Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu quantifizieren und zu einzelnen Sphingomyelin Arten mit mehreren Reaktionskontrolle zu qualifizieren und MS/MS/MS-Modus, beziehungsweise.
Abstract
Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Analyse von Sphingomyelin (SM) qualitativ und quantitativ durch flüssige Chromatographie-Electrospray Ionisierung-Tandem-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS/MS). SM ist eine gemeinsame Sphingolipid bestehend aus einem phosphorylcholin und ein Ceramid als hydrophile und hydrophobe Komponente, beziehungsweise. Eine Reihe von SM-Arten sind in Säugerzellen aufgrund einer Vielzahl in der Sphingoid lange Kette base (LCB) und eine N-Acyl Glyko-in die Ceramid. In diesem Bericht zeigen wir eine Methode zur Schätzung der Zahl der Kohlenstoff und Doppelbindungen in einem LCB und eine N-Acyl Glyko-basierend auf ihren entsprechenden Produkt-Ionen in MS/MS/MS (MS3) Experimente. Darüber hinaus präsentieren wir eine Quantitative Analyse-Methode für SM mit zwei stabilen isotopisch beschriftete SM Arten, die erleichtert die Bestimmung der Reichweite in SM Quantifizierung verwendet. Das vorliegende Verfahren werden bei der Charakterisierung der SM Artenvielfalt in biologischen Proben und industrielle Produkte wie Kosmetika.
Introduction
Sphingomyelin (SM) ist eine gemeinsame Sphingolipid in Säugetierzellen. SM ist synthetisiert intrazellulär1 und Gegenwart als Vorstufe für andere Sphingolipide wie ein Sphingosine-1-Phosphat und ein Ceramid, die entscheidende Rolle im Immunsystem haben-Handel Handy und Barriere Homöostase, bzw.2Haut, 3. Daher ist die genaue Analyse des Stoffwechsels SM wichtig für die Aufklärung der physiologischen und pathologischen Rollen der Sphingolipide.
SM besteht aus einem Ceramid und ein phosphorylcholin, die mit 1-hydroxy-Gruppe von der Ceramid weiter ein Sphingosine und ein Nbesteht-Acyl Glyko-. Eine Vielzahl der Kohlenstoff- und Doppelbindung in der Sphingosine und NZahlen-Acyl Glyko-ergibt sich die Anzahl der Ceramid (und SM) Arten. Jüngste Fortschritte in der LC-ESI-MS/MS ermöglichte die quantitative und qualitative Analyse der SM4,5. In der qualitativen Analyse wurde die Anzahl der Kohlenstoff und Doppelbindungen der ein Sphingoid LCB SM identifiziert, durch die Zuordnung von Produkt Ion Spektren des LCB. Jedoch Strukturinformation der N-Acyl Glyko-wurde nicht direkt erhalten, weil die entsprechenden Produkt-Ionen nicht gemeldet worden sind, und daher N-Acyl-Moieties wurden durch differenzierte Analyse zwischen Vorläufer Ionen abgeleitet und Produkt-Ionen entsprechend LCB in sowohl positive als auch negative Ionen-Modi4,5. In diesem Bericht präsentieren wir eine Methode zur Erkennung der Produkt-Ionen des LCB und N-Acyl Glyko-gleichzeitig in MS3 -Modus mit triple Quadrupol und Quadrupol lineare Ionenfalle Massenspektrometrie, die die genaue Struktur erleichtert Spekulationen über jedes SM-Arten-6.
Die Ionen-Unterdrückung (oder Erweiterung) Auswirkungen verursacht durch die Matrix in biologischen Proben behindern die genaue Quantifizierung in LC-ESI-MS-Analyse, und daher ist es wünschenswert, Kalibrierkurven für alle Analyten von Interesse in der identischen Matrix erstellen von der biologischen Probe. Diese Strategie ist jedoch nicht zumutbar, weil es fast unmöglich, alle Arten von SM in biologischen Proben, vor allem in der umfassenden Analyse vorzubereiten. So ist es praktisch, eine Kalibrierungskurve zu konstruieren und den quantitativen Bereich mit einer repräsentativen SM Art versetzt in den biologischen Proben zu bestimmen. Wir verwendet zwei isotopischer beschriftet SM-Arten, um eine Kalibrierungskurve zu konstruieren; einer war für einen internen Standard und die andere für eine Standard-Verbindung verwendet. Wir haben eine kleine Menge SM-Art isotopischer beschriftet als standard Verbindung versetzt in biologischen Proben und erfolgreich eine Kalibrationskurve und quantitativen Bereich6festgestellt.
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Protocol
Finden Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (SDB) vor dem Gebrauch. Tragen Sie Handschuhe um Probe Verunreinigungen von der Haut abgeleitet SM zu minimieren. Dieses Protokolls galt, HeLa-Zellen gewachsen in Adlers minimale wesentliche Medium ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 1.000 U/L Penicillin und Streptomycin 100 mg/L.
1. Vorbereitung der Lipid-Proben
Hinweis: Es ist wichtig, dass alle Glaswaren, einschließlich Reagenzgläser mit Teflon ausgekleidet Schraubverschlüsse Waschmittel-frei sein.
- Gewinnung von insgesamt Lipid-Anteil aus Zelle Homogenat mit Bligh & Dyer Methode7
- Entfernen Sie die Kultur (oder konditioniert) Medien von 10 cm Gewebe Kulturschale und zweimal mit 6 mL eiskaltem PBS abspülen.
- Fügen Sie 1 mL eiskaltem PBS in 10 cm Gewebe Kulturschale P1000 Pipette. Ernte der Zellen mit Zelle Schaber und sammeln Sie in 2,0 mL silikonisierte Kunststoffrohre.
- Entfernen Sie nach Zentrifugation (1.000 × g, 5 min, 4 ° C) den Überstand durch ein P1000 Pipette.
- 1 mL Methanol hinzugeben. Vortex Rohre kurz und bei 200 W für 5 min in ein Bad-Typ sonikator beschallen.
Hinweis: Einstellen Sie das Wasser-Niveau in einem Bad-Typ sonikator so, dass die Zelle Pellet effizient homogenisiert wird. - Übertragen Sie die Zelle Homogenat in Methanol Pipette in Reagenzgläser (13 mm x 100 mm) mit Schraubverschlüssen Teflon ausgekleidet.
- Fügen Sie 1 mL Methanol, 1 mL Chloroform, 0,8 mL doppelt destilliertem Wasser und 50 µL 10 µmol/L des internen standard D18:1 /(D31)-16:0 SM in jedes Reagenzglas.
- Vortex Reagenzgläser energisch für 5 min bei Raumtemperatur.
Hinweis: an dieser Stelle eine einzelne Phase (Chloroform/Methanol/Wasser = 1/2/0,8 (V/V/V)) wird gebildet. - 1 mL Chloroform und 1,0 mL doppelt destilliertes Wasser zugeben.
- Vortex-Rohre kräftig bei 2.500 u/min für 5 min bei Raumtemperatur.
Hinweis: an dieser Stelle werden die wässrigen (oben) und organischen (unteren) Phase getrennt. - Nach Zentrifugation (2.150 × g, 5 min, 25 ° C), zu sammeln und die untere Phase in Einweg-Glasröhren (untere Anfangsphase) übertragen.
Hinweis: Sammeln Sie die untere Phase mit einer Pasteurpipette und eine Pipette Sicherheitsfilter. Setzen Sie die PIPETTENSPITZE in die untere Phase, die kleine Handpumpe neben der 'E'-Ventil, die obere Phase und Grenzflächen Flusen in der Pipettenspitze liefern und dann die untere Phase in die Pipette siphon. - Fügen Sie 2 mL Chloroform in den Reagenzgläsern und Wirbel Rohre kräftig bei 2500 u/min für 5 min bei Raumtemperatur ausreichend mit der oberen Phase und Grenzflächen Flusen zu mischen.
- Nach Zentrifugation (2.150 × g, 5 min, 25 ° C), sammeln Sie und übertragen Sie die modifizierte untere Phase in Einweg-Glasröhren mit der unteren Anfangsphase wie in Schritt 1.1.10 beschrieben.
- Stellen der Glasröhren unter einer Stickstoff-Stream und die organischen Lösungsmitteln in den gesammelten untere Phase vollständig zu entfernen.
- Rekonstruieren Sie die Proben mit 500 µL von Methanol oder Ethanol, mit 0,02 µm Filter Filtern und speichern in Glasfläschchen bei-20 ° C.
- Probenvorbereitung für die Eichkurve Konstruktion und Validierung der Methode
- Fügen Sie 50 µL 0.1, 0.5, 1, 5, 10 oder 50 µmol/L standard Verbindung (D18:1 /(D9)-18:1 SM) in Reagenzgläsern mit Schraubverschlüssen Teflon ausgekleidet.
- Fügen Sie Zelle Homogenat in jedes Reagenzglas und 1 mL fügen Sie Methanol hinzu.
Hinweis: Die Höhe der Zelle Homogenat als Matrix variiert je nach jedem Experiment. Wenn die SM-Arten in Proben von Zellen in der Kulturschale 10 cm abgeleitet routinemäßig analysiert werden, sollte die Höhe der Zelle Homogenat in jedes Reagenzglas in der Nähe der Zellen in der Kulturschale 10 cm sein. - Extrahieren Sie die gesamten Lipid-Anteil beschriebenen Schritte 1.1.6-1.1.14.
- Bereiten Sie Qualitätskontrolle vor (QC) Proben für die Validierung der Methode, wie in 1.2.1-1.2.3 Schritten umherspaziert. Drei QC Proben mit verschiedenen Konzentrationen der standard Verbindung vorbereiten (D18:1 /(D9)-18:1 SM): innert 3 x die untere Grenze der Standardkurve (QC-Low, QC-L), eines in der Nähe der Mitte (QC-Mitte, QC-M), und eines in der Nähe der oberen Grenze der Standardkurve (QC-hoch, QC-H).
(2) SM-Analyse von LC-ESI-MS/MS
- Vorbereitung der mobilen phase
- Mischen Sie das Lösungsmittel (Acetonitril/Methanol/DdH2O = 2/2/1 (V/V/V) für die wässrige Phase und Isopropanol für die organische Phase) in Glas-Flaschen mit Schraubverschlüssen Teflon ausgekleidet und für 5 min in ein Bad-Typ sonikator beschallen.
- Hinzufügen von Ameisensäure (Endkonzentration 26,4 Mmol/L) und NH4OH (14,9 Mmol/L) in jedem mobilen Phase.
- Qualitative Analyse der SM von LC-ESI-MS3
- Die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)-System zu aktivieren, die Glasflaschen, die mobile Phasen enthalten Einlass Röhrchen gesteckt und bereinigen die HPLC-Linien. Eine C-18 -HPLC-Säule (1,5 mm i.d. × 100 mm Länge, Partikel Größe 3,0 µm) mit der HPLC-Anlage verknüpfen, halten die Temperatur in der Spalte Ofen bei 50 ° C und Zustand der Spalte mit der wässrigen mobile Phase 100 µL/min. setzen die Proben in einem probenrack in der autosampl äh.
- Legen Sie die Parameter der triple Quadrupol und Quadrupol lineare Ionenfalle Massenspektrometrie System für MS3 -Analyse, wie in Tabelle 1 und Tabelle 2 sowie der ersten und zweiten Vorläufer Ionen der SM-Arten von Interesse aufgeführt.
- Doppelklick auf das Icon für die Datenerfassung, Doppelklick die Hardware-Konfiguration, wählen Sie "LC + QTRAP4500 + Valve" und klicken Sie auf "Profil aktivieren".
- Erstellen Sie einen neuen Unterordner, indem Sie auf "Neues Unterprojekt" und "OK".
- Klicken Sie auf die Registerkarte "Datei", wählen Sie "Neu" und "Übernahme-Methode" und "OK". Klicken Sie auf das Symbol 'Mass Spec' und 'MS' tab. Wählen Sie Scan-Typ als "MS/MS/MS (MS3)", Abtastrate als 10.000 Da/s, Polarität als "Negativ" und "Dauer" als ganze Zeit analysiert (min) sein. M/Z 'Start (Da)' und 'Stop (Da)' als zu scannenden Bereichs festgelegt. Stellen Sie die m/Z der 1. und 2. Vorläufer Ionen des Ziels SM Arten von Interesse.
Hinweis: Um mehrere SM-Arten zu analysieren, markieren die "-MS3" Symbol, klicken Sie rechts, wählen Sie "Copy dieses Experiment" und setzen Sie dann die m/Z der 1. und 2. Vorläufer Ionen anderer SM-Arten. - Wählen Sie die Registerkarte "Advanced MS", und legen Sie jeden Parameter wie folgt: Scan-Modus als "Profil", Schrittweite als 0,12 (Da), Auflösung Q1 und Q3 'Einheit' und 'Beleuchtet', bzw. Intensität Schwelle als 0, Abbindezeit 50 (ms), Pause zwischen Masse reicht als 1,5 ms, wählen Sie "dynamische Zeit zu füllen ", Q3 Eintrittsbarriere als 8V und Erregung Zeit als 25 ms.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche "Parameter bearbeiten" im Reiter "MS" und wählen Sie die "Quelle/Gas" tab. Legen Sie die Parameter der Vorhang Gas, Kollision Gas, Ionspray Spannung, Temperatur, Ionen-Quelle gas1 und gas2 wie in Tabelle 1aufgeführt. Dann wählen Sie "Compound" tab. legen die Parameter der declustering Potenzial, Eingang Potenzial, Aufprallenergie, Anregungsenergie und Aufprallenergie verteilt wie in Tabelle 2aufgeführt.
- Markieren Sie "Integrierte Valco Valve" und wählen Sie 'Position Name für Schritt 0' a und "B" als Position für insgesamt 5,0 min Zeit. Legen Sie auch 'A' als Position für insgesamt 70,0 min..
- Markieren Sie "Shimadzu LC-System". Wählen Sie die Registerkarte "Pump" und legen Sie Pumpen Modus als binäre Flow, Gesamtfluss als 0,28 mL/min und maximal druckgrenzen als 20,0 MPa. Wählen Sie die Registerkarte "Autosampler" und stellen Sie die Spülung Lautstärke als 200 µL, Nadel Hub 52 mm, Spülung 35 µL/s Geschwindigkeit, Geschwindigkeit als 5.0 µL/s Probenahme, Spülzeit 25,0 min, spülen Sie Dip-Mal als 5 s und spülen Modus als "Vor und nach dem Absaugen".
- Darüber hinaus ermöglichen die Kühlereinheit, als 4 ° C kühlere Temperatur einstellen und das Fläschchen Nadel Regelhub 52 mm. Wählen Sie die Registerkarte "Ofen" ermöglichen den Ofen und die Ofentemperatur und die maximale Temperatur 50 ° C und 85 ° C "bzw." festgelegt.
- Wählen Sie die Registerkarte "Controller" und aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Einschalten". Wählen Sie die Registerkarte "Zeitprogramm" und legen Sie die Lösungsmittel Steigungen wie folgt: Lösungsmittel A / B im Verhältnis 100/0 für 5 min Programm lineare Änderungen an 80/20 über 4 min, 35/65 über 50 min und 25/75 über 1 min. danach , halten Sie sie an 25/75 für 10 min, dann linear auf 100/0 über 4 min. Speichern Sie anschließend die Methode.
- Batch-Datei erstellen
- Doppelklick das "Bauen Erwerb Batch"-Symbol, klicken Sie auf ' hinzufügen ', "Hinzufügen Proben", legen Sie die Anzahl der neuen Proben, und klicken Sie auf "OK".
- Klicken Sie auf "Methode Editor" und wählen Sie die Methode verwendet werden. Wenn mehrere Methoden in einer Batch-Datei verwendet werden, aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Verwendung mehrerer Methoden" und wählen Sie die Erwerbsmethode für jede Probe. Benennen Sie "Probe", legen Sie die entsprechende Anzahl für "Fläschchen Position", und geben Sie die Menge der Einspritzmenge. Speichern Sie die Batch-Datei.
- MS3 Produkt Ion Spektren der SM-Arten von Interesse durch LC-ESI-MS3 -Analyse zu erhalten
- Wählen Sie die Registerkarte 'Senden' in Batch-Datei, markieren Sie die Zeile der zu analysierenden Proben, und klicken Sie auf die Schaltfläche "Senden".
- Klicken Sie auf die '' Ansicht Quene "Symbol"Äquilibriert"-Symbol, wählen Sie die Erwerbsmethode verwendet werden, die Uhrzeit als 1 min und klicken Sie auf"OK".
- Deaktivieren Sie "Reserve Instrument für Tuning" durch Anklicken des entsprechenden Symbols. Führen Sie dann Stapelsequenz durch Anklicken des Symbols "Sample starten".
- Weisen Sie jeder MS3 Produkt Ion Spektren des SM durch den Vergleich der Masse Verhältnis (m/Z) des Produktes berechnen Ionen-Spektren und die genaue Masse der Sphingoid LCB und N-Acyl Glyko-von Interesse. Ermitteln die Anzahl von Kohlenstoffatomen und doppelte Anleihen in der Sphingoid LCB und N-Acyl Glyko-gemäß der entsprechenden Produkt-Ionen.
- Bestätigen Sie, dass der entsprechende Sub-Projekt-Ordner ausgewählt ist, dann doppelklicken Sie das Symbol "Open Data File", und wählen Sie die Proben analysiert werden. Ziehen Sie die Peak im Chromatogramm für jedes Ziel SM Arten und klicken Sie dann doppelt. Die erhaltenen MS3 Produkt Ion Spektren im Bereich gezogen werden vorgestellt.
- Quantitative Analyse des SM durch LC-ESI-MS/MS
- Legen Sie die mobilen Phasen und HPLC-Säule, wie unter Punkt 2.1 und 2.2.1 beschrieben.
- Legen Sie die Parameter der triple Quadrupol und Quadrupol lineare Ionenfalle Massenspektrometrie System für mehrere Reaktion monitoring (MRM) Analyse, wie in Tabelle 1 und Tabelle 2aufgeführt.
- Führen Sie die Verfahren, wie in Schritt 2.2.2.1 und 2.2.2.2 beschrieben.
- Klicken Sie auf die Registerkarte "Datei", wählen Sie "Neu" und "Übernahme-Methode" und "OK". Klicken Sie auf das Symbol 'Mass Spec' und 'MS' tab. Wählen Sie Scan-Typ als "MRM" Polarität "Positiv". Legen Sie "Dauer", als die ganze Zeit analysiert werden. Legen Sie den m/Z [M + H]+ und 184 als "Q1 (Da)' und 'Q3 Masse (Da)" des Ziels SM Arten von Interesse, jeweils. Festlegen Sie 'Zeit' als 10 ms und "ID" als Namen für das Ziel SM Arten.
- Wählen Sie die Registerkarte "Advanced MS", und legen Sie jeden Parameter wie folgt: sowohl die Auflösung Q1 und Q3 als "Einheit", Intensität Schwelle als 0, Zeiteinstellung 0 (ms) und Pause zwischen Masse reicht als 5 ms.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche "Parameter bearbeiten" im Reiter "MS" und wählen Sie die "Quelle/Gas" Registerkarte legen Sie die Parameter der Vorhang Gas und Kollision Gas, Ionspray Spannung, Temperatur, Ionen-Quelle gas1 gas2 wie in Tabelle 1aufgeführt. Wählen Sie dann die "Compound" Registerkarte "setzen Sie die Parameter des declustering Potenzial, Eingang Potenzial, Aufprallenergie und Kollision Zelle Ausfahrt Potenzial wie in Tabelle 2aufgeführt.
- Stellen Sie das Ventil, wie in Schritt 2.2.2.6 beschrieben.
- Legen Sie die LC-Bedingung, wie in Schritt 2.2.2.7 beschrieben. Speichern Sie anschließend die Methode.
- Die Batch-Datei zu erstellen, wie unter Punkt 2.2.3 beschrieben.
- Erhalten Sie die MRM-Daten der einzelnen SM-Arten durch LC-ESI-MS/MS-Analyse, wie unter Punkt 2.2.4 beschrieben.
- Mit der Software für Datenintegration MRM Daten verarbeiten und die Daten der Peakfläche für die extrahierten Ion Chromatogramm der einzelnen SM-Arten zu erhalten.
- Doppelklick auf das Icon für die Datenintegration in der quantitativen Analyse, klicken Sie auf die Registerkarte "Bearbeiten" und wählen Sie Benutzer standardmäßig Integration. Festlegen Sie "glockenförmig" glatte Breite als 1,0 Punkte, und klicken Sie auf "OK". Klicken Sie auf die Registerkarte "Bearbeiten" und wählen Sie "Neue Tabelle". Wählen Sie das Beispiel integriert werden, klicken Sie auf einen Pfeil, und klicken Sie auf "Weiter". Wählen Sie "Erstellen neue Methode", legen Sie den Namen der Methode, und klicken Sie auf "Weiter". Klicken Sie auf "Weiter" und aktivieren Sie das Kontrollkästchen D18:1 /(D31)-16:0 SM ist, klicken Sie auf "Weiter", und klicken Sie auf "Fertig stellen".
- Klicken Sie auf "Zeigt den Gipfel-Beitrag" und bestätigen Sie, dass die Chromatogramm Gipfel entsprechend anerkannt werden. Ist anzumerken, dass die Verweilzeit des D18:1 /(D31)-16:0 SM ist in der Regel um kleiner ~ 0,3 min im Vergleich zu der eines der 34-1 SM (in der Regel besteht der D18:1 / 16:0 SM).
- Jede SM-Art entsprechend dem Verhältnis der Spitze der einzelnen SM-Arten, die D18:1 /(D31)-16 zu quantifizieren: 0 SM interner Standard.
- Klicken Sie auf die Registerkarte "Datei", wählen Sie "Exportieren", wählen Sie "Tabelle", bestätigen Sie das Format als "MultiQuant", Spalten, wie "alle Spalten"Exportieren", Zeilen wie"Alle Zeilen außer diesen explizit versteckte "Exportieren", und klicken Sie dann auf "OK".
- Öffnen Sie die exportierte Datei in die Excel-Software. Das Gebiet des Ziels SM-Arten durch die Fläche des IS zu normalisieren (D18:1 /(D31)-16:0 SM). Multiplizieren Sie dann mit der theoretischen Menge des IS in der injizierten Probe zur Berechnung des Ziels SM-Arten in der injizierten Probe.
- Erstellung der Standardkurve
- Die MRM Daten von D18:1 /(D9)-18:1 SM und D18:1 /(D31)-16:0 SM in den Proben für das Konstruieren der Standardkurve von LC-ESI-MS/MS-Analyse, wie in Schritt 2.3.1-2.3.4 beschrieben.
- Die Daten der Peakfläche des D18:1 /(D9)-18:1 SM und D18:1 /(D31)-16:0 SM wie in Schritt 2.3.5 beschrieben.
- Berechnen Sie die Menge der D18:1 /(D9)-18:1 SM in der injizierten Probe gemäß Schritt 2.3.6.
- Die Trendlinie zu konstruieren, durch Festlegen der X-Achse und die Y-Achse als der Nominalbetrag und berechnete Menge an D18:1 /(D9)-18:1 SM und erhalten die Trendlinie-Formel.
- Die quantitative Methode mit Excel Software Validierung
- Für die Validierung der Methode, die Menge der D18:1 /(D9)-18 zu quantifizieren: 1 SM und D18:1 /(D31)-16:0 SM in der QC Proben durch die Analyse jedes QC Probe mindestens dreimal in 1 Tag, und wiederholen Sie mindestens 3 Tage, wie in Schritt 2.3.1-2.3.4 beschrieben.
- Die Spitze Bereich Daten und berechnen Sie die Menge der D18:1 /(D9)-18:1 SM in der injizierten Probe gemäß Schritt 2.3.5 und 2.3.6.
- Nach der Eichkurve erhalten, berechnen die Höhe der D18:1 /(D9)-18:1 SM in der injizierten Probe.
- Bewertung der Genauigkeit
- Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung der Höhe der D18:1 /(D9)-18:1 SM erhaltenen in Schritt 2.5.3 auf das Dataset die Intra-day und Inter Tag mit Excel-Software.
- Der Durchschnitt in Schritt 2.5.4.1 erhaltenen ist geteilt durch die Standardabweichung und ausgedrückt als %.
- Bewertung der Genauigkeit
- Berechnen Sie die Richtigkeit der einzelnen Angaben wie folgt:
[(Die berechneten Betrag im Schritt 2.5.3.) / (Nominalbetrag) - 1] × 100(%) - Berechnen Sie den Mittelwert der Absolute Wert der Genauigkeit für das Dataset die Intra-und Inter Tag.
- Berechnen Sie die Richtigkeit der einzelnen Angaben wie folgt:
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Representative Results
Chemisch synthetisiert D18:1 / 24:0 cm (Abbildung 1A) und D18:1 / 24:0 SM in Lipid-Proben von HeLa-Zellen (Abbildung 1B) extrahiert wurden durch LC-ESI-MS3 [M + HCOO]– und [M-CH3] analysiert- als ersten und zweiten Vorläufer Ionen, beziehungsweise. Beachten Sie, dass die Spektrum Intensität der demethylated-Sphingosylphosphorylcholine (SPC) (m/Z 449) größer ist als die der SM N-Acyl Glyko-(m/Z 378). Darüber hinaus ist das Spektrum entspricht [M-Cholin-CH3 (Sphingosine-1-Phosphat)]- ist auch nützlich, um das LCB des SM zuweisen. Wir bestätigte auch, dass das Spektrum der demethylated-SPC (m/Z 449) hauptsächlich aus D18:1 SPC unter der Bedingung unserer MS3 Analyse (Abbildung 1C) hergestellt wird.
Die Eichkurve mit zwei isotopisch beschriftete SM-Arten wurde in Abbildung 2Agezeigt. Die Trendlinie wurde durch die Anwendung der 1 / x2als den Gewichtungsfaktor erhalten. Das Ergebnis der restliche Analyse wurde in Abbildung 2Bgezeigt. Beachten Sie, dass der Restwert in der Nähe von Untergrenze der Quantifizierung (0.1 Pmol in diesem vorliegenden Studie) kleiner war, durch die Anwendung der 1 / x2als den Gewichtungsfaktor.
Die Parameter für die erhaltenen Eichkurve und das Ergebnis der Validierung wurden in Tabelle 3dargestellt. Der Wert der Genauigkeit und Präzision waren innerhalb von ± 15 %, zeigen, dass die vorliegende Studie als Quantifizierung Methode mit LC-MS8die Kriterien erfüllt.
Die Höhe der einzelnen SM-Arten in der HeLa-Zellen wurde in Tabelle 4gezeigt. HeLa-Zellen wurden in Kulturmedien mit 10 % gewachsen FBS und geerntet. D18:1 / 16:0 SM und D18:1 / 24:1 SM waren die meisten und zweithäufigste SM Arten, deren Struktur bestimmt wurden, und bestehen aus 54 % und 14 % der gesamten SM bzw.
Abbildung 1 . MS3 Spektren von bestimmten m/Z Signale des SM in HeLa-Zellen. MS3 -Spektren von chemisch synthetisierten D18:1 / 24:0 SM (A) und D18:1 / 24:0 SM in Lipid-Proben von HeLa-Zellen (B) extrahiert werden angezeigt. Die Ergebnisse wurden angepasst von Hama Et al. 6 beachten Sie, dass die Spektrum Intensität des ergänzenden Schutzzertifikats größer als die von der N-Acyl Glyko-von infrarotem MS3 Spektren von chemisch synthetisierten D18:1 SPC werden angezeigt (C) durch den Einsatz von Ionen mit identischen m/Z ([M + HCOO]-, m Standardfall 499) als die 1. und 2. Vorläufer Ionen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Kalibrierkurven von SM mit zwei isotopischer beschriftet SM Art. (A) die Kalibrierung Kurve mit zwei isotopischer beschriftet SM-Arten (D18:1 /(D9)-18:1 SM und D18:1 /(D31)-16:0 SM). Kalibrierkurven entstanden mit den Gewichtungsfaktor = 1 / x2. Die Ergebnisse der Validierung sind in Tabelle 3aufgeführt. (B) verbleibende Analyse für die Beurteilung der Güte einer konstruierten Kalibrierkurve. Die Residuen in der Eichkurve mit den Gewichtungsfaktor = 1 / x2 ist kleiner als die, die mit den Gewichtungsfaktor = 1 / X oder 1, vor allem in einer geringeren Menge an D18:1 /(D9)-18:1 s. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version davon Abbildung.
| TurboIonSpray Einstellungen | ||||||
| Modus | Vorhang-Gas (Psi) | Kollision Gas | Ionen-Spray Spannung (V) | Temperatur (° C) | Ionen-Quelle Gas 1 (Psi) | Ionen-Quelle Gas 2 (Psi) |
| MS3 | 40 | Hoch | -4500 | 200 | 40 | 80 |
| MRM | 40 | 10 | 5500 | 300 | 40 | 80 |
Tabelle 1. Die Bedingungen der Elektrospray-Ionenquelle für die qualitative und quantitative Analyse. Diese Tabelle wurde von Hama Et al. 6
| Modus | Polarität | Vorläufer Ionen (Q1) | Produkt-Ion oder 2. Vorläufer Ionen (Q3) | declustering Potential (V) | möglichen Eintritt (V) | Aufprallenergie (V) | Kollision Zelle Ausfahrt Potenzial (V) | Aufprallenergie verteilt (V) | Erregung Zeit (ms) | Geschwindigkeit (Da/SEK) | Zeit (s) | Auflösung |
| MRM | positive | [M + H] + | 184 | 1 | 10 | 35 | 12 | - | - | - | 5.364 | Einheit |
| MS3 | negative | [M + HCOO] - | M-15 | -26 | -10 | -40 | - | 0 | 25 | 10000 | automatisch berechnetes | Einheit |
Tabelle 2. Die Parameter der MS3 und MRM-Modus in triple Quadrupol und Quadrupol lineare Ionenfalle Massenspektrometrie zur qualitativen und quantitativen Analyse bzw.. Diese Tabelle wurde von Hama Et al. 6
Tabelle 3. Die Parameter für die erhaltenen Eichkurve und das Ergebnis der Validierung. Die Ergebnisse wurden angepasst von Hama Et al. 6
| molekülsorten SM | Betrag (Pmol/mg Protein) |
| D18:1 / 14:0 | 115,5 |
| D16:1 / 16:0 | 115,5 |
| D17:1 / 16:0 | 239.8 |
| D18:2 / 16:0 | 449,9 |
| D18:1 / 16:0 | 3355.1 |
| D18:0 / 16:0 | 203.8 |
| D18:1 / 17:0 | 106,3 |
| D18:2 / 18:0 | 26.5 |
| D20:0 / 16:1 | 94,9 |
| D18:1 / 18:0 | 94,9 |
| D18:2 / 22:0 | 102,3 |
| D18:1 / 22:0 | 235 |
| D18:1 / 23:1 | 83,3 |
| D18:1 / 23:0 | 23,9 |
| D18:1 / 24:2 | 286.5 |
| D18:2 / 24:1 | 286.5 |
| D18:1 / 24:1 | 853.2 |
| D18:1 / 24:0 | 94,6 |
| D18:1 / 25: 1 | 12.9 |
Tabelle 4. Die Höhe der einzelnen SM-Arten in HeLa-Zellen. HeLa-Zellen wurden in Kulturmedien mit 10 % gewachsen FBS. Zellen wurden geerntet, und insgesamt Lipid-Anteil von Bligh & Dyer Methode extrahiert wurde. Die Ergebnisse wurden angepasst von Hama Et al. 6
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Discussion
In dem vorliegenden qualitativen Verfahren, die wir erhalten, MS3 Produkt Ionen eine SPC und ein N-Acyl Glyko-. Es ist wichtig, richtig ordnen Sie eine SPC und ein N-Acyl Glyko-. Zu diesem Zweck sollte angemerkt werden, dass andere phosphorylcholin-haltige Moleküle auch als MS3 Produkt Ionen nachgewiesen werden können. Diacyl-Phosphatidylcholin (PC) und Plasmalogen-PC sind reichlich vorhanden in Säugetierzellen und ihre Hydrophobie ist ähnlich dem von SM. Daher können Diacyl-PC und Plasmalogen-PC mit ein Isotop (in der Regel 13C) theoretisch gleichzeitig mit SM erkannt werden. In unseren Experimenten beobachtet die MS3 Produkt Ionen Plasmalogen-PC gleichzeitig in der SM-Analyse. Es ist hilfreich, um richtig auswählen die MS3 Produkt Ionen der SM zu wissen, dass die Spektrum Intensität des ergänzenden Schutzzertifikats größer ist als die der SM N-Acyl Glyko-(Abbildung 1A und B). Im Gegensatz dazu ist die Intensität der fetthaltigen Acyl-Glyko-größer als (oder fast identisch), demethylated Lysoplasmalogen-PC (Daten nicht gezeigt).
In dem vorliegenden quantitativen Verfahren ist es wichtig, genau Proben vorzubereiten für den Bau der Eichkurve und Validierung der Methode. Darüber hinaus sollte der Gewichtungsfaktor ordnungsgemäß verwendet werden, um die Eichkurve konstruieren; Es empfiehlt sich, die Kurvenanpassung vor allem bei einer niedrigen Konzentration zu verbessern. Wir verglichen die Kalibrierkurven mit unterschiedlichen Gewichtungsfaktoren. Die Kurvenanpassung bei niedrigen Konzentration wurde deutlich verbessert, mithilfe des Gewichtungsfaktors = 1 / x2 im Vergleich, dass mit den Gewichtungsfaktor = 1 oder 1 / x (Abbildung 2B). Der Wert von Präzision und Genauigkeit sollte innerhalb von ± 15 % sein. Wenn die Konzentration des QC-L mit der unteren Grenze der Standardkurve (untere Grenze der Quantifizierung) identisch ist, sollte es innerhalb von ± 20 %8.
Wir Beschäftigten die Bligh & Dyer-Methode, die insgesamt Lipid-Anteil aus kultivierten Zellen in dieser Studie zu extrahieren. Andere Methoden für Lipid-Extraktion, z. B. die Folch Methode sind ebenfalls nützlich,9. Es ist wichtig, die Lipid-Anteil mit der entsprechenden Methode nach den Betrag und/oder Eigenschaften der Proben zu extrahieren. Die Zahl der SM-Arten gleichzeitig analysiert in jeder Injektion sollte nicht zu groß sein, um zu verhindern, dass eine Überlastung der Software für die Datenerfassung. Die geplante MRM wird für eine Reihe von SM-Arten gleichzeitig Quantifizierung nützlich sein.
Unsere gegenwärtigen Methode mit MS3 Analyse eignet sich zu spekulieren, die Anzahl der Kohlenstoff und Doppelbindungen des LCB und N-Acyl Glyko-SM ohne zusätzliche Geräte. Jedoch kann nicht andere strukturelle Informationen wie die Position von Doppelbindungen, Isomer (Cis oder Trans) und Form (gerade oder verzweigt) abgerufen werden. Es ist notwendig, höhere Energie zu nutzen, um Produkt-Ionen und ihre strukturelle Informationen über Zusatzinstrumente10,11,12,13. Die Summenformel der Produkt-Ionen entspricht N-Acyl Moieties war [RCO2]– -Ionen, die keinen Stickstoff enthalten. Es ist derzeit unbekannt, wie die Kollision Dissoziation Erlös induziert.
Für MS-3 -Analyse ist es wichtig, die Parameter der Aufprallenergie (CE) und Erregung Zeit für MS3 Fragmentierung (ExT) anpassen. Eine höhere CE verursachen übermäßige Fragmentierung und reduzieren die Intensität des das Produkt Ion des demethylated SM als 2Nd Vorläufer Ionen. Darüber hinaus ist die Fragmentierung Muster deutlich abhängig von der ext. Vor den versuchen ist es wünschenswert, bestimmen die entsprechende Bedingung der CE und ExT, die die Intensität der Ionen des demethylated SM, SPC und NProdukt zu maximieren-Acyl Glyko-durch Infusion synthetische SM in der mobilen Phasen aufgelöst.
Wir verwendeten D18:1 /(D9)-18:1 SM und D18:1 /(D31)-16:0 SM als zwei isotopischer beschriftet SM-Spezies, die Eichkurve zu konstruieren. Die Effizienz der Ionisation variiert nach der SM-Art und den Zustand der mobilen Phase. Also, wenn die Zahl der SM von Interesse begrenzt ist, ist es wünschenswert, isotopischer beschriftet SM Arten von Interesse für genauere Quantifizierung vorzubereiten.
Die SM-Struktur wurde bisher nach dem Vorläufer-Ion und das Produkt Ion entspricht demethylated SPC bestimmt. Darüber hinaus war es manchmal behindert, um die Untergrenze der Quantifizierung in der Gegenwart Probenmatrix genau zu bestimmen, da die Ziel-Verbindungen des Interesses in der Probenmatrix reichlich vorhanden waren.
Die vorliegende Studie ist nützlich zur Schätzung der Anzahl der Kohlenstoff- und Doppelbindungen in einem LCB und eine N-Acyl Glyko-basierend auf ihren entsprechenden Produkt-Ionen in MS3 Experimente ohne zusätzliche Instrumente. Darüber hinaus präsentieren wir eine Quantitative Analyse-Methode für SM mit zwei stabilen isotopisch beschriftete SM Arten, die erleichtert die Bestimmung der Reichweite in SM Quantifizierung verwendet. Das vorliegende Verfahren werden bei der Charakterisierung einer Vielzahl von einzigartigen SM-Spezies in verschiedenen biologischen Proben und Industrieprodukte.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenskonflikt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein Forschungsstipendium für das Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie von Japan (KAKENHI), K.H (#15 K 01691), Y.F. (#15 K 08625), K.Y (#26461532) und ein Stipendium für das Studium der hartnäckigen Krankheit-Projekt vom Ministerium für Gesundheit, Arbeit und Wohlfahrt (K.Y #201510032A). Wir danken der Edanz Gruppe (www.edanzediting.com/ac) für die Bearbeitung eines Entwurfs des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100 mm tissue culture dish | IWAKI | 3020-100 | |
| Cell scraper | IWAKI | 9000-220 | |
| Siliconized 2.0 mL tube | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Test tube | IWAKI | TST SCR 16-100 | |
| Teflon-lined screw cap | IWAKI | 9998CAP415-15 | |
| Disposable glass tube | IWAKI | 9832-1310 | |
| CAPCELL PAK C18 ACR 3 µm 1.5 mm I.D. x 100 mm | Shiseido | 92223 | Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column |
| CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE | Shiseido | 12197 | |
| Cartridge holder | Shiseido | 12415 | |
| Acetonitrile | Wako | 018-19853 | |
| 2-Propanol (Isopropyl Alcohol) | Wako | 161-09163 | |
| Methanol | Wako | 134-14523 | |
| Formic acid | Wako | 066-00466 | |
| 28% Ammonia water | Wako | 016-03146 | |
| Sonicator (bath type) | SHARP | UT-206H | |
| Vortex mixer for glass test tube | TAITEC | Mix-EVR | |
| 1.4 mL glass vial | Tomsic | 500-1982 | Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20°C |
| 8 mm septum | Tomsic | 200-3322 | When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum |
| Screw cap for 1.4 mm glass vial | Tomsic | 500-2762 | |
| Screw cap with slit septum | Shimadzu GLC | GLCTV-803 | |
| PVDF 0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
| Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry | SCIEX | QTRAP4500 | |
| The software for data acquisition and analysis of product ion spectra | SCIEX | Analyst | |
| The software for data integration in quantitative analysis | SCIEX | MultiQuant | |
| HPLC system | Shimadzu | Nexera | |
| Glass bottle | Sansyo | 85-0002 | |
| d18:1/24:0 sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860592P | |
| Sphingosylphosphorylcholine | Merck | 567735 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| L-glutamine | ThermoFisher | 25030081 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Eagle’s minimum essential medium | Sigma | M4655 |
References
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