Summary
In questo lavoro descriviamo un biotest acute, croniche e multigenerazionale per studiare gli effetti dei fattori di stress singoli che combinati sul turchese killifish Nothobranchius furzeri. Questo protocollo è progettato per studiare i tratti di storia di vita (mortalità, crescita, fecondità, peso) e critico massimo termico.
Abstract
Il killifish Nothobranchius furzeri è un organismo modello emergenti nel campo dell'ecotossicologia e sua applicabilità nelle prove di ecotossicità acuta e cronica è stata dimostrata. Nel complesso, la sensibilità della specie di composti tossici è nella gamma con, o superiore, quello di altre specie di modello.
Questo lavoro descrive protocolli per analisi biologiche acute, croniche e multigenerazionale di effetti stressor singole e combinate il N. furzeri. Grazie alla sua breve stagionatura e ciclo di vita, questo modello vertebrato permette lo studio di endpoint come tempo di maturazione e fecondità entro quattro mesi. Prove di esposizione di transgenerazionale intero ciclo di vita possono essere eseguite in appena 8 mesi. Poiché questa specie produce uova che sono resistenti alla siccità e rimangono vitale per anni, la cultura in loco delle specie non è necessario, ma gli individui possono essere reclutati quando richiesto. I protocolli sono progettati a misura tratti di storia di vita (mortalità, crescita, fecondità, peso) e critico massimo termico.
Introduction
Profili di sensibilità di una matrice di specie alle sostanze tossiche strategicamente selezionati sono stati descritti1 per la normativa europea REACH (registrazione, valutazione, autorizzazione e restrizione delle sostanze chimiche). Prove di tossicità acuta o a breve termine principalmente sono state usate per questo scopo in quanto danno una rapida indicazione di sensibilità di una specie. Tuttavia, nel loro ambiente naturale, gli organismi sono esposti per periodi molto più lunghi e cicli di vita completo o anche diverse generazioni potrebbero essere interessato2. Inoltre, organismi in ambienti inquinati in genere sono esposti a più di un fattore di stress in un momento, che può interagire con l'altro, possibilmente con conseguente effetti sinergici3. Quindi, sicuro concentrazioni calcolato basato sul fattore di stress acuto, unico test di tossicità possono sottovalutare i rischi effettivi imposti da sostanze tossiche negli ambienti naturali. Si consiglia, pertanto, anche studiare gli effetti cronici e multigenerazionale di concentrazioni subletali di sostanze tossiche in un contesto ecologicamente rilevante come sostenuto dalla Commissione europea4,5 e USEPA (Regno States Environmental Protection Agency)6,7. Particolare nella ricerca dei vertebrati, i costi in termini di lavoro, tempo e denaro sono elevati durante l'esecuzione di studi di esposizione cronica e multigenerazionale a causa la durata relativamente lunga dei vertebrati rispetto ad organismi invertebrati marini modello. Pertanto, si consiglia di scegliere l'organismo di modello più appropriato di pesce, a seconda della domanda di ricerca. Inoltre, una vasta gamma di specie di vertebrati dovrebbe essere disponibile al fine di testare la generalità delle risposte tra le specie di essere in grado di adattare i regolamenti basati sulle specie più sensibili. Per ora, c'è la necessità di sviluppare nuovi, efficienti protocolli con specie di vertebrati modello caratterizzato da cicli di vita brevi per abbassare i costi di realizzare esposizioni croniche e multigenerazionale su vertebrati7,8.
Il turchese killifish Nothobranchius furzeri è un interessante modello di pesce da utilizzare in tali esperimenti di esposizione a lungo termine a causa della sua breve stagionatura e ciclo di vita (tempo di generazione meno di 4 settimane9). Ciò significa che possono essere studiati gli endpoint ecologicamente rilevanti quali il tempo di maturazione e fecondità entro un breve lasso di tempo rispetto ad altri modelli di pesci7. Inoltre, questi pesci producono uova resistenti alla siccità, dormienti che rimangono vitali per diversi anni se conservato in condizioni standard, eliminando così la necessità di un continuo cultura9. In studi ecotossicologici, ciò implica anche che replicare pesce possono tutti essere covate nel momento esatto stesso, risultanti in sincronia di tempo per tutti gli animali, anche tra i lotti di uova prodotte in momenti diversi. Si consiglia di utilizzare il laboratorio ceppo GRZ per eseguire esperimenti di esposizione. Questo ceppo esegue bene in condizioni di laboratorio, è omozigote (ad eccezione di cromosomi sessuali) e il genoma è ben caratterizzata10,11.
In studi ecotossicologici, è importante selezionare l'appropriato intervallo di concentrazioni di prova. Diversi metodi complementari possono essere utilizzato a tal fine. La gamma di concentrazione nominale può essere basata sulla sensibilità di una specie correlata, come ad esempio Nothobranchius guentheri12. In alternativa, la gamma può essere basata sulla sensibilità dei modelli di pesce standard, come zebrafish (Danio rerio)2 che hanno una sensibilità paragonabile alla maggior parte delle sostanze tossiche (Philippe et al. (in revisione)). In combinazione, con entrambe le opzioni, un esperimento per individuare l'intervallo dovrebbe essere condotti per selezionare l'intervallo di concentrazione nominale. Per il test acuto, i ricercatori dovrebbero mirare per trattamenti a concentrazione con 100% di mortalità, mortalità intermedi e 0% di mortalità dopo 24 h di esposizione per la sostanza tossica. Per il test cronico, si consiglia di eseguire l'esperimento per due settimane verificare se mortalità larvale nella condizione con le più alte concentrazioni di prova non superi il 10% durante questo periodo di riferimento per individuare l'intervallo.
Il protocollo può servire come base per eseguire esposizione acuta e cronica alle sostanze inquinanti a base acquosa su N. furzeri, esamina gli effetti potenziali dei fattori di stress sia a livello individuale e cellulare. Può anche essere utilizzato per eseguire la ricerca multi-fattore di sforzo per accogliere una maggiore rilevanza ecologica, mescolando diversi composti tossici o studiando gli effetti interattivi tra inquinamento e altri fattori di stress naturali (es. predazione) o antropica fattori di stress (ad es. il riscaldamento dovuto ai cambiamenti climatici).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal comitato etico di KULeuven.
1. cova e manutenzione generale di N. furzeri
- Preparare pesce medio (pH 7) ad una temperatura di 14 ° C e aggiungere acqua purificata di tipo II, con aggiunto sali standardizzati, ad una conducibilità di 600 µS/cm (24 ° C).
- Selezionare uova dalla linea laboratorio GRZ (Gona-Rhe-Zhou) che sono stati conservati in condizioni standardizzate13. Selezionare uova nella fase DIII (cioè pronto a schiudersi), riconoscibile dalla presenza di occhi d'oro9 e delicatamente trasferirli con un morbido paio di pinzette per un serbatoio di plastica 2L (non più di circa 30 uova per carro armato).
Nota: Al fine di avere un numero sufficiente di organismi di prova sana, covare le uova due volte altretante come il numero di larve di pesci richiesto. - Aggiungere 1 cm del mezzo pesce a 12 ° C e lasciare che la temperatura dell'acqua convergono gradualmente a temperatura ambiente (24 ° C)9. Pesci si schiudono entro le prime 12 ore.
- Dopo 24 h, nutrire le hatchlings una dose concentrata di appena schiusi Artemianauplii (per maggiori dettagli sulla frequenza e quantità di cibo, fare riferimento al protocollo di allevamento di Polačik et al 20169) e aumentare la profondità di acqua a 5 cm di aggiungere il mezzo pesce.
- Dopo 36H, nutrire le hatchlings un'altra dose concentrata di appena schiusi naupli di Artemia e aggiungere il pesce terreno per aumentare la profondità di acqua a 10 cm.
- Incubare i contenitori del pesce in condizioni di temperatura costante (ad es. in un incubatore, clima o bagnomaria riscaldata) sotto un h 14 h:10 regime di luce: scuro.
- Prima dell'inizio dell'esperimento, contenitori complesso pesce (senza pesce) con l'esposizione composto da riempiendole con la più alta concentrazione del mezzo di esposizione e lasciarlo tutta la notte al fine di limitare il trasferimento di sostanze tossiche per il contenitore nel reale esperimento.
- 48 ore dopo la schiusa, selezionare larve sane capace di galleggiare per iniziare l'esperimento di esposizione. Scartare il cosiddetti pancia-cursori che erano in grado di riempire la loro vescica natatoria e conseguentemente avere un galleggiamento alterata (affondare continuamente verso il basso).
2. a breve termine dell'esposizione protocollo
Nota: I ricercatori dovrebbero mirare per almeno 20 ripetizioni (20 pesci in vasi separati) per trattamento. Oltre a un trattamento di controllo completo, un controllo solvente dovrebbe essere incluso se la soluzione di riserva del composto è preparata utilizzando un solvente. Il controllo solvente deve contenere la quantità di solvente eguagliando la concentrazione di solventi nel più alta concentrazione di esposizione.
- Preparare i contenitori sperimentali (vasi di vetro 0,5 L) di etichettarli e riempiendole con il mezzo di esposizione appropriata (diverse concentrazioni tossico). Aggiungere il composto per ottenere la giusta concentrazione.
- Trasferire le larve (post-schiusa 48h) individualmente ai contenitori (1 pesce per contenitore per la sorveglianza individuale).
Nota: I pesci sono esposti individualmente per ridurre al minimo i potenziali effetti confondenti di interazione sociale quali la concorrenza per il cibo e aggressione. Tuttavia, pesce consentiti interagire visivamente in conformità agli standard etici per l'uso di animali di laboratorio. - Follow-up questa esposizione acuta per una durata di fino a 2 settimane. Durante quel tempo, nutrire i pesci ad libitum con naupli di Artemia due volte al giorno, 7 giorni alla settimana.
- Aggiornare il mezzo ogni giorno per mantenere la qualità dell'acqua e per ridurre al minimo i potenziali effetti di degradazione di composti. Monitorare le variabili chiave acqua (livelli di ossigeno disciolto devono superare l'80%, conducibilità deve essere compreso tra 600 e 700 µS/cm, pH tra 7,8 e 8,2 e durezza (come CaCO3) compreso tra 350 e 450 mg/L, che si trova all'interno della gamma di ottimale condizioni di allevamento per furzeri N. 9). Prelevare campioni di acqua prima e dopo l'aggiornamento il mezzo per determinare le concentrazioni di composte effettive.
- Endpoint
- Controllare il pesce per la mortalità, lo stress (per esempio comportamento aberrante: nuoto a testa in giù) o malattia di tutti i giorni (mattina, sera). Consultare la pubblicazione di Shedd et al. (1999) 12 per i dettagli sull'osservazione di mortalità, stress o malattia.
- Calcolare LC50 valori basati sulla mortalità utilizzando curve dose-risposta (Ritz e Streibig, 2005) in diversi momenti. Utilizzare la funzione drm nel pacchetto RDC in v3.2.3 R (R Development Core Team, 2016) o simili approcci statistici.
3. cronica esposizione protocollo
Nota: Mirare a un minimo di 25 pesci/condizione all'inizio dell'esperimento, per ridurre al minimo le probabilità di un sesso sbilanciata e per ospitare la mortalità di sfondo potenziali dovuti a cause naturali (cioè. mortalità senile).
- Da cova (vedere sezione 1)
- Fase I (2 giorni post-schiusa-16 giorni post-schiusa)
- Seguire il protocollo come descritto al punto 2.1-2.4
- Come durante la seconda fase dell'esperimento, il medium si degrada durante tutta la settimana (nessun rinfresco, vedi sotto). Memorizzare la quantità necessaria di media per una settimana in grandi contenitori inerti al fine di consentire simile degradazione del composto.
- Fase II (16 giorni post-schiusa-fine)
- Preparare 2 L sperimentale barattoli in vetro complessandosi li con il composto. Riempire i vasetti con il mezzo di esposizione corretta e aggiungere un tubo aria per aerare il vaso. Pesce di casa individualmente in questi vasi per il resto dell'esperimento. Consentire l'interazione visiva ospitare standard etici.
- Aggiornare il mezzo una volta a settimana. Trasferire il pesce con una rete in un nuovo vaso contenente lo stesso mezzo di esposizione. Prelevare campioni di acqua ogni giorno per tutta una settimana per monitorare la degradazione del composto in ogni trattamento di concentrazione. Calcolare una curva di degradazione per ogni trattamento se multipli fattori di sforzo sono testati (ad es. la tossicità di un composto nei regimi di temperatura diversa). Misurare i parametri abiotici (pH, temperatura, ossigeno % disciolto, conducibilità) tre volte alla settimana.
- Da 2 giorni post-schiusa (dph) fino a 23 dph, nutrire i pesci due volte al giorno, 7 giorni a naupli di Artemia ad libitum di settimana. Da 24 dph - 37 dph, integrare la dieta di annuncio libitumArtemia con le larve di Chironomus tritate. Da 38 dph su, nutrire i pesci due volte al giorno, 7 giorni alla settimana ad libitum congelato Chironomus larve.
- Endpoint
- Controllo quotidiano pesce per mortalità, stress o malattia12.
- Per determinare la crescita, misurare le dimensioni del corpo su base settimanale (dph 9 - 16 dph - 21 dph -...) trasferendo pesce ad una capsula di Petri riempito con il mezzo da loro serbatoio. Prendere le immagini di dimensioni calibrate di 4-5 del pesce dall'alto (a quota fissa) e analizzarli digitalmente utilizzando un programma di misurazione spaziale (ad es. ImageJ).
Nota: Per pesci adulti, utilizzare una piastra Petri superiore per minimizzare lo sforzo di gestione mantenendo tutti i pesci sommersi durante tutto il processo di misura. - Per maschio maturazione, ispezionare visivamente il pesce tutti i giorni per la colorazione da dph 15 in poi. Controllare le pinne per primi segni di colorazione nuziale (delle caratteristiche sessuali secondarie). Utilizzare il primo giorno in cui questo è visibile come un proxy per tempo di maturazione maschio.
- Coppia pesci non sessuato con maschi dello stesso gruppo di trattamento o non sperimentali maschi tre volte alla settimana da 30 dph in poi al fine di determinare il tempo di maturazione femminile (il giorno è depositato il primo uovo). Per questo, utilizzare il protocollo riproduttivo descritto in 3.4.5.
- Per fecondità, coppia matura femmine con maschi maturi 3 volte / settimana da dph 30 in poi, all'interno dei loro trattamenti utilizzando uno schema di attraversamento.
- Preparare un carro armato di deposizione delle uova (1 L) per ogni coppia, usando il mezzo di esposizione dall'acquario maschio completato con substrato di deposizione delle uova (sabbia fine < 500 µm).
- Trasferire il maschio e la femmina nel serbatoio di deposizione delle uova e consentire loro di deporre le uova per due ore. Ridurre al minimo di attività umana o dispersione intorno i contenitori di deposizione delle uova durante questo processo.
- In seguito, trasferire delicatamente pesce torna a loro contenitori originali di alloggiamento, senza inutili miscelazione dell'acqua, che sarebbe vortice le uova nel substrato di deposizione delle uova.
- Filtrare le uova versando il substrato di deposizione delle uova su una maglia di 500 µm. Contare le uova e trasferirli (utilizzando pinzette morbide) a umido muschio di torba in capsule di Petri9,14.
- Eliminare le uova dei morte ogni giorno. Dopo una settimana, tenuta il Petri piatto con pellicola sigillante e memorizzarlo in una temperatura controllata incubatore a 28 ° C e un 14:10 h chiaro: scuro ciclo per lo sviluppo immediato alla fase DIII (cioè pronto a schiudersi dopo circa tre settimane). Per l'archiviazione a lungo termine, conservare le uova a 17 ° C in costante oscurità su cui uova immettere la fase dormiente e rimangono vitali per più anni. Quando il pesce da queste uova dormienti per esperimenti di reclutamento, trasferire le uova dormienti a condizioni di 28 ° C con 14:10 h chiaro: scuro ciclo per circa tre settimane consentire lo sviluppo alla fase di DIII.
- Misurare il massimo termico critico (CTmax) (una misura per prestazioni15) di pesci adulti.
- Utilizzare una vasca di acqua che viene riscaldata ad un tasso costante di 0,33 ° C/min e nel quale l'acqua circola continuamente. Aggiungere diversi acquari 1 L per ogni singolo pesce.
Nota: Dati i vincoli di spazio nel bagno d'acqua, è necessario lavorare in diverse serie. Differenze di potenziale in condizioni tra serie dovrebbero tener conto durante l'esecuzione di analisi statistiche includendo 'serie' come un fattore casuale. - Iniziare la prova aggiungendo i pesci nell'acquario, quando l'acqua nell'acquario ha raggiunto la temperatura di allevamento sperimentale del pesce (in genere 28 ° C). Controllo della temperatura negli acquari 1 L del bagno CTmax ogni 5 min usando un termometro digitale (scala di 0,1 ° C).
- Termina il processo quando il pesce non riesce a mantenere una posizione eretta dorso-ventralmente o inizia contrrre pesantemente16,17. Misurare la temperatura nell'acquario 1 L, che è la massima temperatura critica. Trasferire il pesce torna alla sua sede sperimentale per il recupero.
- Utilizzare una vasca di acqua che viene riscaldata ad un tasso costante di 0,33 ° C/min e nel quale l'acqua circola continuamente. Aggiungere diversi acquari 1 L per ogni singolo pesce.
- Misurare il peso (precisione 0,1 mg) del pesce l'ultimo giorno dell'esperimento di pacche asciutto e trasferirlo su una barca di pesatura. Nota: Tutti i pesci dovrebbero essere misurati quattro ore dopo l'ultima alimentazione per standardizzare peso di cibo nel tratto intestinale.
- Eutanasia il pesce utilizzando 0,1% tricaina.
4. protocollo di esposizione transgenerazionale
Nota: Per misurare transgenerazionale effetti degli inquinanti sulla N. furzeri, seguire il protocollo di esposizione cronica sopra descritto per la prima generazione.
- Due volte alla settimana, controllare lo sviluppo delle uova prodotte (cioè la seconda generazione) conservato a 28 ° C 14:10 condizioni ciclo h chiaro: scuro controllando le capsule di Petri per embrioni nella fase DIII (Vedi Polačik et al. 20169). Quando più di 50 repliche di ogni trattamento parentale sono completamente sviluppati, schiudono li seguendo il protocollo in 1.1.
- Esporre il pesce sano, capace di galleggiare esattamente lo stesso set-up e trattamento come il pesce parentale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I risultati dell'esposizione acuta del N. furzeri a diverse concentrazioni di rame, calcolati come in 2.5.2, mostrano relazioni cleardose-risposta (Figura 1). C'è un aumento della mortalità con l'aumento di concentrazione tossico. LC50 i valori diminuiscono nel tempo, significa che con le concentrazioni in diminuzione, più tempo passa prima di 50% dello stampo replicati. Per i risultati dettagliati sull'esposizione acuta e cronica di N. furzeri al rame, così come il confronto della sensibilità della specie rispetto ad altre specie, ci riferiamo a Philippe et al 20177.
L'esposizione cronica prova, fecondità e dimensioni del corpo sono sensibili endpoint. Ci può essere ampia variazione nella crescita dei pesci, a seconda della temperatura18. Taglie per adulti tra i 30 e 50 mm sono considerati normali in questo set-up. Il set-up permettono di trovare le differenze fra i trattamenti (Figura 2A). In un'analisi di esposizione cronica usando rame a base acquosa, c'era un effetto significativo di rame esposizione durante tre settimane (χ²5,34 = 40.7, P < 0,001), con N. furzeri esposti a 19.38 µ g/L Cu essendo più piccolo di tutti gli altri pesci (tutti i P < 0.001) (Figura 2B). Per fecondità, i valori di controllo dovrebbero oscillare tra circa 50 uova a settimana per femmina al picco della produzione di uova7. In un altro esperimento, usando a base acquosa Clorpirifos e un aumento di temperatura di 2 ° C, abbiamo trovato un'interazione significativa fra esposizione temperatura aumento e Clorpirifos sulla fecondità (χ22.202 = 25,3, P < 0,001). A 28 ° C, pesci esposti a 4 µ g/L prodotto meno uova rispetto ai pesci esposti a 2 µ g/L e controllo pesce (entrambi P < 0,001) (Figura 2B). A 30 ° C, controllo pesce prodotto più uova rispetto a tutti i pesci di Clorpirifos esposti (entrambe P < 0.007). Sia l'effetto principale di esposizione al clorpirifos (χ22.202 = 96,8, P < 0,001) e l'effetto principale della temperatura (χ21.202 = 10,18, P < 0,001) ha ridotto significativamente fecondità. La misura è piuttosto lento a causa della manipolazione del pesce e la placcatura delle uova su torba9, ma è spesso l'endpoint più sensibile.
Tempo di maturazione è più spesso colpito dagli inquinanti nei maschi. Tempo di maturazione maschio è stato significativamente l'esposizione cronica a base acquosa Clorpirifos (χ22,41 = 11,79, P = 0,003), con i maschi esposti a 4 µ g/L CPF (C2) avendo una maturazione più lenta del 18% rispetto ai maschi di controllo (Figura 3A ). Questa risposta dovrebbe, tuttavia, essere interpretati con cautela poiché il tempo di maturazione è segnato indirettamente determinando l'insorgenza di colorazione nuziale come proxy. Anche se i maschi sono considerati a maturare un paio di giorni dopo la comparsa di colorazione9, ci può essere qualche errore sull'esatta tempistica di maturazione usando questa misura.
Vicino il massimo termico, pesci esibiscono nuoto irregolare, movimento opercular aumentato e la perdita di capacità di rimanere in una posizione dorso-ventralmente verticale 16,17. CTmax valori differiscono tra N. furzeri ceppi. Popolazioni naturali hanno valori di CTmax tra 39 ° C e 42 ° C quando allevati a temperature comprese tra 24 e 28 ° C (Figura 3B). Il ceppo inbred GRZ, tuttavia, già raggiunge il suo massimo termico a circa 37-38 ° C, anche quando allevati a 28 ° C. Considerando che questa procedura non è letale per i pesci, verificarsi rari casi di mortalità. Tali pesci migliori sono esclusi dall'analisi CTmax, dato che molto probabilmente rappresentano pesci che sono in condizioni generali relativamente povero.
Risultati precedenti principalmente ha mostrati che il CTmax può essere influenzato dall'inquinante, in questo caso, 3,4-DCA (χ22,71= 17,65, P < 0,001) con i pesci esposti a 0,1 mg/L. 3,4-DCA avendo un massimo termico inferiore di 0,32 ° C rispetto ai pesci di controllo (P < 0,001). Inoltre, CTmax è stato influenzato dalla temperatura dell'allevamento (χ21,71= 322.0, P < 0,001) e pesci che sono stati allevati a 28 ° C avevano un 1,3 ° C CTmax maggiore rispetto per pesci che sono stati allevati a 24 ° C.
Figura 1: curva Dose-risposta per l'esposizione rame. Le curve dose-risposta visualizzando mortalità cumulativa di Nothobranchius furzeri in funzione della concentrazione di rame dell'esposizione (in µ g/L Cu e in relazione al tempo di esposizione). I punti indicano valori50 LC. Questa figura è stata modificata da Philippe et al 20172. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: effetti sulla dimensione e fecondità come endpoint. A) dimensioni (in cm) di Nothobranchius furzeri esposto a diverse concentrazioni di rame alla settimana 3, 7, 11 e 15. Asterisco indica che C5 pesci sono più piccoli dopo tre settimane con il livello di significatività di P < 0.05. I valori sono presentati come media ± SEM. campione dimensioni sono n = 6; 6; 7; 7; 7; 7 in settimana 3, n = 6; 6; 7; 7; 4 in settimana 7, n = 5; 4; 5; 5; 3 nella settimana 11 e n = 5; 3; 3; 5; 2 nella settimana 15. B) fecondità attraverso il tempo di pesce esposto a diverse concentrazioni di clorpirifos, attraversato con due trattamenti di temperatura, misurata come numero di uova alla settimana. Per migliorare la leggibilità e l'interpretabilità della figura, barre di errore non vengono visualizzati nei grafici. Il numero di femmine in ogni trattamento all'inizio e alla fine del periodo di deposizione delle uova è indicato con la lettera ' n '. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: effetti sul tempo di maturazione e CTmax. A) dire età (in giorni) in cui i primi segni di colorazione appariva nei maschi di Nothobranchius furzeri esposti a concentrazioni diverse Clorpirifos (0 µ g/L (C0), 2 µ g/L (C1) e 4 µ g/L CPF (C2)) e due temperature (28 ° C e 30 ° C). B) massimo termico critico media (CTmax) di pesce esposto a diverse concentrazioni di 3,4-DCA (0 mg/L 3,4-DCA (C0), 0,05 mg/L 3,4-DCA (C1) e 0,1 mg/L 3,4-DCA (C2)) e due temperature (24 ° C e 28 ° C). Concentrazioni nominali sono presentate come media ± SE. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo lavoro descrive un nuovo saggio biologico usando Nothobranchius furzeri, un organismo modello emergente, per studiare l'individuo e gli effetti a lungo termine di sostanze tossiche e altri fattori di stress combinati. I protocolli presentati sono stati applicati correttamente per misurare la sensibilità delle specie in una matrice di sostanze tossiche (rame, cadmio, 3,4-dicloroanilina e Clorpirifos). A causa del suo ciclo di vita veloce, questo modello di vertebrati consente per la valutazione di subletali e transgenerazionale effetti entro quattro mesi. Un altro grande vantaggio di usare questa specie di pesci come un modello per lo screening di tossicità è il fatto che produce uova resistenti alla siccità. Questo consente ai ricercatori di conservare le uova o ottenerli da un fornitore ed elimina la necessità di una cultura in loco costosa e richiedono tempo. Inoltre, gli embrioni possono essere memorizzati per diversi anni fino a quando hatchlings sono necessari12.
Dopo aver studiato la sensibilità del N. furzeri ad un numero di sostanze tossiche di riferimento, possiamo aggiungere che la sensibilità della specie è in gamma con, o modello superiore, che di altre specie, secondo il composto testato. Misurare gli effetti sulla fecondità, in particolare, può aumentare la comparabilità della sensibilità sulle specie studiate, trattandosi di un endpoint ordinariamente misurato in altre specie di modello. Infine, nella misura in cui fattori di stress multipli esercitano effetti negativi, quando somministrata singolarmente o combinati, dipende l'endpoint valutato e la concentrazione di esposizione.
Ci sono ancora alcune limitazioni quando si lavora con N. furzeri. Una delle limitazioni più importanti è la standardizzazione del cibo. Lotti di cisti di Artemia o Chironomus possono differire in termini di qualità e come tale, possono, impatto i risultati dello studio. Pertanto si consiglia di ordinare un batch di grandi dimensioni del cibo da utilizzare durante l'intera durata dell'esperimento.
Noi crediamo che questo protocollo è ampiamente applicabile per lo screening ecotossicologici. N. furzeri sta rapidamente diventando una specie di prova standard in ecotossicologia. La disponibilità di questo protocollo standard potrebbe alimentare la sua istituzione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Siamo grati al gruppo sfera dell'UAntwerpen e il dipartimento di protezione delle colture del Ugent per analisi di campioni di acqua. Supporto durante questo progetto è stato fornito dal centro di eccellenza ' Eco e dinamiche socio-evolutive (PF/10/007) del KU Leuven Research Fund. AFG (11Q0516N) ed ESJT (FWO-SB151323) sono stati finanziati come dottorato e TP (12F0716N) come borsista post-doc di Flanders FWO (Fonds Wetenschappelijk Onderzoek).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| purified water Type 1 (milli Q) | Millipore | ||
| Sea Salt | Instant Ocean | ||
| 2L plastic tank | SAVIC | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 1L plastic tank (spawning) | Avamoplast | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| nets | Aqua bilzen | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 2L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 0,5L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| Artemia eggs | Ocean Nutrition | ||
| chironomus | Ocean Nutrition | frozen | |
| tricaine | Sigma aldrich | ||
| petri dishes | VWR | ||
| Parafilm | VWR | ||
| pipettes | MLS | ||
| tweezers | FST | ||
| 500 µm mesh sieve | / | self-made | |
| microcentrifuge tube (2ml) | BRAND | To store fish in freezer | |
| glass vials | Sigma aldrich | For water analysis | |
| weighing boat | MLS | ||
| Jiffy 7c pellets | Jiffy | ||
| water bath | Gilac | for Ctmax | |
| liquid nitrogen | Air liquide | ||
| digital thermometer | Testo AG | testo 926 | |
| HETO therm heater | Anker Schmitt | ||
| calibrated balance | Mettler-Toledo AG | ||
| camera | / | ||
| platform for camera | / | self-made | |
| Multiparameter kit | HACH | ||
| Freezer (-80°C) | Panasonic Ultra low temperature freezer | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fysio | |||
| homogenisation buffer | VWR | 0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100 | |
| chloroform:methanol | Sigma Aldrich | ||
| glyceryl tripalmitate | Sigma Aldrich | ||
| amyloglucosidase | Sigma Aldrich | A7420 | |
| glucose assay reagent | Sigma Aldrich | G3293 | |
| Biorad protein dye | VWR | ||
| 96-well microtiter plate | Greiner Bio-one | ||
| 384 microtiter plates | Greiner Bio-one | ||
| 2 ml glass tubes | Fiers | For fat analysis | |
| 2,5ml eppendorf tubes | VWR | ||
| homogeniser | Ultra-turrax TP 18/10 | ||
| photospectrometer | Infinite M200 TECAN | ||
| heater for glass tubes | Hach COD REACTOR | ||
| centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5415 R | ||
| Incubator | Bumako |
References
- European-Chemicals-Bureau. TAPIR Three point three-A Project for the Information Requirements of REACH. Final Report-2 August 2005. Scoping study on the development of a Technical Guidance Document on information requirements on intrinsic properties of substances (RIP 3.3-1). , (2005).
- Philippe, C., et al. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , 26-35 (2017).
- Noyes, P. D., Lema, S. C. Forecasting the impacts of chemical pollution and climate change interactions on the health of wildlife. Current Zoology. 61 (4), 669-689 (2015).
- Consommateurs, S. S. d Health & Consumer Protection Directorate-General European Commission. 4, Brussels (BE). SANCO/3268/2001 rev. 4 (final) (2002).
- Commission, E. E. Guidance document on aquatic ecotoxicology. Under Council directive 91/414/EEC. SANCO/3268/2001 Rev 4. 2002b. , (2002).
- EPA. Ecological Effects Test Guidelines, OPPTS 850.1500 Fish life cycle toxicity. , Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-07/documents/850-1500.pdf (1996).
- Philippe, C. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , (2017).
- Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future. Aquatic Toxicology. 78 (1), 91-102 (2006).
- Polačik, M., Blažek, R., Reichard, M. Laboratory breeding of the short-lived annual killifish Nothobranchius furzeri. Nature Protocols. 11 (8), 1396-1413 (2016).
- Reichwald, K., et al. Insights into Sex Chromosome Evolution and Aging from the Genome of a Short-Lived Fish. Cell. 163 (6), 1527-1538 (2015).
- Valenzano, D. R., et al. The African Turquoise Killifish Genome Provides Insights into Evolution and Genetic Architecture of Lifespan. Cell. 163 (6), 1539-1554 (2015).
- Shedd, T. R., Widder, M. W., Toussaint, M. W., Sunkel, M. C., Hull, E. Evaluation of the annual killifish Nothobranchius guentheri as a tool for rapid acute toxicity screening. Environ. Toxicol. Chem. 18 (10), 2258-2261 (1999).
- Platzer, M., Englert, C. Nothobranchius furzeri: a model for aging research and more. Trends Genet. 32 (9), 543-552 (2016).
- Watters, B. The ecology and distribution of Nothobranchius fishes. J Am Killifish Assoc. 42, 58-61 (2009).
- Op de Beeck, L., Verheyen, J., Stoks, R. Competition magnifies the impact of a pesticide in a warming world by reducing heat tolerance and increasing autotomy. Environ Pollut. 233, 226-234 (2018).
- Patra, R. W., Chapman, J. C., Lim, R. P., Gehrke, P. C. The effects of three organic chemicals on the upper thermal tolerances of four freshwater fishes. Environ. Toxicol. Chem. 26 (7), 1454-1459 (2007).
- Beitinger, T. L., Bennett, W. A., McCauley, R. W. Temperature tolerances of North American freshwater fishes exposed to dynamic changes in temperature. Environ Biol Fishes. 58 (3), 237-275 (2000).
- Cellerino, A., Valenzano, D. R., Reichard, M. From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology. Biological Reviews. , (2015).
