Summary
I dette arbejde beskriver vi en akut, kronisk og mindretalsspørgsmålet bioassay for at studere virkningerne af enkelt og kombinerede stressfaktorer på den turkise killifish Nothobranchius furzeri. Denne protokol er designet til at studere livshistorie træk (dødelighed, vækst, frugtbarhed, vægt) og kritiske termisk maksimum.
Abstract
Killifish Nothobranchius furzeri er en spirende model organisme med hensyn til økotoksikologi og dens anvendelighed i akut og kronisk Økotoksicitet test har påvist. Samlet set er følsomheden af arterne, giftige forbindelser i området med, eller er større end de andre arter, model.
Dette arbejde beskriver protokoller for akut, kronisk og mindretalsspørgsmålet bioassays for enkelt og kombinerede stressor effekter på N. furzeri. På grund af sin korte modning tid og liv-cyklus, denne hvirveldyr model giver mulighed for undersøgelse af slutpunkter som modning tid og frugtbarhed inden fire måneder. Transgenerationel fulde livscyklus eksponering forsøg kan udføres i så lidt som 8 måneder. Da denne art producerer æg, der er tørke-resistent og forbliver levedygtige i årevis, on-site kultur af arterne er ikke nødvendig men enkeltpersoner kan være ansat, når det kræves. Protokollerne er designet til foranstaltning livshistorie træk (dødelighed, vækst, frugtbarhed, vægt) og kritiske termisk maksimum.
Introduction
Følsomhed profiler af en bred vifte af arter for strategisk udvalgte giftige stoffer har været beskrevet1 for den europæiske nå lovgivning (registrering, evaluering, autorisation og begrænsning af kemikalier). Akut eller kortsigtet toksicitet var for det meste bruges til dette formål, da de giver en hurtig indikation af en art følsomhed. Men i deres naturlige miljø, organismer udsættes i meget længere perioder og fuld af levetiden eller endda flere generationer kunne være berørt2. Derudover er organismer i forurenede miljøer typisk udsat for mere end en stressor på et tidspunkt, der kan interagere med hinanden, hvilket kan resultere i synergivirkninger3. Derfor kan sikkert koncentrationer beregnes baseret på akut, enkelt stressor toksicitet undervurdere de faktiske risici pålagt af giftige stoffer i naturlige miljøer. Det er derfor tilrådeligt at også studere de kroniske og mindretalsspørgsmålet virkninger af subletale koncentrationer af giftige stoffer i en miljømæssigt relevante kontekst som anbefalet af Kommissionen4,5 og USEPA (Forenede States Environmental Protection Agency)6,7. Især i hvirveldyr forskning er omkostninger i form af arbejdskraft, penge og tid høj, når du udfører kronisk og mindretalsspørgsmålet eksponeringsundersøgelser på grund af den relativt lange levetid af hvirveldyr i forhold til hvirvelløse modelorganismer. Derfor er det tilrådeligt at vælge den mest hensigtsmæssige fisk model organisme, afhængigt af forskningsspørgsmål. Desuden bør en bred vifte af vertebrater være tilgængelig for at teste det generelle indhold af svar på tværs af arter at tilpasse regler baseret på de mest følsomme arter. For nu er der behov for at udvikle nye og effektive protokoller med hvirveldyr model arter karakteriseret ved korte livscyklus at sænke omkostningerne ved udførelsen af kronisk og mindretalsspørgsmålet engagementer på hvirveldyr7,8.
Den turkis killifish Nothobranchius furzeri er en interessant fisk model til brug i sådanne langsigtede eksponering eksperimenter på grund af sin korte modning tid og liv-cyklus (generation gang mindre end 4 uger9). Det betyder, at økologisk relevante slutpunkter som modning tid og frugtbarhed kan studeres inden for en kort tidsramme i forhold til andre fisk modeller7. Derudover producerer disse fisk tørke-resistent, hvilende æg, at forbliver levedygtige i flere år når gemt under standardbetingelser, hvilket eliminerer behovet for en kontinuerlig kultur9. Økotoksikologiske undersøgelser indebærer dette også at kopiere fisk kan alle blive udklækket på nøjagtig samme tidspunkt, hvilket resulterer i tid synchrony for alle dyr, selv blandt partier af æg, der produceres på forskellige tidspunkter. Vi rådgiver, ved hjælp af laboratoriet GRZ stamme til at udføre eksponering eksperimenter. Denne stamme udfører godt under laboratorieforhold, er homozygot (undtagen kønskromosomer) og genomet er godt præget10,11.
Økotoksikologiske undersøgelser er det vigtigt at vælge den passende række af test-koncentrationer. Flere komplementære metoder kan bruges til dette formål. Den nominelle koncentrationsområde kan baseres på følsomheden af en beslægtede arter såsom Nothobranchius guentheri12. Alternativt, området kan være baseret på følsomheden af standard fisk modeller, såsom zebrafisk (Danio rerio)2 , der har en tilsvarende følsomhed for de fleste giftige stoffer (Philippe et al. (i anmeldelse)). I kombination med begge disse muligheder, bør et udvalg at finde eksperiment gennemføres for at vælge rækken nominelle koncentration. I forbindelse med akutte test bør forskere sigte efter koncentration behandlinger med 100% dødelighed, mellemliggende dødelighed og 0% dødelighed efter 24 timers eksponering for giftstoffet. For kroniske test, er det tilrådeligt at køre rækkevidde at finde eksperiment i to uger til at kontrollere, hvis larve dødelighed i stand med den højeste test-koncentration ikke overstiger 10% i løbet af denne referenceperiode.
Protokollen kan tjene som udgangspunkt til at udføre akut og kronisk eksponering for vandbårne forurenende stoffer på N. furzeri, undersøge potentielle virkninger af stressfaktorer på individuelle og cellulære niveau. Det kan også bruges til at udføre flere stressor forskning til at rumme en højere økologiske relevans, blande forskellige giftige stoffer eller studerer interaktive effekter mellem forurening og andre naturlige stressorer (fx prædation) eller menneskeskabte stressorer (f.eks. opvarmning på grund af klimaændringer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af det etiske udvalg af KULeuven.
1. rugeæg og generel vedligeholdelse af N. furzeri
- Forberede fisk medium (pH 7) ved en temperatur på 14 ° C og tilføje renset Type II vand med tilsat standardiseret salte, en ledningsevne på 600 µS/cm (24 ° C).
- Vælg æg fra linjen GRZ (Gona-Rhe-Zhou) laboratorium, der har været gemt under standardiserede betingelser13. Vælg æg i DIII fase (dvs. klar at klække), genkendelige ved tilstedeværelsen af gyldne øjne9 og forsigtigt overføre dem med en blød par pincet til en plastik 2 L tank (ikke mere end ca. 30 æg pr. tank).
Bemærk: For at have et tilstrækkeligt antal raske testorganismerne, klækkes dobbelt så mange æg som antallet af påkrævede fisk larver. - Tilsæt 1 cm fisk medium på 12 ° C og lad vandets temperatur gradvist konvergere til stuetemperatur (24 ° C)9. Fisk vil klække indenfor de første 12 timer.
- Efter 24 h, fodre hatchlings en koncentreret dosis af frisk udklækket Artemianauplii (for flere detaljer om hyppighed og mængden af mad, henvise til avl protokol af Polačik et al. 20169) og øge vanddybde til 5 cm af tilføje fisk medium.
- Efter 36 h, fodre hatchlings en koncentreret dosis af frisk udklækket Artemia nauplii og tilføje fisk medium for at øge vanddybde 10 cm.
- Inkuber fisk beholder (f.eks. i en inkubator, klima værelse eller opvarmet vandbad) under konstant temperatur under en 14 h:10 h lys: mørke regime.
- Før starten af eksperimentet, komplekse fisk containere (uden fisk) med den eksponering sammensatte ved at fylde dem med den højeste koncentration af eksponering medie og forlader det natten over for at begrænse overførslen af giftstoffer til objektbeholderen i den faktiske eksperiment.
- 48 timer efter klækning, vælge sunde livlig larver at starte eksponering eksperiment. Kassér såkaldte mave-skydere, der var ude af stand til at udfylde deres svømme blæren og derfor har en nedsat opdrift (løbende synker til bunds).
2. kortfristede eksponering protokol
Bemærk: Forskere bør stræbe efter mindst 20 replikater (20 fisk i separate krukker) pr. behandling. Ud over en fuld kontrol behandling, bør en solvent kontrol medtages, hvis stamopløsning af stoffet er udarbejdet ved hjælp af et opløsningsmiddel. Kontrolelementet opløsningsmiddel bør indeholde mængde opløsningsmiddel equaling koncentrationen af opløsningsmiddel i det højeste eksponeringskoncentration.
- Forberede de eksperimentelle containere (0,5 L glas) af mærkning dem og fylde dem med passende eksponering medium (forskellige giftstof koncentrationer). Tilføj sammensat for at opnå den korrekte koncentration.
- Overføre larver (48 timer efter klækning) individuelt til containere (1 fisk pr. beholder til individuel overvågning).
Bemærk: Fisk udsættes individuelt for at minimere forstyrrende virkninger af social interaktion som konkurrence for fødevarer og aggression. Fisk må dog visuelt interagere i overensstemmelse med etiske normer for laboratory animal brug. - Følge op på denne akut eksponering for en varighed af op til 2 uger. I løbet af denne tid, fodre fisk ad libitum med Artemia nauplii to gange om dagen, 7 dage om ugen.
- Opdater medium hver anden dag for at opretholde vandkvaliteten og til at minimere mulige effekter af sammensatte nedbrydning. Overvåge centrale vand variabler (opløst ilt niveauer bør overstiger 80%, ledningsevne bør variere mellem 600 og 700 µS/cm, pH 7,8 8,2 og hårdhed (som CaCO3) mellem 350 og 450 mg/L, som ligger inden for rækkevidde af optimale opdræt betingelser for N. furzeri 9). Tage vandprøver, før og efter forfriskende medium for at bestemme faktiske sammensatte koncentrationer.
- Slutpunkter
- Kontrollere fisk for dødelighed, stress (fx afvigende adfærd: svømning op og ned) eller sygdom dagligt (morgen, aften). Konsultere offentliggørelse af Shedd et al. (1999) 12 oplysninger om observation af dødelighed, stress eller sygdom.
- Beregne LC50 værdier baseret på dødelighed ved hjælp af dosis-respons kurver (Ritz og Streibig, 2005) på forskellige tidspunkter. Brug funktionen drm i den Demokratiske Republik Congo pakke i R v3.2.3 (R udvikling kerneteam, 2016) eller lignende statistiske metoder.
3. kronisk eksponering protokol
Bemærk: Formålet med minimum 25 fisk/tilstand i begyndelsen af eksperimentet, minimere chancerne for en skæv kønsfordeling og rumme potentielle baggrund dødeligheden som følge af naturlige årsager (dvs. aldersbetingede dødelighed).
- Rugeæg (se punkt 1)
- Fase I (2 dage efter klækningen-16 dage efter udrugning)
- Følg protokol, som beskrevet i punkt 2.1-2.4
- Som i den anden fase af eksperimentet, vil medium nedbrydes i løbet af ugen (ingen forfriskning, se nedenfor). Gemme den nødvendige mængde substrat for en uge i store inert beholdere for at tillade lignende nedbrydning af stoffet.
- Fase II (16 dage efter udrugning-udgangen)
- Forberede 2 L eksperimentelle glas krukker af kompleksbindende dem med sammensat. Fyld glassene med den korrekte eksponering medium og tilføje en luft rør for at lufte krukken. House fisk individuelt i disse krukker for den resterende del af forsøget. Tillad visuel interaktion til at rumme etiske standarder.
- Opdater mediet en gang om ugen. Overføre fisk med et net til en ny krukke indeholdende samme eksponering medium. Tage vandprøver hver dag hele ugen til at overvåge nedbrydningen af stoffet i hver koncentration behandling. Beregne en nedbrydning kurve for hver behandling hvis flere stressfaktorer er testet (f.eks. toksicitet af et sammensat i forskellige temperatur regimer). Måle abiotiske parametre (pH, temperatur, % opløst ilt, ledningsevne) tre gange om ugen.
- Fra 2 dage efter klækningen (dph) indtil 23 dph, fodre fisk to gange om dagen, 7 dage pr. uge ad libitum Artemia nauplii. Fra 24 dph - 37 dph, supplere den annonce libitumArtemia kost med hakkede Chironomus larver. Fodre fisk to gange om dagen, 7 dage pr. uge ad libitum frosne Chironomus larver fra 38 dph på.
- Slutpunkter
- Dagligt tjek fisk for dødelighed, stress eller sygdom12.
- At bestemme vækst, måle kropsstørrelse på ugebasis (9 dph - 16 dph - 21 dph -...) ved at overføre fisk til en petriskål fyldt med medium fra deres reservoir. Tage 4-5 størrelse kalibreret billeder af fisk fra ovennævnte (på en fast højde) og analysere dem digitalt ved brug af en fysisk måling program (f.eks. ImageJ).
Bemærk: For voksne fisk, bruge en højere petriskål for at minimere håndtering stress ved at holde alle fisk neddykket under hele måling proces. - For mandlige modning, visuelt inspicere fisk dagligt i farve fra 15 dph og fremefter. Kontrollere finner for første tegn på vielsesceremoni farvning (sekundær seksuel karakteristisk). Brug den første dag, hvor dette er synlig som en proxy for mandlige modning tid.
- Par ikke sexed fisk med hanner af gruppen samme behandling eller ikke-eksperimentelle mænd tre gange om ugen fra 30 dph og fremefter med henblik på at bestemme kvindelige modning tid (den dag det første æg er deponeret). Til dette, bruge gydende protokollen beskrevet i 3.4.5.
- For frugtbarhed, par modne hunner med modne mænd 3 gange / uge fra 30 dph og fremefter, inden for deres behandlinger ved hjælp af en passage ordning.
- Forberede en gydende tank (1 L) for hvert par, bruge eksponering medium fra mandlige akvariet suppleret med rogn substrat (fine sand < 500 µm).
- Overføre både mandlige og kvindelige i det gydende tank og tillade dem at gyde i to timer. Minimere menneskelig aktivitet eller forstyrrelse omkring de gydende beholdere under denne proces.
- Bagefter overføre forsigtigt fisk tilbage til deres oprindelige bolig containere, uden unødvendige blanding af vand, som ville hvirvle op æg i det gydende substrat.
- Filtrer æggene ved at hælde de gydende substrat over en 500 µm mesh. Regne æggene og overføre dem (ved hjælp af bløde pincet) til fugtig sphagnum i petriskåle9,14.
- Fjerne døde æg dagligt. Efter en uge, seal Petri fad med forsegling film og gemme det i en temperatur kontrolleret inkubator ved 28 ° C og 14:10 cyklus h lys: mørke for nærmeste udvikling DIII fase (dvs. klar til at klækkes efter ca. tre uger). Til langtidsopbevaring, gemme æg på 17 ° C i konstant mørke, hvorpå æggene ind i den hvilende fase og forblive levedygtige i flere år. Når rekruttere fisk fra disse hvilende æg til eksperimenter, overfører de hvilende æg til 28 ° C betingelser med 14:10 h cyklus lys: mørke for ca. tre uger at give mulighed for udvikling til DIII fase.
- Måle den kritiske termisk maksimum (CTmax) (et mål for ydeevnen15) af voksne fisk.
- Bruge et vandbad, der er opvarmet med en konstant hastighed på 0,33 ° C/min. og hvor vandet cirkuleres kontinuerligt. Tilføje flere 1 L akvarier for hver enkelt fisk.
Bemærk: Betragtning pladsproblemer i vandbadet, er det nødvendigt at arbejde i flere serier. Potentielle forskelle i vilkår blandt serie bør taget hensyn, når du udfører statistiske analyser af herunder 'serier' som en tilfældig faktor. - Start forsøget ved at tilføje fisk i akvariet, når vandet i akvariet har nået det eksperimentelle opdræt temperatur af fisk (generelt 28 ° C). Overvåge temperatur i 1 L akvarier af CTmax badet hver 5-min ved hjælp af en digital termometer (0,1 ° C skala).
- Afslutte retssagen, når fisken ikke opretholde en dorso-ventrally oprejst position eller starter trækninger stærkt16,17. Måle temperaturen i 1 L akvarium, som er den kritiske Maksimal temperatur. Overføre fisken tilbage til sin eksperimenterende boliger til recovery.
- Bruge et vandbad, der er opvarmet med en konstant hastighed på 0,33 ° C/min. og hvor vandet cirkuleres kontinuerligt. Tilføje flere 1 L akvarier for hver enkelt fisk.
- Måle vægten (0,1 mg nøjagtighed) af fisken på den sidste dag i eksperimentet ved klappede den tørre og overføre det på en vejning båd. Bemærk: Alle fisk bør måles fire timer efter den sidste fodring for at standardisere mad vægt i tarmkanalen.
- Aflive fisk ved hjælp af 0,1% Tricaine.
4. transgenerationel eksponering protokol
Bemærk: For at måle transgenerationel virkningerne af forurenende stoffer på N. furzeri, følge kronisk eksponering protokollen beskrevet ovenfor for første generation.
- To gange ugentligt, kontrollere udviklingen af de producerede æg (dvs. den anden generation) opbevares ved 28 ° C 14:10 h lys: mørke cyklus betingelser ved inspektion petriskåle til embryoner i DIII fase (Se Polačik et al. 20169). Når mere end 50 replikater af hver forældrenes behandling er fuldt udviklede, luge dem efter protokollen i 1.1.
- Udsætte sund, blomstrende fisk til præcis den samme opsætning og behandling som forældrenes fisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne af den akutte eksponering af N. furzeri til forskellige koncentrationer af kobber, beregnet som i 2.5.2, Vis cleardose-svar relationer (figur 1). Der er en stigning i dødeligheden med stigende giftstof koncentration. LC50 værdier falde over tid, hvilket betyder, at med faldende koncentrationer, mere tid passerer før 50% af flergangsbestemmelser dør. For detaljerede resultater om akut og kronisk eksponering af N. furzeri til kobber, samt en sammenligning af artens følsomhed i forhold til andre arter, henviser vi til Philippe et al. 20177.
I kronisk eksponering retssag er kropsstørrelse og frugtbarhed følsomme slutpunkter. Der kan være stor variation i væksten af fisk, afhængig af temperatur18. Voksen størrelser mellem 30 og 50 anses mm normalt i dette set-up. Set-up giver mulighed for at finde forskelle mellem behandlinger (figur 2A). I en kronisk eksponering analyse ved hjælp af vandbårne kobber, der var en signifikant effekt af kobber eksponering i løbet af uge 3 (χ²5,34 = 40,7, P < 0,001), med N. furzeri udsat for 19.38 µg/L Cu er mindre end alle andre fisk (alle P < 0,001) (figur 2B). For frugtbarhed, bør kontrollen værdier svinger mellem omkring 50 æg pr. uge pr. kvinde på toppen af ægget produktion7. I et andet eksperiment med vandbårne chlorpyrifos og en temperaturstigning på 2 ° C, vi fandt en betydelig interaktion mellem temperatur stigning og chlorpyrifos eksponering på frugtbarhed (χ22,202 = 25,3, P < 0,001). Ved 28 ° C, fisk udsættes for 4 µg/L produceret mindre æg i forhold til fisk udsat for 2 µg/L og kontrol fisk (både P < 0,001) (figur 2B). Ved 30 ° C, kontrol fisk produceret flere æg i forhold til alle chlorpyrifos udsat fisk (både P < 0,007). Begge hovedeffekten af eksponering for chlorpyrifos (χ22,202 = 96,8, P < 0,001) og den største effekt af temperaturen (χ21,202 = 10.18, P < 0,001) betydeligt nedsat frugtbarhed. Målingen er ganske tidskrævende håndtering af fisk og klædningen af æg på tørv9, men det er ofte de mest følsomme slutpunkt.
Modning tid er oftest ramt af forurenende stoffer i hanner. Mandlige modning tid var væsentligt påvirket af kronisk eksponering for vandbårne chlorpyrifos (χ22,41 = 11.79, P = 0,003), med hanner udsat for 4 µg/L CPF (C2) har en 18% langsommere modning i forhold til kontrol mænd (figur 3A ). Dette svar bør dog, fortolkes med forsigtighed, da modning tid scorede indirekte ved at bestemme udbrud af vielsesceremoni farve som en proxy. Selv om mænd anses for at modne et par dage efter udseendet af farvning9, kan der være nogle fejl på den præcise timing af modning ved hjælp af denne foranstaltning.
I nærheden af det termiske maksimale udstille fisk uregelmæssig svømning, øget opercular bevægelse og tab af evne til at forblive i en dorso-ventrally oprejst position 16,17. CTmax værdier varierer mellem N. furzeri stammer. Naturlige populationer har CTmax værdier mellem 39 og 42 ° C når opdrættet i temperaturer på mellem 24 og 28 ° C (figur 3B). Det indavlede GRZ stamme, men når allerede sin termiske maksimum på omkring 37-38 ° C, selv når opdrættet ved 28 ° C. Denne procedure er ikke dødelig til fisk, sjældne tilfælde af dødelighed forekommer. Sådanne fisk er bedst udelukket fra CTmax analysen, som de sandsynligvis repræsenterer fisk, der er i relativt dårlig generelle tilstand.
Tidligere resultater for det meste viste at CTmax kan blive påvirket af det forurenende stof, i dette tilfælde, 3,4-DCA (χ22,71= 17.65, P < 0,001) med fisk eksponeret for 0,1 mg/L 3,4-DCA med en lavere termisk maksimal 0.32 ° C i forhold til kontrol fisk (P < 0,001). Også CTmax var påvirket af opdræt temperaturen (χ21,71= 322.0, P < 0,001) og fisk der blev opdrættet på 28 ° C havde en 1,3 ° C højere CTmax sammenlignet med fisk der blev opdrættet på 24 ° C.
Figur 1: dosis-respons kurve for kobber eksponering. Dosis-respons kurver viser kumulative dødelighed af Nothobranchius furzeri i funktion af kobber eksponeringskoncentration (i µg/L Cu og eksponeringstid). Prikkerne angiver LC50 værdier. Dette tal er blevet ændret fra Philippe et al. 20172. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: effekter på størrelse og frugtbarhed som slutpunkter. A) størrelse (i cm) af Nothobranchius furzeri udsat for forskellige koncentrationer af kobber i uge 3, 7, 11 og 15. Stjerne angiver at C5 fisk er mindre efter tre uger på signifikansniveau p < 0,05. Værdier er præsenteret som betyder ± SEM. prøve størrelser er n = 6; 6; 7; 7; 7; 7 i uge 3, n = 6; 6; 7; 7; 4 i uge 7, n = 5; 4; 5; 5; 3 i uge 11 og n = 5; 3; 3; 5; 2 i uge 15. B) frugtbarhed gennem tiden af fisk udsættes for forskellige koncentrationer af chlorpyrifos, krydset med to temperatur behandlinger, målt som antallet af æg pr. uge. For at forbedre læsbarheden og interpretability af figuren, er fejllinjer ikke vist på grafer. Antallet af hunner i hver behandling i begyndelsen og slutningen af æglægning periode er angivet med bogstavet 'n'. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: virkningerne på modning tid og CTmax. A) gennemsnitsalder (i dage) som de første tegn på farvning optrådte han i hanner af Nothobranchius furzeri udsat for forskellige chlorpyrifos koncentrationer (0 µg/L (C0), 2 µg/L (C1) og 4 µg/L CPF (C2)) og to temperaturer (28 ° C og 30 ° C). B) gennemsnitlige kritiske termisk maksimum (CTmax) af fisk udsættes for forskellige koncentrationer af 3,4-DCA (0 mg/L 3,4-DCA (C0), 0,05 mg/L 3,4-DCA (C1) og 0,1 mg/L 3,4-DCA (C2)) og to temperaturer (24 ° C og 28 ° C). Nominel koncentration præsenteres som middelværdien ± SE. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Værket beskriver en ny bioassay ved hjælp af Nothobranchius furzeri, en spirende model organisme, for at studere enkelte og kombineret langtidsvirkninger af giftige stoffer og andre stressfaktorer. De præsenterede protokoller blev anvendt med succes til at måle følsomhed af arter til en bred vifte af giftige stoffer (kobber, cadmium, 3,4-dichloranilin og chlorpyrifos). På grund af den hurtige livscyklus, denne hvirveldyr model giver mulighed for vurdering af subletale og transgenerationel virkninger inden for fire måneder. En anden stor fordel ved at bruge denne fiskearter som en model for toksicitet screening er, at det producerer tørke-resistent æg. Dette gør det muligt for forskere at gemme æg eller få dem fra en leverandør og eliminerer behovet for et dyrt og tidskrævende on-site kultur. Derudover kan embryoner opbevares i flere år indtil hatchlings er nødvendige12.
Efter at have studeret følsomheden af N. furzeri til en række reference giftige stoffer, kan vi tilføje at følsomheden af arterne, der er inden for rækkevidde med eller højere end i andre model arter, afhængigt af det testede sammensatte. Måling af effekter på fertilitet, især kan øge sammenligneligheden af følsomhed på de undersøgte arter, da det er et rutinemæssigt målte slutpunkt i andre model arter. Endelig, det omfang som flere stressfaktorer udøve bivirkninger, når administreres enkeltvis eller kombineret, er afhængige af de evaluerede slutpunkt og eksponeringskoncentration.
Der er stadig nogle begrænsninger, når du arbejder med N. furzeri. En af de vigtigste begrænsninger er standardiseringen af mad. Partier af Artemia cyster eller bloodworms kan varierer i kvalitet og som sådan, kan påvirke resultaterne af undersøgelsen. Det er derfor tilrådeligt at bestille et stort parti af mad til brug under hele varigheden af forsøget.
Vi mener, at denne protokol er alment gældende for økotoksikologiske screening. N. furzeri hurtigt udvikle sig til en standard test arter i økotoksikologi. Tilgængeligheden af denne standard protokol kan brændstof dens oprettelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for gruppen KUGLENS af UAntwerpen og afdeling for Plantebeskyttelse i Ugent analyse af vandprøver. Under dette projekt blev leveret af Excellence Center ' Eco og socio-evolutionære dynamics (PF/10/007) af KU Leuven Research Fund. AFG (11Q0516N) og ESJT (CVE-SB151323) blev finansieret som ph.d.- og TP (12F0716N) som post-ph.d.-stipendiat ved CVE Flandern (Fonds Wetenschappelijk Onderzoek).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| purified water Type 1 (milli Q) | Millipore | ||
| Sea Salt | Instant Ocean | ||
| 2L plastic tank | SAVIC | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 1L plastic tank (spawning) | Avamoplast | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| nets | Aqua bilzen | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 2L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 0,5L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| Artemia eggs | Ocean Nutrition | ||
| chironomus | Ocean Nutrition | frozen | |
| tricaine | Sigma aldrich | ||
| petri dishes | VWR | ||
| Parafilm | VWR | ||
| pipettes | MLS | ||
| tweezers | FST | ||
| 500 µm mesh sieve | / | self-made | |
| microcentrifuge tube (2ml) | BRAND | To store fish in freezer | |
| glass vials | Sigma aldrich | For water analysis | |
| weighing boat | MLS | ||
| Jiffy 7c pellets | Jiffy | ||
| water bath | Gilac | for Ctmax | |
| liquid nitrogen | Air liquide | ||
| digital thermometer | Testo AG | testo 926 | |
| HETO therm heater | Anker Schmitt | ||
| calibrated balance | Mettler-Toledo AG | ||
| camera | / | ||
| platform for camera | / | self-made | |
| Multiparameter kit | HACH | ||
| Freezer (-80°C) | Panasonic Ultra low temperature freezer | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fysio | |||
| homogenisation buffer | VWR | 0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100 | |
| chloroform:methanol | Sigma Aldrich | ||
| glyceryl tripalmitate | Sigma Aldrich | ||
| amyloglucosidase | Sigma Aldrich | A7420 | |
| glucose assay reagent | Sigma Aldrich | G3293 | |
| Biorad protein dye | VWR | ||
| 96-well microtiter plate | Greiner Bio-one | ||
| 384 microtiter plates | Greiner Bio-one | ||
| 2 ml glass tubes | Fiers | For fat analysis | |
| 2,5ml eppendorf tubes | VWR | ||
| homogeniser | Ultra-turrax TP 18/10 | ||
| photospectrometer | Infinite M200 TECAN | ||
| heater for glass tubes | Hach COD REACTOR | ||
| centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5415 R | ||
| Incubator | Bumako |
References
- European-Chemicals-Bureau. TAPIR Three point three-A Project for the Information Requirements of REACH. Final Report-2 August 2005. Scoping study on the development of a Technical Guidance Document on information requirements on intrinsic properties of substances (RIP 3.3-1). , (2005).
- Philippe, C., et al. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , 26-35 (2017).
- Noyes, P. D., Lema, S. C. Forecasting the impacts of chemical pollution and climate change interactions on the health of wildlife. Current Zoology. 61 (4), 669-689 (2015).
- Consommateurs, S. S. d Health & Consumer Protection Directorate-General European Commission. 4, Brussels (BE). SANCO/3268/2001 rev. 4 (final) (2002).
- Commission, E. E. Guidance document on aquatic ecotoxicology. Under Council directive 91/414/EEC. SANCO/3268/2001 Rev 4. 2002b. , (2002).
- EPA. Ecological Effects Test Guidelines, OPPTS 850.1500 Fish life cycle toxicity. , Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-07/documents/850-1500.pdf (1996).
- Philippe, C. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , (2017).
- Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future. Aquatic Toxicology. 78 (1), 91-102 (2006).
- Polačik, M., Blažek, R., Reichard, M. Laboratory breeding of the short-lived annual killifish Nothobranchius furzeri. Nature Protocols. 11 (8), 1396-1413 (2016).
- Reichwald, K., et al. Insights into Sex Chromosome Evolution and Aging from the Genome of a Short-Lived Fish. Cell. 163 (6), 1527-1538 (2015).
- Valenzano, D. R., et al. The African Turquoise Killifish Genome Provides Insights into Evolution and Genetic Architecture of Lifespan. Cell. 163 (6), 1539-1554 (2015).
- Shedd, T. R., Widder, M. W., Toussaint, M. W., Sunkel, M. C., Hull, E. Evaluation of the annual killifish Nothobranchius guentheri as a tool for rapid acute toxicity screening. Environ. Toxicol. Chem. 18 (10), 2258-2261 (1999).
- Platzer, M., Englert, C. Nothobranchius furzeri: a model for aging research and more. Trends Genet. 32 (9), 543-552 (2016).
- Watters, B. The ecology and distribution of Nothobranchius fishes. J Am Killifish Assoc. 42, 58-61 (2009).
- Op de Beeck, L., Verheyen, J., Stoks, R. Competition magnifies the impact of a pesticide in a warming world by reducing heat tolerance and increasing autotomy. Environ Pollut. 233, 226-234 (2018).
- Patra, R. W., Chapman, J. C., Lim, R. P., Gehrke, P. C. The effects of three organic chemicals on the upper thermal tolerances of four freshwater fishes. Environ. Toxicol. Chem. 26 (7), 1454-1459 (2007).
- Beitinger, T. L., Bennett, W. A., McCauley, R. W. Temperature tolerances of North American freshwater fishes exposed to dynamic changes in temperature. Environ Biol Fishes. 58 (3), 237-275 (2000).
- Cellerino, A., Valenzano, D. R., Reichard, M. From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology. Biological Reviews. , (2015).
