Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Replikering av beställt, Nonredundant bibliotek av Pseudomonas aeruginosa stam PA14 Transposon införande mutanter

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57298
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 2,3, 1,4, 1,4
1Department of Pediatrics, Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 3Department of Genetics, Harvard Medical School, 4Department of Pediatrics, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Pseudomonas aeruginosa infektion orsakar betydande sjuklighet i utsatta värdar. Nonredundant transposon införande mutant biblioteket av P. aeruginosa stam PA14, betecknas som PA14NR inställd, underlättar analys av genen funktionalitet i flera olika processer. Presenteras här är ett protokoll för att skapa högkvalitativa kopior av PA14NR ställa mutant biblioteket.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa är en fenotypiskt och genotypically mångsidiga och anpassningsbara gramnegativa bakterie, allestädes närvarande i mänskliga miljöer. P. aeruginosa kan bilda biofilmer, utveckla antibiotikaresistens, producera virulensfaktorer och snabbt utvecklas i samband med en kronisk infektion. Således kan P. aeruginosa kan orsaka både akuta och kroniska, svårbehandlade infektioner, som skulle vilket resulterar i betydande sjuklighet i vissa patientgrupper. P. aeruginosa stam PA14 är en mänskliga kliniska isolat med bevarade genomets struktur som infekterar olika däggdjur och nonvertebrate värdar att göra PA14 ett attraktivt stam för att studera denna patogen. I 2006 genererades en nonredundant transposon införande mutant bibliotek som innehåller 5,459 mutanter motsvarar 4.596 förutspådda PA14 gener. Sedan dess har har fördelningen av PA14 biblioteket tillåtit forskarsamhället att bättre förstå funktionen av enskilda gener och komplexa vägar av P. aeruginosa. Underhåll av bibliotek integritet genom replikeringen kräver korrekt hantering och precisa tekniker. Därför presenterar detta manuskript protokoll som beskriver i detalj stegen inblandade i biblioteket replikering, bibliotek kvalitetskontroll och korrekt lagring av enskilda mutanter.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa är en fenotypiskt och genotypically mångsidiga och anpassningsbara gramnegativa bakterie som förekommer i jord, vatten, och de flesta mänskliga miljöer, samt hudens mikroflora. P. aeruginosa jämfört många bakteriearter, och har en relativt stor genomet hos 5.5-7 Mbp med höga G + C innehåll (65-67%). Dessutom en betydande del av dess gener är involverade i metabola anpassningsförmåga och är en del av regulatoriska nätverk, vilket möjliggör stor flexibilitet som svar på miljömässig stress1. P. aeruginosa uttrycker en uppsjö av virulensfaktorer, uppvisar benägenhet att bilda biofilmer, besitter förmågan att samordna Svaren genom flera quorum sensing vägar och visar en anmärkningsvärd kapacitet att utveckla antibiotikaresistens och tolerans2,3,4,5,6,7,8. Dessa attribut presenterar betydande utmaningar för behandling av infektioner orsakade av P. aeruginosa.

Kronisk P. aeruginosa infektioner kan förekomma vid många sjukdomstillstånd. Cystisk fibros (CF), en genetisk sjukdom som orsakas av mutation av genen Cystisk fibros Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) , resulterar i inspissated, infekterade sekret i luftvägarna, progressiv bronkiektasi och slutligen döden från andningssvikt9. Av vuxenlivet, är majoriteten av patienter med CF kroniskt infekterade med P. aeruginosa, som spelar en nyckelroll i sjuklighet och dödlighet associerade med denna sjukdom10. Dessutom, är patienter med svår Bränn skador11, tracheostomies12, ledplastik13eller inneboende katetrar14 i riskzonen för P. aeruginosa infektion relaterade till bakteriernas förmåga att bilda biofilmer och fly värd inflammatoriskt svar15. Vidare uppstår koloniseringen utan konkurrens efter en multi antibiotikaresistenta eller toleranta befolkning väljs genom ett brett spektrum, sekventiell antimikrobiell behandling12,16,17 , 18. bättre förstå patogenesen av P. aeruginosa kommer att ha betydande konsekvenser för många sjukdomstillstånd.

Flera P. aeruginosa kliniska isolat, inklusive stammar PAO1, PA103, PA14 och PAK, har studerats för att undersöka olika funktioner av P. aeruginosa patogenes. Stam PA14 är en kliniska isolat som tillhör en av de vanligaste klonala grupper världen över19,20 och har inte varit i stor utsträckning anpassade i laboratoriet. PA14is mycket virulent i ryggradsdjur modeller av infektion, med en märklig endotoxin profil21, pili strukturera22, patogenicitet öar23, typ III-sekretionssystemet (TTSS), cytotoxicitet mot däggdjurs celler24 och profiler i antibiotika resistens och uthållighet25. Dessutom PA14 är också mycket virulent i talrika värd-patogen modellsystem, inklusive växters blad infiltration modeller26,27,Caenorhabditis elegans infektion modeller28, 29, insekt modeller30,31, samt mus lunginflammation modeller32,33 och brännskada på huden modeller34.

Genome-wide mutant bibliotek är samlingar av syngena mutanter i onödiga gener som utgör mycket kraftfulla verktyg för att förstå biologin hos en organism genom att låta analys av geners funktion på genomisk nivå. Två nära-saturation transposon införande mutant bibliotek byggdes P. aeruginosa är för närvarande tillgängliga för distribution. Transposoner införande webbplatser har fastställts för båda biblioteken. Dessa så kallade nonredundant bibliotek underlätta genome-wide studier av bakteriestammar genom att avsevärt minska tiden och kostnaden inblandade i screening uncharacterized slumpmässiga transposon mutanter. P. aeruginosa PAO1 transposon mutant biblioteket, byggda i MPAO1 isolera stam PAO1 använder transposoner ärphoA/ hah och ärLindholm/ hah35, är curerad av Manoil lab, University of Washington. Biblioteket består av en sekvens-verifierade samling 9 437 transposon mutanter som ger brett genomet täckning och inkluderar två mutanter för de flesta gener36. Information om P. aeruginosa PAO1 transposon mutant biblioteket finns på offentliga, internet-tillgängliga Manoil Labs webbplats på http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm. De P. aeruginosa stam PA14 nonredundant transposon införande mutant bibliotek (PA14NR anges) konstruerade stam PA14 använder transposoner MAR2xT7 och TnphoA37 distribueras för närvarande av den institutionen för pediatrik vid Massachusetts General Hospital. PA14NR Set består av en samling av mer än 5 800 mutanter med enda transposon infogningar i onödiga gener37. Detaljer om byggandet av den PA14NR som beskrivs i offentliga, internet-tillgängliga webbplats http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB, som också innehåller en mängd online-sökning verktyg för att underlätta användningen av PA14NR Ställa in.

Den ursprungliga PA14NR Set består 5,459 mutanter, utvalda från ett omfattande bibliotek med cirka 34.000 slumpmässiga transposon införande mutanter, som motsvarar 4.596 förutspådda PA14 gener som representerar 77% av alla förväntade PA14 gener37. Sedan byggandet av biblioteket i 2006 lades nya mutanter, och för närvarande PA14NR Set innehåller mer än 5 800 mutanter38 som representerar cirka 4.600 PA14 gener. Majoriteten av PA14 transposon mutanter genererades i de vildtyp bakgrund37. Detaljer om varje medlem av muterade bibliotek, inklusive genetiska bakgrund, finns antingen genom söka online-databas, eller genom att ladda ner på Nonredundant bibliotek kalkylbladet, båda funktioner som är tillgängliga på webbplatsen PA14 (http:// pa14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/pa14/Home.cgi). Majoriteten av mutanter har skapats med hjälp av MAR2xT7 (MrT7) transposon, med en liten uppsättning som skapats med hjälp av de TnPhoA (phoA) transposon37. Varje transposon har en antibiotikaresistens kassett, som möjliggör mutant urval med gentamicin (MrT7) eller kanamycin (phoA). Den PA14NR uppsättningen av mutanter lagras i sextio-tre 96 brunnar och inkluderar två ytterligare 96 brunnar kontroll pläterar, som består av wild typ PA14 inokuleras och uninoculated brunnar interkalenderat i ett förinställt mönster. Plattan med 96 brunnar formatet parat med online-sökning verktyg kraftigt underlättar anpassade utvecklingen av screening analyser som tillåter användare att enkelt identifiera gener associerade med muterade fenotyper. De online-sökning verktyg kommer också att underlätta sökning och val av ytterligare relevanta mutanter som krävs för fortsatta studier.

PA14 och PAO1 transposon mutant biblioteken är mycket viktiga globala resurser för det vetenskapliga samfundet, och de kompletterar varandra i validera okänd geners funktion och vägar av denna bakterie patogen. Tillfällighet, eftersom byggandet av den PAO1 och PA14 transposon mutation biblioteken, har full-DNA sekvensering genomanalys av många P. aeruginosa -isolat visat att PAO1 och PA14 tillhör olika stora subclades av den P. aeruginosa fylogeni7,39,40,41. Eftersom klinisk P. aeruginosa -isolat finns undergrupper fördelade fylogenin, det faktum att PAO1 och PA14 tillhör olika P. aeruginosa och förbättrar värdet av de två transposon mutation biblioteken för jämförande studier.

Publikationer som beskriver byggandet och screening av bakteriell mutant bibliotek, inklusive P. aeruginosa bibliotek35,finns37,42, tillgängliga i litteraturen. Men, till bäst av vår kunskap, inga publicerade protokoll som beskriver detaljerade förfaranden och tekniker som används för replikering, underhåll och validering av bakteriell mutant bibliotek finns tillgängliga.

Den metod som beskrivs i denna publikation beskriver en uppsättning av tre protokoll som underlättar användning och underhåll av PA14NR Set. Det första protokollet beskriver replikering av biblioteket som rekommenderas till mottagare av PA14NR Set. Det andra protokollet innehåller riktlinjer för strimmor, växande och lagra enskilda mutanter identifieras med hjälp av PA14NR Set. Det tredje protokollet beskriver kvalitetskontroll tekniker, inklusive PCR-amplifiering av fragment från transposon mutanter och efterföljande sekvensering att bekräfta mutant identitet. Denna uppsättning protokoll kan också anpassas för replikering och underhåll av andra bakteriella mutant bibliotek eller samlingar. Replikering av bakteriell mutant bibliotek eller samlingar är mycket klokt att bevara integriteten i ”originalet” (ursprungliga kopian fick). Replikering av flera kopior av PA14NR Set för rutinmässig användning minimerar sannolikheten för interwell kontaminering av huvudkopia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

FÖRSIKTIGHET: Utnyttja standard BSL-2 säkerhetsåtgärder vid hantering av P. aeruginosa, mänskliga patogener. Om du är privatperson med nedsatt immunförsvar eller har något medicinskt tillstånd som ökar din känslighet för bakteriell infektion, ta särskild försiktighet när du arbetar med s. aeruginosa. Konsultera biosäkerhet kontoret i din institution och skaffa godkännande från din läkare innan du börjar arbeta med den den PA14 NR Ställ eller muterade bibliotek av bakteriella patogener.

Figure 1
Figur 1: översikt över protokollet I: replikering av PA14NR ange. Dag 1: Replikera frysta mutant kulturer från ”huvudkopia” av PA14NR ställa in LB Agar media och växa mutanter över natten vid 37 ° C. Dag 2: Överföra muterat tillväxt från LB Agar media till djup väl block som innehåller LB flytande buljong, växa över natten vid 37 ° C med skakningar vid 950 rpm. Dag 3: Mixa övernattning LB kulturer med glycerol, sedan överföra till 96 brunnar destination plattor för långsiktig lagring. Plats 96 brunnar plant i-80 ° C frys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Rekommenderad inställning. Sterilitet och smidigt arbetsflöde bör bibehållas med hjälp av lämpliga försiktighetsåtgärder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

1. protokollet I: replikering av PA14NR som

Obs: Replikering av biblioteket kan uppnås genom att dividera PA14NR Set i fyra undergrupper av sexton plattor varje som kan bearbetas i fyra veckor. Generation 1-6 exemplar följer den veckovisa arbetsflöde som beskrivs i tabell 1, medan generation av mer än 6 kopior följer den veckovisa arbetsflöde som beskrivs i tabell 2. För att generera 12 kopior av PA14NR Set, Inokulera delmängden samma PA14NR i flytande LB medier på dag 2 och igen på dag 3 (från samma uppsättning agarplattor replikeras på dag 1) och överför övernattning mutant kulturer i kopia plattor på dag 3 och dag 4 respektive.

Dag 0 Dag 1 Dag 2 Dag 3
Prep dag Tillväxt av PA14NR ställa mutanter på LB agar media Tillväxt av PA14NR ställa mutanter i flytande LB media Överföring av PA14NR ställa mutant kulturer till destination plattor

Tabell 1: schema för replikering av 1-6 kopior av PA14NR Set. Replikering av ett litet antal kopior kan följa ett weekly arbetsflöde.

Dag 0 Dag 1 Dag 2 Dag 3 Dag 4
Prep dag Tillväxt av PA14NR ställa mutanter på LB agar Växa på PA14NR ange mutanter i flytande LB media Överföring av dag 3 mutant kulturer att generera 1st uppsättning 6 kopior av PA14NR Set Överföring av dag 4 mutant kulturer att generera 2 set 6 kopior av PA14NR Set
Tillväxt av PA14NR ställa mutanter i flytande LB media

Tabell 2: schema för replikering av upp till 12 kopior av PA14NR Set. Replikering av ett större antal exemplar kommer att kräva skiktning inom ett arbetsflöde för varje vecka.

  1. Dag 1: Tillväxt av PA14NR ställa Master kopian på LB agarplattor
    1. Använd skyddshandskar, laboratorierock och mask för att hantera PA14NR Set.
    2. Rensa bänken och torka ytan med 70% etanol.
    3. Förbereda LB agar media43 och sterilisera i autoklav 25 min. Cool media till 55 ° C i vatten bad och lägger till antingen 15 µg/mL gentamicin, för mutanter som innehåller MAR2xT7 transposon infogningar eller 200 µg/mL kanamycin, för mutanter som innehåller TnphoA infogningar.
    4. Häll smält LB agar i rektangulära tallrikar med cirka 60 mL media per platta. Torra plåtar i en steril huva för ca 1 h innan du använder. Kontrollera att det finns ingen vattenkondens på ytan av agar. Förvara plattorna vid 4 ° C, om det behövs.
    5. Skapa ett sterilt fält med en bunsenbrännare på etanol-torkas bänk och ställa in behållare med lämpliga lösningar för replicator pin sterilisering (se steg 1.1.9). Använd öppna plastbehållare (5,25-tums L x 4,25 ”W x 1,75” H ungefärlig storlek) för replicator pin sterilisering. Autoklav plastbehållare före användning.
      Obs: Värmen i bunsenbrännare lågan skapar en konvektion nuvarande, som värmer utrymmet ovanför lågan och lyfter några partiklar i luften uppåt och bort från den svalare luften under, att hålla arbetsområdet sterila.
    6. Ta bort högst fyra PA14NR ställa master plåtar från frysen-80 ° C (för att undvika onödiga upptining), och placera dem på torris i 4 L is stekpanna.
    7. Ta den 96 brunnar master plattan att replikeras från torris och placera den på bänken att tillåta kort upptining, som tar bara tiden behövs för sterilisering av replicator stiften (cirka 3-4 min) (se steg 1.1.8). Markera positionen för A1 koordinaten på agarplattan innan stämpling. Justera master och agar plåt med A1 koordinaten av båda plattor i det övre vänstra hörnet.
    8. Sterilisera replicator ”pins” genom att följa stegen som beskrivs nedan. Tryck på replicator något efter varje steg för att ta bort överflödig vätska.
      1. Fördjupa pins i 250 mL 0,3-0,5% natriumhypoklorit (10% hushållsblekmedel) i 30 sekunder. Minimera kontakt med natriumhypokloritlösning, eftersom det kan leda till skador på pins. Fördjupa pins i 250 mL steril ddH2O eller Sterilt ultrarent vatten i 10 sekunder, sedan i 250 mL 70% etanol i 30 sekunder, sedan i 250 mL 95% etanol i 2 min.
      2. Lågan sterilisera replicator pins genom innehav replicator vinkelrätt till bunsenbrännare lågan, långsamt närmar sig lågan tills etanol antänder och sedan omedelbart återkalla det från lågan. Lågan slocknar en gång alla etanol brinner bort. Håll ett lock eller liknande behållare nära genom att kväva brinnande etanol, om det behövs.
        Obs: Var mycket försiktig när du arbetar med etanol nära låga. Håll inte replicator direkt över lågan.
      3. Häftiga pins genom att fästa på en oanvänd sterila rektangulär tallrik innehållande agar LB media i 30 sekunder.
    9. Kort varm aluminium sigill från PA14NR ställa master plattan med handen innan du skalar det av. Göra detta medan nedkylning replicator pins. Avlägsna försiktigt för att förhindra tätningen från retuschering plattan tätningen på aluminium. Använda pincett för att skala bort alla rester av aluminium sigill.
    10. Infoga replicator pins i tryckplåt, försiktigt trycka och svängande replicator i alla fyra riktningar att säkerställa att pins kontakt med frysta bakteriekulturer i varje 96-brunnarna. Var extra uppmärksam på brunnar ligger i ytterkant på plattan genom att trycka replicator stift mot frysta kulturer i brunnarna ligger vid kanten av plattan.
    11. Placera försiktigt replicator pins på ytan av en agarplatta. Flytta replicator i en liten cirkelrörelse till formuläret mini-gräsmattor cirka 4-5 mm för varje mutant stam. Undvika möjligheten att mini-gräsmattor kan överlappa, för att undvika korskontaminering.
    12. Täta PA14NR inställd tryckplåt med en ny steril aluminium förslutning. Rör inte den självhäftande sidan av aluminium tätning vid någon punkt att undvika kontaminering. Kontrollera att varje brunn och kanterna på plattan är helt förseglade med hjälp av en tallrik-roller. Avkastning 96 brunnar plattan torka is.
    13. Upprepa proceduren för varje tryckplåt.
    14. Torka alla arbetsytor med 70% etanol efter hantering PA14NR Set.
    15. Överföra replikerade agarplattor till 37 ° C inkubator och inkubera över natten.
  2. Dag 2: Tillväxt av PA14NR ställa Master kopian i LB flytande buljong
    1. Förbereda LB flytande buljong43 innehållande antingen 15 µg/mL gentamicin, för mutanter som innehåller MAR2xT7 transposon infogningar eller 200 µg/mL kanamycin, för mutanter som innehåller TnphoA infogningar.
    2. Rensa LAF av onödig utrustning och slå hood fläkt i minst 10 min innan du påbörjar arbetet. Torka ner huven ytor och objekt placeras i huven med 70% etanol.
    3. Fyll 2 mL deep-väl block med 525 µL av LB flytande buljong som innehåller lämpliga antibiotika i LAF med 50-1200 µL 12-kanals elektroniska pipett. Sedan överföra media-fyllda djupt-väl block till etanol-torkas bänk. Återanvända tips så länge sterila förhållanden bibehålls.
    4. Bär handskar, labbrock och mask för att hantera PA14NR inställd.
    5. Rensa bänken och torka ytan med 70% etanol.
    6. Ta agarplattor med övernattning odlade mutant stammar till arbetsbänk.
    7. Skapa ett sterilt fält med en bunsenbrännare på etanol-torkas bänk och ställa in behållare med lämpliga lösningar för replicator pin sterilisering (se nästa steg).
    8. Sterilisera replicator ”stift” följa stegen som beskrivs nedan. Tryck på replicator något efter varje nedsänkning ta bort överflödig vätska.
      1. Fördjupa pins i 250 mL 0,3-0,5% natriumhypoklorit i 30 sekunder. Minimera replicator pin kontakt med natriumhypokloritlösning, eftersom det kan leda till skador på pins. Sedan fördjupa pins i 250 mL steril ddH2O eller ultrarent vatten i 10 sekunder, därefter in i 250 mL 70% etanol i 30 sekunder, sedan i 250 mL 95% etanol i 2 min.
      2. Lågan sterilisera replicator pins, sedan cool pins genom att fästa till oanvända rektangulär platta innehållande agar LB media i 30 sekunder.
        Obs: Använda extrem försiktighet när du arbetar med etanol nära låga (se punkt 1.1.8).
    9. Försiktigt placera replicator pins på agarplatta som innehåller mutant tillväxt och kontrollera att stiften är i kontakt med alla 96 mutanter på agarplatta, sedan dränka pins i djupa brunnar som innehåller LB flytande buljong. Undvik att vidröra sidorna av brunnarna med stiften.
    10. Försegla djupt väl blocket med en steril tätning membran som andas. Använd en tallrik rulle att se till att varje individ väl är ordentligt förslutna.
    11. Upprepa proceduren för varje agarplatta.
    12. Torka alla arbetsytor med 70% etanol efter hantering PA14NR Set.
    13. Växa inokulerade flytande kulturer för 15-16 h vid 37° C 950 rpm skakapparat hög hastighet, om tillgängligt.
      Obs: Om det inte finns en hög hastighet shaker, inkubation av djupt väl block i shaker på 250-300 rpm är genomförbart. Det finns dock en större chans att liten koloni varianter (SCVs)25 framväxande låg syresättning villkor. Det är därför tillrådligt att hålla inkubation gånger under 15-16 h när växande kulturer i djup väl block vid lägre shaker hastigheter. Oönskad spridning av SCVs i mutant brunnar kan förändra mutant fenotyper när du använder biblioteket för att utföra genetiska skärmar.
      Vissa brunnar i PA14NR Set innehåller långsamt växande/icke-växande mutanter, saknas kloner, eller uninoculated medier. Placeringen av dessa brunnar har registrerats och kan hittas i filen PA14NR ange Wells tilläggsinformation ingår i denna publikation.
  3. Dag 3: Överföring av PA14NR ställa övernattning kulturer i destination plattor
    1. Rensa LAF och slå hood fläkt i minst 10 min innan du påbörjar arbetet. Torka ner huven ytor och objekt placeras i huven med 70% etanol.
    2. Etiketter självhäftande vattentät (se kompletterande PA14NR ange Labels fil för mallen). Ta bort 96 brunnar av plast radbrytas inuti en LAF. Peel-off plattan etikett och placera den längs plattans kant närmast A1 till H1 brunnar i destination plattan. Lyft på locket till destination plattan något och placera etiketten på den nedre kanten visas etiketten när plattan är täckt med lock.
    3. Förbereda 3,5 L 60% glycerol (v/v) och sterilisera 20 min i autoklav.
    4. Bär handskar, labbrock och mask för att hantera PA14NR Set. Ta bort djupa väl block från hög hastighet shaker eller vanlig shaker.
    5. Överföra deep-väl block till sterila LAF och avlägsna försiktigt tätning membran som andas. Ersätt med aluminium sigill. Spin-down deep-väl block med mycket låg hastighet att samla kondens (30 sekunder på 50-150 x g, sedan avta quicky genom att Centrifugera broms på).
    6. Överföra deep-väl block tillbaka till sterila huva och med 50-1200 µL 12-kanals elektroniska pipett och sterila filtrerade tips Lägg till 525 µL av glycerol/LB flytande buljong mix (lika delar LB flytande buljong och 60% glycerol lösning) till varje brunn. Blanda genom att försiktigt pipettering 300 µL upp och ned 3 gånger med elektroniska pipetten. Tryck tips sida av väl innan du matar ut tips för att undvika DROPP. Mata ut tips och fortsätter med nästa rad tills gjort med hela djup väl blocket.
    7. Med 12-kanals elektroniska repetitiva pipett och filtrerade tips, för att förhindra interwell kontaminering under alikvotering, dra upp 900 µL av muterade kultur och fördela 150 µL i varje 96 brunnar destination plattor att generera 6 kopior av bibliotek plattan. Förhindra droppar genom att vidröra väggen i brunnarna med tips innan du startar överföringen av kulturen i destination plattor. Om ingen upprepa pipett är tillgänglig, Använd en flerkanalspipett för att fördela 150 µL i var och en av sex 96 brunnar pläterar, med hjälp av teknik som beskrivs ovan för att förhindra DROPP.
    8. Använd sterila aluminium sälar att täcka pläterar och Använd en tallrik rulle till helt tätning platta kanter och alla brunnar. Se till att täcka etikettidentifierare med aluminium sigill. Skaka inte plattorna, eftersom kultur skvätta på sidorna av brunnarna eller aluminium sigill.
    9. Ta bort förseglade plattor från huven och plats plattor på en plan, jämn yta i-80 ° C frysen.
    10. Torka alla arbetsytor med 70% etanol efter hantering av biblioteket.
    11. Utföra kvalitetskontroller efter bibliotek replikering och använda biblioteket för att utföra genetiska skärmar (se protokoll III).

2. protokoll II: Hantering och lagring av enskilda mutanter från PA14NR uppsättningen

  1. Dag 1: Strimma mutant av intresse
    1. Identifiera platsen för mutant av intresse genom den PA14NR ange länk http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS eller använda filen Nonredundant Library.xls hämtat från länken http:// pa14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/pa14/downloads.cgi). Anteckna den antibiotika som behövs för att markera varje särskild mutant (gentamicin eller kanamycin).
    2. Förbereda LB agar media, sterilisera i autoklav i 20-25 min och svalna till 55 ° C i vattenbadet. Lägg till 15 µg/mL gentamicin för mutanter som innehåller MAR2xT7 transposon infogningar och 200 µg/mL kanamycin för mutanter som innehåller TnphoA transposon infogningar. Häll LB agar media på tallrikar (runda eller rektangulära plattor är tillräckliga). Torra plåtar i sterila huva för cirka 30 min till 1 h innan använda.
    3. Autoklav alla plasticware och icke-sterila leveranser före användning.
    4. Bär handskar, labbrock och mask för att hantera PA14NR Set. Rensa bänken och torka ytan med 70% etanol innan du arbetar med PA14NR Set.
    5. Skapa ett sterilt fält med en bunsenbrännare.
    6. Ta bort PA14NR ange plattan med 96 brunnar med mutant av intresse från-80 ° C frys och placera den på torris, ta torris container till bänken och kort Placera plattan med 96 brunnar ovanpå bänken att svag upptining (cirka 1-2 min).
      Obs: Föra ett register över alla PA14NR ange 96 brunnar plattor till en strimma enskilda mutanter, som mer tillgång till bibliotek plattor är korrelerad med en ökad risk för interwell kontaminering.
    7. Varma aluminium tätning med handen innan du skalar det av, var noga med att förhindra att försegla retuschering plattan. Använda pincett för att skala bort alla rester av aluminium sigill.
    8. Lokalisera muterat sevärdheter på plattan med 96 brunnar. Använd antingen sterila träpinne eller steril pipettspetsen för att plocka en liten mängd frysta kultur från de enskilda brunn innehållande mutant av intresse.
    9. Strimma fryst kultur på agarplatta för enda mutanta kolonier som följer: försiktigt sprids bakterierna över en del av plattan att skapa strimma 1, med en fräsch, sterila trä pinne eller pipetten spets, dra genom strimma 1 och sprida bakterier över en andra del av plattan, att skapa strimma 2. Använda ett tredje sterila trä pinne eller pipetten tips, dra genom strimma 2 och sprida bakterier över den sista delen av plattan, att skapa strimma 3.
    10. Försegla källa plattan med en ny steril aluminium förslutning. Rör inte den självhäftande sidan av aluminium tätning vid någon punkt att undvika kontaminering. Kontrollera att varje brunn och kanterna på plattan är helt förseglade med hjälp av en tallrik-roller. Plattan till torr-is och sedan-80 ° C frysen med avkastning 96 brunnar.
    11. Inkubera agarplatta i 37 ° C inkubator över natten.
    12. Torka alla arbetsytor med 70% etanol efter hantering av biblioteket.
  2. Dag 2: Tillväxt av muterade sevärdheter i LB flytande buljong
    1. Förbereda flytande LB buljong som innehåller 15 µg/mL gentamicin eller 200 µg/mL kanamycin, enligt transposon införande.
    2. Bär handskar, labbrock och mask att hantera P. aeruginosa.
    3. Rensa bänken och torka ytan med 70% etanol. Skapa ett sterilt fält med en bunsenbrännare.
    4. Över 3-5 mL LB buljong med lämpligt antibiotikum i sterila kultur rör med lock.
    5. Med hjälp av en steril applikator eller en steril pipettspetsen, plocka en enda koloni av mutant stam och Inokulera det i LB media.
    6. Inkubera LB flytande kulturer vid 37 ° C i en shaker på 225-250 rpm över natten.
    7. Torka alla arbetsytor med 70% etanol efter hantering av P. aeruginosa.
  3. Dag 3: Lagra mutant sevärdheter i-80 ° C frys
    1. Etikett cryovial med mutant namn, antibiotika läggas till LB buljong och datum för lagring.
    2. Bereda 500 mL 50% Glycerol (v/v) och sterilisera i autoklav.
    3. Bär handskar, labbrock och mask att hantera P. aeruginosa.
    4. Rensa bänken eller laminär översvämning huva och torka ytan med 70% etanol.
    5. Ta bort röret som innehåller mutant kultur från shaker.
    6. Förbereda en liten behållare med torris.
    7. Använd en LAF eller skapa ett sterilt fält på etanol-torkas bänk med bunsenbrännare.
    8. Lägg lika mängder bakterieodling och 50% glycerol till de märkta cryovial använder sterila förhållanden, och blanda försiktigt med pipett (slutlig volym 1-2 mL/flaska beroende på storleken på den cryovials som används). Placera cryovial på torr-is till snabbfryser.
    9. Placera cryovial i märkt rutan i-80 ° C frys.
    10. Torka alla arbetsytor med 70% etanol efter hantering P. aeruginosa.

3. protokoll III: kvalitetskontroll av PA14NR Set

  1. Välj slumpmässig uppsättning mutanter nyligen replikerade plattor att upptäcka eventuell interwell förorening (testning av 30-40 mutanter rekommenderas).
    Obs: I fall där det är nödvändigt att bekräfta identiteten hos en mutant som används för karaktärisering av en specifik gen, det rekommenderas att utföra PCR kompletteringar med gen-specifika primers utformad för den kända sekvensen av den gen som innehåller den transposon införande. Även om mer utmanande, fördelarna med att använda godtyckliga inkluderar PCR primers i stället för gen-specifika PCR primers när amplyfing DNA fragment från transposon mutanter enkel storskaliga mutant bekräftelse och förmågan att påvisa förekomsten av potential föroreningar. För kvalitetskontroll är det inte nödvändigt att få hög kvalitet PCR sekvensering data för alla slumpmässigt ärkebiskopen mutanter, så länge ett tillräckligt antal mutanter screenas för att bedöma felprocenten.
  2. Följ ”protokoll II” strimma och växa mutant stammar.
  3. Autoklav alla plasticware och icke-sterila leveranser före användning.
  4. Isolera genomiskt DNA genom rekommenderad metod. För den analys som beskrivs i detta arbete, utnyttjades en genomisk DNA isolering kit efter tillverkarens protokollen. Flera mutant stammar kan analyseras samtidigt.
  5. Mäta genomisk DNA-koncentration med hjälp av en microvolume spektrofotometer. Justera genomisk DNA-koncentration till cirka 100 ng/µL.
  6. Använda genomiskt DNA som mall för att köra ”PCR1 reaktion” som beskrivs i steg 1 i tabell3, generera Arb1 PCR-fragmenten (figur 3). Grundfärger för detta steg listas i tabell 4.
  7. Tillsätt 0,5 µL 10 x laddar buffert till 5 µL PCR1 reaktion, ladda in en 1,5-2% agarosgel och kör gelen vid 80-150 V.
    Obs: En specifik fragment längd eller ett särskilt fragment förväntas inte, och mer än ett band kan vara närvarande som godtyckliga primer kan binda till flera platser.
  8. Använda DNA från PCR1 reaktion som mall för att köra ”PCR2 reaktion” som beskrivs i steg 2 i tabell3, generera Arb2 PCR-fragmenten (figur 3). Grundfärger för detta steg listas i tabell 4.
  9. Tillsätt 0,5 µL 10 x laddar buffert till 5 µL PCR2 reaktion, ladda in en 1,5-2% agarosgel och kör gelen vid 80-150 V.
    Obs: En specifik fragment längd eller ett särskilt fragment förväntas inte, och mer än ett band kan vara närvarande som godtyckliga primer kan binda till flera platser.
  10. Skicka PCR2 reaktion tillsammans med lämpliga transposon-specifik primer för sekvensering.
  11. Analize sekvensering resultat byBLASTing dem mot komplett PA14 genomet via länken BLAST som tillhandahålls på webbplatsen PA14NR bibliotek (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/blast.cgi) eller genom direkt blästring dem mot specifik gensekvens av muterat sevärdheter.
    Obs: Information om valda mutanter kan hittas genom att söka PA14NR ange webbplatsen (Sök http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS eller ladda ner den Nonredundant Library.xls fil från den länk http:/ / pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/downloads.cgi).

Figure 3
Figur 3: PCR amplifiering och sekvensering av transposon införande mutanter. Schematisk bild av steg involverade i PCR-amplifiering och sekvensering för kontroll av muterade identitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

PCR-reaktionen Set-up
Steg 1 Steg 2
PCR1 reaktion: PCR2 reaktion:
23,25 µL vatten (molekylär biologi årskurs) 19.15 µL vatten (molekylär biologi årskurs)
3µL 10 x Taq polymeras buffert 5 µL 10 x Taq polymeras buffert
0.5µL Taq polymeras 0.6 µL Taq polymeras
0,625 µL 20 µM primer Arb1D (tabell 4) 0,625 µL 20 µM primer Arb2A (tabell 4)
0,625 µL 20 µM transposon-specifik Primer (PMFLGM. GB 3a eller Tn5Ext) (tabell 4) 0,625 mL 20 µM Transposon-specifik Primer (PMFLGM. GB 2a eller Tn5Int2) (tabell 4)
1 µL 10 mM dNTP 1 µL 10 mM dNTP
1 µL genomiskt DNA, 100 ng 5 µL PCR1 reaktion
30 µL slutliga reaktionsvolym 30 µL slutliga reaktionsvolym
PCR-reaktionen inställningar
PCR1 Termocyklern villkor: PCR2 Termocyklern villkor:
95 ° C – 2 min 95 ° C – 2 min
Upprepa 5 cykler: Upprepa 30 cykler:
95 ° C – 30 s 95 ° C – 30 s
30 ° C – 1 min 54 ° C – 30 s
72 ° C – 1 min 72 ° C – 1,5 min
Upprepa 30 cykler: 72 ° C – 10 min
95 ° C – 30 s 4 ° C – Håll
45 ° C – 30 s
72 ° C – 1 min
72 ° C – 10 min
4° C – Håll

Tabell 3: PCR-reaktion set-up och termocyklern förhållanden användas för godtyckliga PCR. Godtyckliga PCR-reaktioner sker sekventiellt och fragment som genereras under PCR1 reaktion används som mall i PCR2 reaktion. Specifika termocyklern inställningar används för varje uppsättning reaktioner.

Primer namn Primer sekvens
MAR2xT7 Transposon-specifika Primers
PMFLGM. GB-3a TACAGTTTACGAACCGAACAGGC
PMFLGM. GB-2a TGTCAACTGGGTTCGTGCCTTCATCCG
MAR2xT7 Transposon sekvensering Primer
PMFLGM. GB-4a GACCGAGATAGGGTTGAGTG
TNphoA Transposon-specifika Primers
Tn5Ext GAACGTTACCATGTTAGGAGGTC
Tn5Int2 GGAGGTCACATGGAAGTCAGATCCTGG
TNphoA Transposon sekvensering Primer
Tn5Int CGGGAAAGGTTCCGTTCAGGACGC
Godtyckliga grundfärger
ARB1D GGCCAGGCCTGCAGATGATGNNNNNNNNNNGTAT
ARB2A GGCCAGGCCTGCAGATGATG

Tabell 4: lista av Primers används i kvalitetskontroll Experiment. Primer som används för PCR-amplifiering och sekvensering av transposon införande mutanter bekräfta mutant identitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tolv nya kopior av PA14NR Set replikerades använder protokollet som jag, och en kvalitetskontroll bedömning av de nya kopior som genereras utfördes med hjälp av protokoll III.

PA14NR ställa in mutant tallrikar tillsammans med kontrollplattor, som består av vildtyp PA14 inokuleras och uninoculated brunnar interkalenderat i ett förinställt mönster (figur 4A), replikerades efter metodik som beskrivs i protokollet I. kontroll tallrikar ingår i PA14NR Set att utvärdera möjliga interwell kontamination när du utför plattan replikering. Kontrollplattor kan dessutom användas för att öva replikeringstekniker innan åtkomst till plattor som innehåller transposon införande mutanter. Tillväxten av kontrollplattor inspekterades visuellt efter replikering på LB agarplattor och natten inkubation att säkerställa förekomst av förväntad tillväxtmönster (figur 4B). Närvaron eller frånvaron av bakterietillväxt i djup väl block inokuleras med kontroll tallrik 1 bedömdes efter natten inkubation genom att läsa OD600 i spektrofotometer. Resultaten visade betydande tillväxt i vildtyp PA14 inokuleras brunnar och total avsaknad av tillväxt i uninoculated brunnarna (figur 4 c). Även om det fanns några variabilitet i tillväxten av vildtyp PA14 kulturer, fanns det färdiga frånvaroen av tillväxt i uninoculated brunnarna (figur 4 d).

Trettioåtta mutant stammar slumpmässigt utvalda från en nygenererad kopior av PA14NR Set analyserades genom att sekvensera DNA-fragment som genereras av godtyckliga PCR. Godtyckliga PCR-reaktioner genomfördes för att förstärka DNA-fragment från regioner som omger transposon införanden av 38 mutanter valt och PCR-fragmenten erhålls var därefter sekvenserade. Ett exempel på PCR-fragmenten erhållits efter PCR-amplifiering av nio distinkta transposon införande mutanter visas i figur 5. Som påkoppling av godtyckliga primers inträffar slumpmässigt, kan inte fragment längd förutsägas. När inga band var synlig, upprepades PCR-reaktioner. Transposon infogningar i 38 mutanter analyseras identitet hittades med PA14 Transposon införande Mutant biblioteket länk (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi) för att välja måste utföra godtyckliga PCR primers reaktioner.

Sekvensering resultat erhålls från 38 mutant stammar var blästrade mot komplett genomet hos stam PA14 med explosionen länken på webbplatsen PA14NR bibliotek (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/blast.cgi). Sekvensering resultat från slumpmässigt utvalda mutanter anpassades också mot de gensekvenser som motsvarade till varje enskild mutant (erhålls PA14NR ange plattan position sökning verktyget finns på PA14NR bibliotek webbplats http:// pa14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS). Sekvens linjeföring utfördes med verktyget anpassa sekvenser Nucleotide BLAST som tillhandahålls av NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi? PAGE = MegaBlast & PROGRAM = blastn & BLAST_PROGRAMS = megaBlast & PAGE_TYPE = BlastSearch & BLAST_SPEC = blast2seq & databas = ej tillämpligt & QUERY = & FÖRSÖKSPERSONER =).

Två av de 38 mutanterna utvalda genererade låg kvalitet sekvens resultat, förmodligen på grund av höga GC innehåll i regionen som innehåller transposon införande, och kunde inte analyseras vidare. Sekvens resultat från 35 av 36 framgångsrikt sekvenserade mutanter matchade sekvenserna av generna motsvarar PA14NR ställa valt mutanter. Endast en av de 36 sekvenserna gick inte att matcha sekvensen av den gen som motsvarar den muterade som valts. Dock var det inte fastställts om denna diskrepans resulterade från ett problem som uppstod under replikering av de nya kopiorna av PA14NR Set eller kunde tillskrivas den 2,8% mislabeling fel Beräknad tidigare för den PA14NR ange37.

Figure 4
Figur 4: PA14NR ange kontrollplattor. (A) layout av PA14NR inställt kontrollplattor 1 och 2. (B) bild av PA14 NR Ställ kontrollplattor 1 och 2 replikeras på LB Agar (vy från toppen av agarplattan). (C) genomsnitt bakterietillväxt (+/-SD) mätt i inokulerade och uninoculated brunnar för kontroll platta 1 efter natten inkubation i djup väl Block. Mätningar utfördes på OD600. (D) bakteriell tillväxt mätt i inokulerade och uninoculated brunnar för kontroll platta 1 efter natten inkubation i djup väl Block. Mätningar utfördes på OD600 i enskilda brunnar. Även kolumner motsvarar mätningar som gjorts i uninoculated brunnar; udda kolumner motsvarar mätningar som gjorts i PA14-inokuleras brunnar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: PCR1 och PCR2 fragment erhålls från förstärkning reaktioner. Exempel på fragment erhålls med godtyckliga PCR amplifiering reaktioner. Fragment i körfält 1-9 motsvarar olika mutanter slumpmässigt utvalda att utföra kvalitetskontroller av PA14NR Set replikeras plattor. MWM: DNA molekylvikt markör. DNA MWM storlekar är i baspar.
PA14NR ange mutant stammar testade: Lane 1: 07_4 A10, lane 2: 07_4 B4, lane 3: 08_1 C3, lane 4: 08_1 H6, lane 5: 08_3 G10, lane 6: 08_4 B8, lane 7: 08_4 H3, lane 8: 09_2 D12, lane 9 : 09_2 G5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

P. aeruginosa PA14NR är en värdefull resurs för forskarsamhället. Enligt mars 2017 datamängden från Clarivate Analytics grundläggande vetenskap indikatorer databas, Liberati o.a. (2006) 37, som beskriver byggandet av PA14NR Set, rankas i den översta 1% av mikrobiologi publikationer. Google Scholar rapporterar över 600 citeringar av den Liberati o.a. (2006) original-manuskript från och med augusti 2017. Biblioteket har spelat en viktig roll i att klarlägga mekanismerna bakom P. aeruginosa patogenes. Ännu viktigare, underlättar formatet plattan med 96 brunnar av PA14NR Set hög genomströmning genetiska skärmar för att studera en mängd P. aeruginosa mutant fenotyper44,45,46. Som PA14NR Set är tillgängliga för distribution, måste särskilda försiktighetsåtgärder användas för att bevara integriteten för denna resurs.

Ett antal publikationer visar nyttan av använder PA14NR Set i genetiska skärmar37,38,47,48. Till exempel som en första test av användbarheten av biblioteket utförde Liberati et al. en PVC (polyvinylklorid) attachment skärm, som korrelerar med bakteriernas förmåga att bilda biofilmer37,38, 47 , 48. bibliotekets format kan också studiet av komplexa genetiska egenskaper såsom svärma motilitet, framgår av identifiering av hundratals gener av intresse i en enkel skärm48. PA14NR Set användes också i en storskalig MALDI-TOF mass spectrometry-baserad skärm att förvärva och analysera intakt-cell proteomet profil spectra och bedöma effektiviteten av MALDI-TOF Biotyping47. Tillämpa denna teknik, kunde forskarna att avgöra om smärre genetiska skillnader, såsom de som följd av transposon infogningar, är störande för biotyping insatser som används i kliniska och terapeutiska miljöer. Dessutom, användes den PA14NR som för att utföra en genome-wide skärm för dämpning av PA14 virulens i C. elegans infektion modell, möjliggör identifiering av tidigare uncharacterized P. aeruginosa virulens-relaterade gener 38, och därigenom ge ett exempel på användning av PA14 biblioteket att studera värd-patogen interaktioner.

PA14NR Set fungerar också som en viktig resurs för att studera enskilda mutanter. För att undvika kontaminering av biblioteket, rekommenderas metodtips för åtkomst till mutanter av intresse. Eftersom hantering av biblioteket ökar risken för kontaminering, rekommenderas det att lagra mutanter av intresse i injektionsflaskor för att begränsa åtkomsten till PA14NR ange arbets- och huvudkopior. Detta förhindrar kontaminering, förbättrar livslängden på biblioteket och skyddar investeringen.

För att bevara integriteten för viktiga PA14NR ange resursen, rekommenderas det att alla mottagare av PA14NR Set göra kopior av biblioteket vid mottagandet. Trots ansträngningar uteslutas inte risken för oavsiktlig kontaminering under replikering förfaranden. Det rekommenderas därför starkt att användare fullständig kvalitetskontroll kontrollerar efter bibliotek replikering och använda biblioteket för att utföra genetiska skärmar. Det rekommenderas också starkt att användare göra ytterligare kopior av PA14NR Set att utföra genetiska skärmar som sannolikheten för interwell kontaminering ökar. Dessutom bör biblioteket kopior används för att utföra mer än 2-3 genetiska skärmar underkastas uttömmande kvalitetskontroll bedömningar. Tyvärr finns det inget rätt sätt att återställa bibliotek som upplever förlust av kloner eller interwell kontaminering. Komprometterad eller kontaminerade kopior måste kasseras. Följaktligen rekommenderas det att användarna replikera flera kopior av biblioteket för rutinmässig användning, med tanke på att en kopia livslängd är begränsad. Det rekommenderas också att användarna begränsa tillgång till ”huvudkopia” att bevara integriteten av PA14NR Set.

De protokollen som presenteras här ger en detaljerad förklaring av replikeringstekniker, inklusive set-up, protokoll och bästa praxis. Protokollen replikering beskrivs för den PA14NR som kan anpassas för att generera upp till 12 kopior av biblioteket och kan även anpassas lätt för att replikera andra bakteriella mutant bibliotek. Till bäst av vår kunskap finns det inga publicerade protokoll tillgängliga hittills med detaljerade beskrivningar av de förfaranden och tekniker som används för replikering, underhåll och validering av bakteriell mutant bibliotek. Vi hoppas att dessa protokoll kommer att förse användare av PA14NR Set och andra bakteriella mutant bibliotek med informationen som behövs för att utföra dessa viktiga uppgifter.

Om biblioteket används för hög genomströmning skärmar eller som en källa för enskilda mutanter, är det viktigt att regelbundet bedöma integriteten av kopian i användning. För att göra detta, adekvat utbildning av personal och åter granska replikering eller mutant urval tekniker bör göras regelbundet. Här rekommenderas användning av PA14NR ställa kontrollplattor och utförandet av rutinmässiga PCR-amplifiering och sekvensering av slumpmässiga mutanter att bekräfta sin identitet. Liberati el al. (2006) 37 beräknad att 2,8% av det totala antalet mutanter i PA14NR Set var felmÀrkta, vilket understryker behovet av att sekvensen specifika transposon mutanter och generera i-frame radering mutanter innan du påbörjar någon omfattande undersökning och/eller publikation av forskning som avser specifika gener. Tanke på korrekt protokoll och metoder för bibliotek replikering och urval av enskilda mutanter för vidare studier, kommer att PA14NR Set bidra till förståelsen av P. aeruginosa patogenicitet och förbättring av kliniska resultat för infekterade patienter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna rapportera inga ekonomiska intressekonflikter. Eliana Drenkard och Frederick Ausubel deltog i skapandet PA14 nonredundant transposon mutant biblioteket. Bryan Hurley och Lael Yonker för närvarande hus och distribuera mutant biblioteket som en del av Institutionen för pediatrik vid Massachusetts General Hospital.

Acknowledgments

Vi vill tacka Lisa Philpotts av MGH Treadwell virtuellt bibliotek för hennes vägledning i databas sökning. Detta arbete fick stöd av cystisk fibros Foundation (YONKER16G0 och HURLEY16G0) och NIH NIAID (BPH och ADE: R01 A1095338).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials for Library Replication
Sterile 96-well Tissue-culture treated, case of 50 Corning Life Sciences 353072 via Fisher Scientific
Sterile 96 Well Clear V-Bottom 2000μL Deep Well Plates, case of 25 Corning Life Sciences 3960 via Fisher Scientific
Nunc OmniTray (rectangular plates), case of 60 Thermo Scientific Rochester 242811 via Fisher Scientific
Rectangular Ice Pan, Midi (4L) Corning Life Sciences 432104 via Fisher Scientific
Secure-Gard Cone Mask, case of 300 Cardinal Health AT7509 via Fisher Scientific
AluminaSeal, pack of 100 Diversified Biotech ALUM-100 via Fisher Scientific
Breathe-Easy membrane, pack of 100 Diversified Biotech BEM-1 via Sigma-Aldrich
Sterile, individually wrapped, 50mL Solution Trough/Reagent Reservoir, case of 100 Sorenson S50100 via Westnet Incorporated
Plate roller VWR 60941-118 via VWR
Cryo Laser Labels - CRYOLAZRTAG 2.64" x 0.277", pack of 16 sheets GA International RCL-11T1-WH via Labtag.com (template for printing also available from Labtag.com)
96-well replicator V & P Scientific, Inc. Custom 407C, 3.18mm pin diameter, 57mm long via V & P Scientific, Inc.
Multitron Pro, 3mm Shaking incubator Infors HT l10003P via Infors HT
Picus 12 Channel 50-1200μL Electronic Pipette Sartorius 735491PR via Sartorius
Filter Tips 50-1200μL, pack of 960 Biohit 14-559-512 via Fisher Scientific; use electronic multichannel-compatible tips
Dry Ice User-specific vendor
Materials for Individual Mutant Storage
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
Pipettes (P1000, P200, P20, P2) Gilson F167370 via Gilson
Materials for Quality Control PCR
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
NanoDrop Thermo Scientific ND-2000 via ThermoFisher
PCR Thermocycler
Omnistrips PCR Tubes with domed lids Thermo Scientific AB0404 via Fisher Scientific
ART Barrier low-retention pipette tips (10 uL, 100 uL, 1000 uL) Molecular BioProducts, Inc. Z676543 (10 uL), Z676713 (100 uL), Z676802 (1000 uL) via Sigma-Aldrich
Pipettes (P1000, P200, P20, P2) Gilson F167370 via Gilson
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
MasterPure DNA Purification Kit Epicentre MCD85201 via Epicentre Technologies Corp
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, ready-to-use Thermo Scientific SM1333 via ThermoFisher
RediLoad Loading Buffer Invitrogen 750026 via ThermoFisher
Chemicals
Chemicals for Library and Individual Mutant Storage
Glycerol MB Grade, 1L Sigma Aldrich G5516 via Sigma-Aldrich
LB Broth Per 1L dH2O: 10g tryptone, 5g yeast extract, 5g NaCl, 1ml 1N NaOH (Current Protocols in Molecular Biology.  Wiley, 1994.)
Tryptone Sigma Aldrich T7293 via Sigma-Aldrich
Yeast Extract Sigma Aldrich Y1625 via Sigma-Aldrich
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653 via Sigma-Aldrich
Sodium Hydroxide Sigma Aldrich S8045 via Sigma-Aldrich
LB  agar See preparation above, add 15g Bacto Agar
Bacto Agar Sigma Aldrich A5306 via Sigma-Aldrich
Gentamicin sulfate, 10g BioReagent 1405-41-0 via Sigma-Aldrich
Kanamycin sulfate Gibco 11815024 via ThermoFisher
Ethanol, 190 proof Decon 04-355-221 via Fisher Scientific
Chemicals for Quality Control PCR
Primers User-preferred vendor See primers listed in Table 3
Corning cellgro Molecular Biology Grade Water Corning 46000CV via Fisher Scientific
Taq Polymerase Buffer Invitrogen 10342020 via ThermoFisher
Taq DNA Polymerase, recombinant Invitrogen 10342020 via ThermoFisher
dNTPs Invitrogen 10297018 via ThermoFisher
Agarose Sigma A9539 via Sigma-Aldrich

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moradali, M. F., Ghods, S., Rehm, B. H. Pseudomonas aeruginosa lifestyle: A paradigm for adaptation, survival, and persistence. Front Cell Infect Microbiol. 7, 39 (2017).
  2. Bleves, S., et al. Protein secretion systems in Pseudomonas aeruginosa: A wealth of pathogenic weapons. Int J Med Microbiol. 300 (8), 534-543 (2010).
  3. Breidenstein, E. B., de la Fuente-Nunez, C., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: all roads lead to resistance. Trends Microbiol. 19 (8), 419-426 (2011).
  4. Flynn, K. M., et al. Evolution of ecological diversity in biofilms of Pseudomonas aeruginosa by altered cyclic diguanylate signaling. J Bacteriol. 198 (19), 2608-2618 (2016).
  5. Hazan, R., Maura, D., Que, Y. A., Rahme, L. G. Assessing Pseudomonas aeruginosa persister/antibiotic tolerant cells. Methods Mol Biol. 1149, 699-707 (2014).
  6. Klockgether, J., et al. Genome diversity of Pseudomonas aeruginosa PAO1 laboratory strains. J Bacteriol. 192 (4), 1113-1121 (2010).
  7. Mathee, K., et al. Dynamics of Pseudomonas aeruginosa genome evolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 3100-3105 (2008).
  8. Taylor, P. K., Yeung, A. T., Hancock, R. E. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms: towards the development of novel anti-biofilm therapies. J Biotechnol. 191, 121-130 (2014).
  9. Flume, P. A., Van Devanter, D. R. State of progress in treating cystic fibrosis respiratory disease. BMC Med. 10, 88 (2012).
  10. Foundation, C. F. Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry 2015 Annual Data Report. , Available from: https://www.cff.org/Our-Research/CF-Patient-Registry/2015-Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf (2016).
  11. Church, D., Elsayed, S., Reid, O., Winston, B., Lindsay, R. Burn wound infections. Clin Microbiol Rev. 19 (2), 403-434 (2006).
  12. Sadikot, R. T., Blackwell, T. S., Christman, J., Prince, A. Pathogen-host interactions in Pseudomonas aeruginosa pneumonia. Am J Respir Crit Care Med. 171 (11), 1209-1223 (2005).
  13. Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5 (2), 65-71 (2013).
  14. National Nosocomial Infections Surveillance, S. National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report, data summary from January 1992 through June 2004, issued October 2004. Am J Infect Control. 32 (8), 470-485 (2004).
  15. Cohen, T. S., Parker, D., Prince, A. Pseudomonas aeruginosa Host Immune Evasion. 7, 3-23 (2014).
  16. Fernandes, A., Dias, M. The microbiological profiles of infected prosthetic implants with an emphasis on the organisms which form biofilms. J Clin Diagn Res. 7 (2), 219-223 (2013).
  17. Khosravi, A. D., Ahmadi, F., Salmanzadeh, S., Dashtbozorg, A., Montazeri, E. A. Study of Bacteria Isolated from Orthopedic Implant Infections and their Antimicrobial Susceptibility Pattern. Res J of Microbiol. 4 (4), 6 (2009).
  18. Roemhild, R., Barbosa, C., Beardmore, R. E., Jansen, G., Schulenburg, H. Temporal variation in antibiotic environments slows down resistance evolution in pathogenic Pseudomonas aeruginosa. Evol Appl. 8 (10), 945-955 (2015).
  19. Fischer, S., et al. Intraclonal genome diversity of the major Pseudomonas aeruginosa clones C and PA14. Environ Microbiol Rep. 8 (2), 227-234 (2016).
  20. Wiehlmann, L., et al. Population structure of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (19), 8101-8106 (2007).
  21. Lam, J. S., Taylor, V. L., Islam, S. T., Hao, Y., Kocincova, D. Genetic and functional diversity of Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide. Front Microbiol. 2, 118 (2011).
  22. Choi, J. Y., et al. Identification of virulence genes in a pathogenic strain of Pseudomonas aeruginosa by representational difference analysis. J Bacteriol. 184 (4), 952-961 (2002).
  23. He, J., et al. The broad host range pathogen Pseudomonas aeruginosa strain PA14 carries two pathogenicity islands harboring plant and animal virulence genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2530-2535 (2004).
  24. Mikkelsen, H., McMullan, R., Filloux, A. The Pseudomonas aeruginosa reference strain PA14 displays increased virulence due to a mutation in ladS. PLoS One. 6 (12), e29113 (2011).
  25. Drenkard, E., Ausubel, F. M. Pseudomonas biofilm formation and antibiotic resistance are linked to phenotypic variation. Nature. 416 (6882), 740-743 (2002).
  26. Rahme, L. G., et al. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
  27. Rahme, L. G., et al. Use of model plant hosts to identify Pseudomonas aeruginosa virulence factors. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (24), 13245-13250 (1997).
  28. Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1149, 653-669 (2014).
  29. Mahajan-Miklos, S., Tan, M. W., Rahme, L. G., Ausubel, F. M. Molecular mechanisms of bacterial virulence elucidated using a Pseudomonas aeruginosa-Caenorhabditis elegans pathogenesis model. Cell. 96 (1), 47-56 (1999).
  30. Limmer, S., et al. Pseudomonas aeruginosa RhlR is required to neutralize the cellular immune response in a Drosophila melanogaster oral infection model. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (42), 17378-17383 (2011).
  31. Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infect Immun. 71 (5), 2404-2413 (2003).
  32. Coleman, F. T., et al. Hypersusceptibility of cystic fibrosis mice to chronic Pseudomonas aeruginosa oropharyngeal colonization and lung infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1949-1954 (2003).
  33. Pazos, M. A., et al. Pseudomonas aeruginosa ExoU augments neutrophil transepithelial migration. PLoS Pathog. 13 (8), e1006548 (2017).
  34. Maura, D., Hazan, R., Kitao, T., Ballok, A. E., Rahme, L. G. Evidence for direct control of virulence and defense gene circuits by the Pseudomonas aeruginosa quorum sensing regulator, MvfR. Sci Rep. 6, 34083 (2016).
  35. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  36. Held, K., Ramage, E., Jacobs, M., Gallagher, L., Manoil, C. Sequence-verified two-allele transposon mutant library for Pseudomonas aeruginosa PAO1. J Bacteriol. 194 (23), 6387-6389 (2012).
  37. Liberati, N. T., et al. An ordered, nonredundant library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 transposon insertion mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (8), 2833-2838 (2006).
  38. Feinbaum, R. L., et al. Genome-wide identification of Pseudomonas aeruginosa virulence-related genes using a Caenorhabditis elegans infection model. PLoS Pathog. 8 (7), e1002813 (2012).
  39. Stewart, L., et al. Draft genomes of 12 host-adapted and environmental isolates of Pseudomonas aeruginosa and their positions in the core genome phylogeny. Pathog Dis. 71 (1), 20-25 (2014).
  40. Thrane, S. W., et al. The widespread multidrug-resistant serotype O12 Pseudomonas aeruginosa clone emerged through concomitant horizontal transfer of serotype antigen and antibiotic resistance gene clusters. MBio. 6 (5), e01396-e01315 (2015).
  41. van Belkum, A., et al. Phylogenetic Distribution of CRISPR-Cas Systems in Antibiotic-Resistant Pseudomonas aeruginosa. MBio. 6 (6), e01796-e01715 (2015).
  42. Lewenza, S., et al. Construction of a mini-Tn5-luxCDABE mutant library in Pseudomonas aeruginosa PAO1: a tool for identifying differentially regulated genes. Genome Res. 15 (4), 583-589 (2005).
  43. Current Protocols in Molecular Biology. , Wiley. (1994).
  44. Breidenstein, E. B., Khaira, B. K., Wiegand, I., Overhage, J., Hancock, R. E. Complex ciprofloxacin resistome revealed by screening a Pseudomonas aeruginosa mutant library for altered susceptibility. Antimicrob Agents Chemother. 52 (12), 4486-4491 (2008).
  45. Musken, M., Di Fiore, S., Dotsch, A., Fischer, R., Haussler, S. Genetic determinants of Pseudomonas aeruginosa biofilm establishment. Microbiology. 156 (Pt 2), 431-441 (2010).
  46. Schurek, K. N., et al. Novel genetic determinants of low-level aminoglycoside resistance in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother. 52 (12), 4213-4219 (2008).
  47. Oumeraci, T., et al. Comprehensive MALDI-TOF biotyping of the non-redundant Harvard Pseudomonas aeruginosa PA14 transposon insertion mutant library. PLoS One. 10 (2), e0117144 (2015).
  48. Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. J Bacteriol. 191 (18), 5592-5602 (2009).

Tags

Immunologi och infektion fråga 135 Pseudomonas aeruginosa mariner transposon mutant bibliotek mutagenes mikrobiologi opportunistiska infektioner immunologi
Replikering av beställt, Nonredundant bibliotek av <em>Pseudomonas aeruginosa</em> stam PA14 Transposon införande mutanter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Drenkard, E., Hibbler, R. M., Gutu,… More

Drenkard, E., Hibbler, R. M., Gutu, D. A., Eaton, A. D., Silverio, A. L., Ausubel, F. M., Hurley, B. P., Yonker, L. M. Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants. J. Vis. Exp. (135), e57298, doi:10.3791/57298 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter