tais como o método de Folch também são úteis9. É importante extrair a fração lipídica usando o método apropriado de acordo com a quantidade e/ou propriedades das amostras. O número de espécies de SM analisados simultaneamente em cada injecção não deve ser muito grande para evitar sobrecarregar o software para aquisição de dados. O MRM agendada será útil para dosar um número de espécies de SM simultaneamente.
Nosso método atual usando MS3 análise é útil para especular o número de carbono e ligações duplas da LCB e N-grupo acila de SM sem dispositivos adicionais. No entanto, não podem ser obtidas outras informações estruturais tais como a localização de ligações duplas, isômero (cis ou trans) e de forma (reta ou ramificada). É necessário usar energia mais alta para obter suas informações estruturais usando instrumentos adicionais10,11,12,13e íons de produto. A fórmula molecular dos íons produto correspondente a N-metades de acila foi [RCO2]– de íons que não contêm azoto. Como a colisão induzido receitas de dissociação é atualmente desconhecido.
Para a análise de3 MS, é importante ajustar os parâmetros de tempo de excitação para fragmentação de3 MS (ExT) e energia de colisão (CE). CE um maior causará a fragmentação em excesso e reduzir a intensidade do íon de SM demethylated produto como o íon precursor de 2nd . Além disso, o padrão de fragmentação depende significativamente o extracto. Antes dos experimentos, é desejável para determinar a condição apropriada do CE e ExT que maximizar a intensidade dos íons produto da demethylated SM, SPC e N-grupo acila infundindo SM sintético dissolvido na fase móvel.
Usamos d18:1 /(D9)-18:1 SM e d18:1 /(D31)-16:0 SM como duas espécies de SM desvendar-etiquetados para construir a curva de calibração. A eficiência de ionização pode variar de acordo com a espécie de SM e a condição da fase móvel. Assim, se o número de SM de interesse é limitado, é desejável para preparar a espécie de SM desvendar-rotulado de interesse para a quantificação mais precisa.
A estrutura de SM foi determinada até agora de acordo com o íon precursor e o íon de produto correspondente ao SPC desmetilado. Além disso, ele às vezes foi prejudicado para determinar precisamente o limite inferior de quantificação na matriz da amostra de presença, desde que os compostos de interesse foram abundantemente presentes na matriz da amostra.
O presente estudo é útil para estimar o número de carbono e ligações duplas em uma LCB e um N-grupo acila baseia seus íons de produto correspondente em experimentos de3 MS sem instrumentos adicionais. Além disso, apresentamos um método de análise quantitativa para SM usando duas estável desvendar rotulado SM espécies, que facilita a determinação do intervalo utilizado na quantificação da SM. O presente método será útil em caracterizando uma variedade de espécies únicas da SM em diversas amostras biológicas e produtos industriais.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm nenhum conflito de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pesquisa do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia do Japão (KAKENHI) para KH (#15 K 01691), Y.F. (#15 K 08625), KY (#26461532) e um subsídio para o estudo do projeto de doença intratável do Ministério da Saúde, trabalho e Previdência (K.Y. #201510032A). Agradecemos ao grupo de Emilia (www.edanzediting.com/ac) para a edição de um projecto deste manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100 mm tissue culture dish | IWAKI | 3020-100 | |
| Cell scraper | IWAKI | 9000-220 | |
| Siliconized 2.0 mL tube | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Test tube | IWAKI | TST SCR 16-100 | |
| Teflon-lined screw cap | IWAKI | 9998CAP415-15 | |
| Disposable glass tube | IWAKI | 9832-1310 | |
| CAPCELL PAK C18 ACR 3 µm 1.5 mm I.D. x 100 mm | Shiseido | 92223 | Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column |
| CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE | Shiseido | 12197 | |
| Cartridge holder | Shiseido | 12415 | |
| Acetonitrile | Wako | 018-19853 | |
| 2-Propanol (Isopropyl Alcohol) | Wako | 161-09163 | |
| Methanol | Wako | 134-14523 | |
| Formic acid | Wako | 066-00466 | |
| 28% Ammonia water | Wako | 016-03146 | |
| Sonicator (bath type) | SHARP | UT-206H | |
| Vortex mixer for glass test tube | TAITEC | Mix-EVR | |
| 1.4 mL glass vial | Tomsic | 500-1982 | Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20°C |
| 8 mm septum | Tomsic | 200-3322 | When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum |
| Screw cap for 1.4 mm glass vial | Tomsic | 500-2762 | |
| Screw cap with slit septum | Shimadzu GLC | GLCTV-803 | |
| PVDF 0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
| Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry | SCIEX | QTRAP4500 | |
| The software for data acquisition and analysis of product ion spectra | SCIEX | Analyst | |
| The software for data integration in quantitative analysis | SCIEX | MultiQuant | |
| HPLC system | Shimadzu | Nexera | |
| Glass bottle | Sansyo | 85-0002 | |
| d18:1/24:0 sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860592P | |
| Sphingosylphosphorylcholine | Merck | 567735 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| L-glutamine | ThermoFisher | 25030081 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Eagle’s minimum essential medium | Sigma | M4655 |
References
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