Summary
בעבודה זו, אנו מתארים של bioassay אקוטית, כרונית, multigenerational ללמוד את ההשפעות של לחצים יחיד ומשולבים על דגים גמבוזיים טורקיז Nothobranchius furzeri. פרוטוקול זה תוכנן כדי ללמוד היסטוריה-החיים תכונות (התמותה, צמיחה, פוריות, משקל) ומקסימום תרמי קריטי.
Abstract
דגים גמבוזיים Nothobranchius furzeri אורגניזם מודל המתעוררים בתחום ecotoxicology, כבר הוכיחה את תחולתן בבדיקות ecotoxicity אקוטי וכרוני. הכולל, הרגישות של המין על תרכובות רעילים הוא בטווח של, או גבוה יותר, זו של מינים אחרים מודל.
עבודה זו מתארת פרוטוקולים עבור bioassays אקוטית, כרונית, multigenerational של השפעות הלחץ יחיד ומשולבים על furzeri ש. בשל זמן קצר ההבשלה שלה מחזור חיים, דגם חוליות זה מאפשר הלימוד של נקודות קצה כגון ופוריות, זמן ההבשלה בתוך ארבעה חודשים. Transgenerational מחזור חיים מלא חשיפה ניסויים יכול להתבצע בקטנה כמו שמונה חודשים. כיוון מין זה מייצרת ביצים שאינן עמידים לבצורת מורדם במשך שנים, תרבות באתר של המין אין צורך אבל יכול להיות גויסו אנשים בעת הצורך. הפרוטוקולים נועדו למדוד תכונות החיים-היסטוריה (התמותה, צמיחה, פוריות, משקל) ומקסימום תרמי קריטי.
Introduction
רגישות פרופילים של מערך של מינים כדי חשיפה לרעלים שנבחרה אסטרטגית כבר מתואר1 עבור החקיקה האירופית להגיע (רישום, הערכה, אישור, והגבלה של כימיקלים). בדיקות רעילות חריפה או לטווח קצר שימשו בעיקר למטרה זו כפי שהם נותנים אינדיקציה מהירה של הרגישות של זן. אולם, בסביבתם הטבעית, אורגניזמים חשופים במשך תקופות ארוכות הרבה יותר, מלא חיים-מחזורי או אפילו מספר דורות יכול להיות מושפע2. יתר על כן, אורגניזמים בסביבות מזוהמים בדרך כלל נחשפים הלחץ יותר מפעם אחת בכל פעם, אשר עשויים לתקשר אחד עם השני, ייתכן וכתוצאה מכך אפקטים סינרגטי3. לפיכך, בדיקות רעילות ריכוזים בטוח מחושב בהתבסס על הלחץ חריפה, יחיד עשוי לזלזל הסיכונים בפועל שהוטלו על ידי חשיפה לרעלים בסביבות טבעיות. מומלץ, לכן, גם לחקור את ההשפעות כרונית, multigenerational של ריכוזים לא קטלני של חשיפה לרעלים בהקשר לסביבה הרלוונטיים כפי דגלו הנציבות האירופית4,5 ו של USEPA (ארצות 6,הברית הסוכנות להגנת הסביבה)7. במיוחד במחקר חוליות, העלויות מבחינת העבודה, זמן וכסף גבוהים בעת ביצוע מחקרים חשיפה כרונית ו multigenerational בשל תוחלת החיים ארוכות יחסית של חולייתנים לעומת דגם הגעה אורגניזמים. לכן, מומלץ לבחור את המתאים ביותר דגים אורגניזם מודל, בהתאם שאלת המחקר. יתר על כן, מגוון רחב של מינים חוליות צריך להיות זמין כדי לבחון את הכלליות של תגובות על פני מינים כדי שניתן יהיה להתאים את תקנות בהתבסס על המין הרגישים ביותר. לעת עתה, יש צורך לפתח חדש, פרוטוקולים יעיל עם מינים דגם חוליות מאופיין מחזורי החיים קצרים כדי להוריד את העלויות של ביצוע חשיפות כרונית, multigenerational על בעלי חוליות7,8.
דגים גמבוזיים טורקיז Nothobranchius furzeri הוא מודל דג מעניין להשתמש בניסויים כאלה-חשיפה לטווח ארוך בשל התבגרות קצרה זמן מחזור החיים (דור זמן פחות מ- 4 שבועות9). משמעות הדבר היא כי ניתן יהיה ללמוד רלוונטי מבחינה אקולוגית נקודות קצה כגון ופוריות, זמן ההבשלה בתוך מסגרת זמן קצר לעומת דגמים אחרים דגים7. יתר על כן, דגים אלה לייצר ביצים עמידים לבצורת, רדום זה להישאר בר קיימא במשך מספר שנים, כאשר הוא מאוחסן בתנאים סטנדרטיים, ובכך למנוע את הצורך תרבות רציף9. במחקרים ecotoxicological, זה מרמז גם על זה שכפול דגים יכול כל לתכנון באותו הרגע המדויק, וכתוצאה מכך בסנכרון זמן עבור כל בעלי החיים, אפילו בקרב קבוצות של ביצים המיוצר בזמנים שונים. אנו מייעצים באמצעות המעבדה GRZ זן ביצוע ניסויים חשיפה. זן זה מבצע גם תחת תנאי מעבדה, היא homozygous (מלבד כרומוזומי המין) הגנום הוא טוב מאופיין10,11.
במחקרים ecotoxicological, חשוב לבחור את הטווח המתאים של בדיקת ריכוזים. מספר שיטות משלימות יכול לשמש למטרה זו. טווח ריכוז הנומינלי יכול להתבסס על הרגישות של זן קשורים, כגון Nothobranchius guentheri12. לחלופין, הטווח יכול להיות מבוסס על הרגישות של מודלים דגים סטנדרטיים, כגון דג זברה (רזבורה rerio)2 בעלי רגישות דומה ברוב חשיפה לרעלים (פיליפ. et al. (בסקירה)). בשילוב, עם שתי אפשרויות אלה, מגוון מציאת ניסוי צריך להתנהל כדי לבחור טווח הריכוז הנומינלי. בדיקה חריפה, חוקרים צריכות לכוון לטיפולי ריכוז עם 100% תמותה, התמותה ביניים 0% תמותה לאחר 24 שעות של חשיפה toxicant. בדיקה כרונית, מומלץ להפעיל את טווח מציאת ניסוי למשך שבועיים לוודא אם התמותה הזחל בתוך התנאי עם הריכוזים הגבוהים ביותר במבחן לא יעלה על 10% בתקופה זו הפניה.
הפרוטוקול יכול לשמש בסיס לביצוע אקוטי וכרוני מחשיפה מזהמים waterborne על furzeri ש, בחינת ההשפעות האפשריות של לחצים הן ברמת הפרט והן הסלולר. זה יכול לשמש גם לבצע מחקר רב הלחץ כדי להכיל את הרלוונטיות אקולוגית גבוהה יותר, ערבוב חומרים רעילים שונים או לימוד אינטראקטיבי תופעות בין זיהום אחרים לחצים טבעיים (למשל טריפה) או אנתרופוגניים לחצים (למשל ההתחממות עקב שינוי האקלים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה האתית של KULeuven.
1. הבקיעה ותחזוקה כללית של furzeri (ש ע)
- להכין דג בינוני (pH 7) בטמפרטורה של 14 מעלות ולהוסיף מים מורתחים מסוג II, עם מלחי סטנדרטית נוספת, מוליכות של 600 µS/ס מ (24 ° C).
- בחר ביצים מן הקו מעבדה GRZ (חוזרים-Rhe-ג'ואו) המאוחסנים תחת תנאים סטנדרטיים13. בחר ביצים בשלב תרטר (כלומר מוכן לבקיעה), לזיהוי על ידי הנוכחות של העיניים הזהב9 ובעדינות להעביר אותם עם זוג מלקחיים רכה מיכל פלסטיק 2 ל' (לא יותר מ 30 ביצים לכל טנק).
הערה: על מנת לקבל מספר מספיק של אורגניזמים מבחן בריא, בוקעות הביצים כפליים ככל שמספר דגים נדרש הזחלים. - להוסיף 1 ס מ של המדיום דגים ב 12 ° C ולתת את טמפרטורת המים בהדרגה מתכנסת בטמפרטורת החדר (24 ° C)9. דגים יבקעו בתוך ה 12 הראשון.
- לאחר 24 שעות, להאכיל הוולדות מנה מרוכזת של טרי המקווקו Artemianauplii (עבור פרטים נוספים על תדירות וכמות המזון, עיין פרוטוקול גידול Polačik. ואח 20169) להגדיל את עומק המים כדי 5 ס מ על ידי הוספת המדיום דגים.
- לאחר 36 ה', להאכיל את הצאצאים עוד מנה מרוכזת של טרי המקווקו Artemia הדברים , להוסיף דג בינוני כדי להגדיל את עומק המים 10 ס מ.
- דגירה מיכלי דגים בתנאי טמפרטורה קבועה (למשל חממה, אקלים חדר או אמבט מים מחומם) תחת ה 14 h:10 בהירה: כהה המשטר.
- לפני תחילת הניסוי, מיכלי דגים מורכבים (ללא דגים) עם החשיפה מורכבים על-ידי מילוים הריכוז הגבוה ביותר של חשיפה בינונית ולהשאיר אותו בן לילה על מנת להגביל את ההעברה של חשיפה לרעלים לגורם ב בפועל הניסוי.
- 48 שעות לאחר הבקיעה, בחר הזחלים קליל בריא כדי להתחיל את הניסוי חשיפה. למחוק את הבטן-המחוונים כביכול הצליחו למלא שלפוחית אוויר שלהם ועל כן ציפה לקוי (ללא הרף לשקוע לתחתית).
2. פרוטוקול חשיפה לטווח קצר
הערה: חוקרים צריך לשאוף לפחות 20 משכפל (20 דגים בצנצנות נפרדות) לכל טיפול. בנוסף טיפול שליטה מלאה, פקד הממס צריך להיות כלול אם הפתרון מניות של המתחם מוכנה תוך שימוש של הממס. הפקד ממס צריכה להכיל את כמות הממס שווה את הריכוז ממס ב הריכוז הגבוה ביותר של חשיפה.
- הכן את מכולות ניסיוני (צנצנות זכוכית חצי ליטר) על ידי תיוג אותם וממלאים אותם עם המדיום המתאים חשיפה (ריכוזים שונים toxicant). הוסף את המתחם כדי להשיג את הריכוז הנכון.
- העברת זחלים (48 שעות לאחר הבקיעה) בנפרד המכולות (1 דגים לכל מיכל לניטור בודדים).
הערה: הדגים חשופים בנפרד כדי למזער את ההשפעות האפשריות מבלבלים של אינטראקציה חברתית כגון תחרות על מזון ואגרסיביות. עם זאת, דגים מותר לקיים אינטראקציה באופן חזותי בהתאם לסטנדרטים אתיים לשימוש חיות מעבדה. - מעקב חשיפה אקוטית זו עבור משך זמן של עד שבועיים. במהלך זמן זה, להאכיל את הדגים ad libitum עם הדברים Artemia פעמיים ביום, 7 ימים בשבוע.
- רענן את המדיום בכל יום כדי לשמור על איכות המים, כדי למזער את ההשפעות האפשריות של תרכובת השפלה. לפקח על מים מפתח משתנים (רמות החמצן המומס יעלה 80%, מוליכות צריך טווח בין µS 600, 700/cm, pH בין 7.8 8.2, ואת קשיות (כמו קאקו3) בין 350 ל- 450 מ ג/ליטר, אשר נמצא בטווח של תנאי גידול אופטימאליים (ש ע) furzeri 9). לקחת דגימות מים לפני ואחרי רענון של המדיום כדי לקבוע ריכוז מתחם בפועל.
- נקודות קצה
- בדוק דגים לתמותה, מתח (למשל התנהגות חריגה: שחייה במהופך) או מחלה ביום (בוקר, ערב). להתייעץ עם פרסום Shedd. et al. (1999) 12 לפרטים על התצפית של התמותה, מתח או מחלה.
- לחשב LC50 ערכים בהתבסס על התמותה באמצעות עקומות מנה-תגובה (Ritz ו Streibig, 2005) בנקודות זמן שונות. השתמש בפונקציה drm בחבילה הרפובליקה הדמוקרטית של קונגו ב- v3.2.3 R (R פיתוח צוות הליבה, 2016) או גישות סטטיסטיות דומה.
3. חשיפה כרונית פרוטוקול
הערה: לכוון מינימום של 25 דגים/תנאי מיד עם תחילת הניסוי, כדי למזער את הסיכוי מוטה-יחס, כדי להכיל פוטנציאל רקע התמותה עקב נסיבות טבעיות (כלומר. התמותה הקשורות לגיל).
- אינקובטור (ראה סעיף 1)
- שלב I (2 ימים לאחר הבקיעה-16 ימים לאחר הבקיעה)
- לעקוב אחר הפרוטוקול כפי שמתואר 2.1 2.4
- במהלך השלב השני של הניסוי, המדיום תגרע בכל ימות השבוע (ללא כיבוד, ראה להלן). לאחסן את הכמות הנדרשת של בינוני במשך שבוע במכולות אינרטי גדולות על מנת לאפשר השפלה דומה של המתחם.
- Phase II (16 ימים לאחר הבקיעה-סוף)
- להכין 2 ל' זכוכית ניסיוני צנצנות מאת complexing אותם עם המתחם. למלא את הצנצנות עם המדיום חשיפה נכונה ולהוסיף על צינורית אוויר לאוורר את הצנצנת. דג הבית בנפרד בתוך הצנצנות הללו לאורך כל הניסוי. לאפשר אינטראקציה חזותי להכיל סטנדרטים אתיים.
- רענן המדיום פעם בשבוע. להעביר את הדג עם רשת צנצנת חדשה המכילה המדיום חשיפה זהה. לקחת דגימות מים כל יום במשך שבוע כדי לפקח על ההשפלה של המתחם בטיפול בכל ריכוז. לחשב עקומת השפלה עבור כל טיפול, אם מספר לחצים שנבדקו (למשל רעילות של תרכובת תחת משטרים טמפרטורה שונות). למדוד פרמטרים והאביוטיים (pH, טמפרטורה, חמצן % מומס, מוליכות) שלוש פעמים בשבוע.
- מ- 2 ימים לאחר הבקיעה (dph) עד 23 dph, להאכיל את הדגים פעמיים ביום, 7 ימים לכל הדברים Artemia ad libitum בשבוע. מ- dph 24 - 37 dph, משלימים את הדיאטה ad libitumArtemia עם הזחלים ימשוש קצוצים. מ dph 38 על, להאכיל את הדגים פעמיים ביום, 7 ימים לכל שבוע ad libitum קפוא ימשוש הזחלים.
- נקודות קצה
- מדי יום בדוק דגים התמותה, מתח או מחלה12.
- כדי לקבוע את הצמיחה, למדוד את גודל גוף על בסיס שבועי (dph 9 - 16 dph - 21 dph -...) על ידי העברת הדגים צלחת פטרי מלא בינוני מן המאגר שלהם. לקחת 4-5 תמונות בגודל מכוילים של הדג מלמעלה (בגובה קבוע) ולנתח אותם דיגיטלית באמצעות תוכנית מדידה המרחבי (למשל ImageJ).
הערה: דגים למבוגרים, השתמש צלחת פטרי גבוה יותר כדי למזער את הלחץ של הטיפול על ידי שמירה על כל הדגים מתחת למים במשך כל מדידה תהליך. - עבור זכר ההבשלה, לבדוק חזותית דגים מדי יום בשביל הגיוון של 15 dph ואילך. בדוק את הסנפירים סימנים הראשון של נישואין הגיוון (מאפיין מינית משנית). השתמש ביום הראשון שבו ניתן לראות זאת כמייצג זמן ההבשלה זכר.
- זוג שאינו למינים דגים עם זכרים של קבוצת טיפול זהה או זכרים שאינם ניסיוני שלוש פעמים בשבוע מ- 30 dph ואילך על מנת לקבוע את זמן ההבשלה הנשי (יום להפקיד את הביצה הראשונה). לשם כך, השתמש בפרוטוקול ההשרצה המתוארים ' ר 3.4.5.
- על פריון, כמה בוגרת נקבות עם זכרים בוגרים 3 פעמים / שבוע 30 dph ואילך, בתוך הטיפולים שלהם באמצעות ערכת המעבר.
- הכינו טנק ההשרצה (1 ליטר) עבור כל זוג, באמצעות חשיפה בינונית מהאקווריום של זכר בתוספת ההשרצה המצע (משובח חול < מיקרומטר 500).
- להעביר גם זכר וגם נקבה לתוך הטנק ההשרצה ולאפשר להם להוליד במשך שעתיים. מזער את פעילות אנושית או הפרעה סביב המכולות ההשרצה בתהליך זה.
- לאחר מכן, בעדינות העבר דגים בחזרה מכולות דיור המקורי שלהם, ללא ערבוב מיותר של המים, אשר להסתחרר את הביצים המצע ההשרצה.
- לסנן את הביצים על ידי מזיגת המצע ההשרצה מעל רשת מיקרומטר 500. לספור את הביצים ולהעביר אותם (באמצעות פינצטה רך) כדי כבול לח פטרי9,14.
- הסר את הביצים מתים מדי יום. לאחר שבוע, החותם פטרי צלחת עם איטום הסרט ואחסן אותו טמפרטורה מבוקרת חממה ב 28 ° C ו- 14:10 מחזור אור h: אפל לפיתוח מיידי לשלב תרטר (דהיינו מוכנים בוקעות לאחר כשלושה שבועות). לאחסון לטווח ארוך, לאחסן את הביצים ב 17 ° C בחשכה קבועה שעליה ביצים להיכנס לשלב רדום והוא מורדם במשך שנים מרובות. כאשר דגים גיוס מביצים רדום אלה לניסויים, להעביר את הביצים רדום לתנאים 28 ° C עם 14:10 h בהירה: כהה מחזור כשלושה שבועות לאפשר פיתוח לשלב תרטר.
- למדוד המרבי תרמי קריטי (CTmax) (מדד ביצועים15) של דגים למבוגרים.
- השתמש לאמבט מים מחומם בקצב קבוע של 0.33 ° C/min, שבו המים מופץ באופן רציף. הוסף מספר 1 ליטר aquaria עבור כל דג בודדים.
הערה: לאור אילוצי מקום באמבט מים, זה הכרחי לעבוד במספר סדרות. פוטנציאל הבדלי התנאים בין סדרת צריך להילקח בחשבון בעת ביצוע ניתוח סטטיסטי על-ידי הכללת 'סדרה' כגורם אקראי. - להתחיל את המשפט על-ידי הוספת הדגים לאקווריום כאשר המים באקווריום הגיעה הטמפרטורה rearing ניסיוני של הדג (בדרך כלל C ° 28). לפקח על הטמפרטורה של 1 ליטר באקווריום של האמבטיה CTmax כל 5-מין באמצעות מדחום דיגיטלי (סולם 0.1 º C).
- סיום המשפט כאשר הדג מצליח לשמור על עמדה זקופה dorso-ventrally או מתחיל להתעוות בכבדות16,17. למדוד את הטמפרטורה באקווריום 1 ליטר, אשר הטמפרטורה המקסימלית קריטי. העברת הדגים חזרה לדיור ניסיוני עבור שחזור.
- השתמש לאמבט מים מחומם בקצב קבוע של 0.33 ° C/min, שבו המים מופץ באופן רציף. הוסף מספר 1 ליטר aquaria עבור כל דג בודדים.
- למדוד את המשקל (דיוק 0.1 מ"ג) של הדגים ביום האחרון של הניסוי על ידי מלטף אותו יבש והעברתו על סירה במשקל. הערה: כל הדגים יש למדוד 4 שעות לאחר ההזנה האחרון לתקנן מזון במשקל של המעיים.
- המתת חסד הדג באמצעות 0.1% Tricaine.
4. Transgenerational חשיפה פרוטוקול
הערה: כדי למדוד את ההשפעות transgenerational של מזהמים על furzeri ש, לעקוב אחר הפרוטוקול חשיפה כרונית שפורטו לעיל עבור הדור הראשון.
- פעמיים בשבוע, לבדוק את התפתחות הביצים המיוצר (כלומר הדור השני) המאוחסנים ב 28 ° C 14:10 בהירה h: כהה תנאים מחזור על-ידי בדיקה של צלחות פטרי עבור עוברי בשלב תרטר (ראה Polačik. et al. 20169). כאשר יותר מ-50 ושכפול של כל טיפול הורים מפותחים לחלוטין, הטץ אותם בעקבות פרוטוקול 1.1
- לחשוף דגים בריאים, קליל בדיוק את אותה הגדרת והטיפול כמו הדגים הורים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאות של חשיפת חריפה furzeri ש ל ריכוזים שונים של נחושת, מחושב כמו 2.5.2, להציג קשרי גומלין cleardose-תגובה (איור 1). יש עלייה בתמותה עם הגדלת ריכוז toxicant. LC50 ערכים ירידה לאורך זמן, כלומר כי עם הפחתת ריכוזים, ככל שחולף הזמן לפני 50% של המבלט משכפל. עבור תוצאות מפורטות על חשיפת אקוטי וכרוני ש furzeri נחושת, כמו גם ההשוואה של המינים רגישות לעומת זנים אחרים, אנו מתייחסים פיליפ. ואח 20177.
חשיפה כרונית הניסיון לגודל הגוף ואת פוריות הם נקודות הקצה רגיש. יכול להיות וריאציה נרחבת של הגידול של הדגים, תלוי בטמפרטורת18. גדלים למבוגרים בין 30 ל 50 מ מ נחשב נורמלי זה. הסידור אפשר למצוא הבדלים בין הטיפולים (איור 2 א). ב assay חשיפה כרונית באמצעות נחושת ג'אנמאסטאמי, היה אפקט משמעותי של חשיפה נחושת במהלך השבוע השלישי (χ²5,34 = 40.7, P < 0.001), עם furzeri (ש ע) חשופים µg 19.38/Cu להיות קטן יותר מאשר כל דגים אחרים ( כל P L < 0.001) (איור 2B). על פריון, ערכי בקרה צריך משתנים בין בסביבות חמישים ביצים לשבוע לכל נקבה בשיא של ייצור ביצים7. בניסוי נוסף, באמצעות עלייה בטמפרטורה 2 ° C, כלורפיריפוס waterborne מצאנו של אינטראקציה משמעותית בין עליית הטמפרטורה וחשיפת הוטלו על פוריות (χ22,202 25.3, P = < 0.001). ב 28 ° C, הדגים חשופים µg 4/L המיוצר פחות ביצים לעומת דג חשופים 2 דגים µg/L ושליטה (שניהם P < 0.001) (איור 2B). ב 30 מעלות צלזיוס, שליטה דגים המופק ביצים יותר לעומת כל הדגים כלורפיריפוס חשופים (שניהם P < 0.007). שניהם ההשפעה העיקרית של חשיפה כלורפיריפוס (χ22,202 96.8, P = < 0.001) ואת ההשפעה העיקרית של טמפרטורה (χ21,202 = 10.18, P < 0.001) באופן משמעותי מופחתת פוריות. המדידה היא די זמן רב בגלל הטיפול של הדג, את ציפוי של ביצי כבול9, אך לעיתים זה נקודת הקצה רגיש ביותר.
זמן ההבשלה מושפע בדרך כלל המזהמים אצל זכרים. זמן ההבשלה זכר הושפעה באופן משמעותי על ידי חשיפה כרונית כלורפיריפוס waterborne (χ22,41 = 11.79, P = 0.003), עם זכרים נחשפים 4 µg/L CPF (C2) לאחר ההבשלה איטית יותר של 18% לעומת שליטה זכרים (איור 3A ). תגובה זו צריך, עם זאת, לפרש בזהירות מאז זמן ההבשלה הוא הבקיע בעקיפין על-ידי קביעת תחילתה של הגיוון נישואין כמייצג. למרות זכרים נחשבים להבשיל כמה ימים לאחר הופעת הגיוון9, ייתכן שיש תקלה על העיתוי המדויק של התבגרות באמצעות אמצעי זה.
ליד מרבי תרמי, דגים התערוכה שחייה בלתי יציבה, תנועה opercular מוגבר של אובדן היכולת נשארים במצב זקוף dorso-ventrally 16,17. CTmax ערכים שונים בין זנים furzeri ש . אוכלוסיות טבעי יש ערכים CTmax בין 39 ° C ו- 42 ° C כאשר גדלו בטמפרטורות בין 24 ל- 28 מעלות C (איור 3B). המתח GRZ המפגרים, עם זאת, כבר מגיע לערכה המירבי תרמי ב בסביבות 37-38 מעלות צלזיוס, גם כאשר גדלו ב 28 º C. ואילו ההליך זה לא קטלני, בשביל הדגים עלולות להתרחש במקרים נדירים של תמותה. דג כזה מודרים בצורה הטובה ביותר מניתוח CTmax, כפי שהם מייצגים קרוב לוודאי דג כי הם יחסית במצב הכללי.
תוצאות קודמות בעיקר הראה כי CTmax יכול להיות מושפע מזהמים, במקרה זה, 3,4-DCA (χ22,71= 17.65, P < 0.001) עם דגים נחשפים 3,4 0.1 mg/L-נתקל 0.32 ° C נמוך יותר תרמי מקסימום לעומת שליטה דגים DCA (P < 0.001). כמו כן, הושפע CTmax הטמפרטורה rearing (χ21,71= 322.0, P < 0.001) והיה דגים שמשקל ב 28 ° C 1.3 ° C CTmax גבוהה יותר בהשוואה דגים זה שמשקל ב 24 ° C.
איור 1: עקומת מנה-תגובה לחשיפה נחושת. מנה-תגובה ' עקומות ' בסה כ מציג התמותה מצטבר של Nothobranchius furzeri תפקודה של ריכוז נחושת חשיפה (ב- µg/L Cu ו ביחס לזמן חשיפה). נקודות מציינות LC50 ערכים. דמות זו שונתה פיליפ. ואח 20172. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: השפעות על הגודל של פוריות כמו נקודות הקצה. A) גודל (ס מ) של Nothobranchius furzeri נחשפים ריכוזים שונים של נחושת בשבוע 3, 7, 11 ו- 15. הכוכבית מציינת C5 דגים קטנים לאחר שלושה שבועות ברמת המובהקות של P < 0.05. הערכים מוצגים אומר ± ב- SEM לדוגמה גדלים הם n = 6; 6; 7; 7; 7; 7 בתוך שבוע 3, n = 6; 6; 7; 7; 4 בתוך שבוע 7, n = 5; 4; 5; 5; 3 בשבוע 11 ו- n = 5; 3; 3; 5; 2 בשבוע 15. B) פוריות לאורך הזמן של דגים נחשפים ריכוזים שונים של כלורפיריפוס, חצה עם שני טיפולי טמפרטורה, הנמדדת מספר ביצים בשבוע. כדי לשפר את הקריאות שלו ואת interpretability של הדמות, קווי שגיאה אינן מוצגות על הגרפים. מספר נקבות כל טיפול ההתחלה ואת הסוף של הביצה הנחת תקופה מצוינת שימוש באות ' n '. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: השפעות על CTmax וזמן ההבשלה. A) גיל (בימים) בו סימנים ראשונים של הגיוון הופיע אצל זכרים של Nothobranchius furzeri חשוף ריכוזים שונים כלורפיריפוס (0 µg/L (C0), 2 µg/L (C1) ו- µg 4/ע. מ. (C2) L) הטמפרטורות (28 ° C ו- 30 מעלות צלזיוס) ממוצע. B) רשע קריטי תרמי לכל היותר (CTmax) דגים נחשפים ריכוזים שונים של 3,4-DCA (0 mg/L 3,4-DCA (C0) 0.05 mg/L 3,4-DCA (C1), 0.1 mg/L 3,4-DCA (C2)) וטמפרטורות 2 (24 ° C ו- 28 מעלות צלזיוס). ריכוזי הנומינלי מוצגים כמו הערך הממוצע ± SE. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עבודה זו מתאר של bioassay חדש באמצעות Nothobranchius furzeri, אורגניזם מודל המתעוררים, ללמוד הפרט, בשילוב השפעות ארוכות טווח של חשיפה לרעלים, לחצים אחרים. הפרוטוקולים הציג הוחלו בהצלחה כדי למדוד את הרגישות של מינים מערך של חשיפה לרעלים (נחושת, קדמיום, 3,4-dichloroaniline ו כלורפיריפוס). בשל מהירות מחזור החיים שלה-, דגם חוליות זה מאפשר הערכה של לא קטלני, transgenerational אפקטים תוך ארבעה חודשים. יתרון מרכזי נוסף של השימוש הזה מיני דגים כמודל להקרנה רעילות היא העובדה שהיא מייצרת ביצים עמידים לבצורת. זה מאפשר לחוקרים לאחסן ביצים או להשיג אותם מן הספק, מבטלת את הצורך תרבות באתר יקר ומבזבז זמן. יתר על כן, ניתן לאחסן את העוברים במשך מספר שנים עד הוולדות הדרושים12.
לאחר שלמד את הרגישות של furzeri (ש ע) מספר הפניה חשיפה לרעלים, אפשר להוסיף כי הרגישות של המין האנושי היא בטווח עם, או גבוה יותר, של האחר דגם מינים, בהתאם למתחם שנבדקו. מדידת ההשפעות על פריון, בפרט, יכולים להגביר את comparability של הרגישות על מינים למדה, כפי שהוא נקודת קצה של נמדד באופן שגרתי בחיות מודל אחרות. בסופו של דבר, במידה שבה מספר לחצים להפעיל תופעות לוואי, כאשר מנוהל בנפרד או בשילוב, היא תלויה הקצה הערכה וריכוז חשיפה.
יש עדיין כמה מגבלות בעת עבודה עם furzeri (ש ע). אחת המגבלות החשוב ביותר הוא סטנדרטיזציה של מזון. קבוצות של ציסטות Artemia או bloodworms יכולים להיות שונים באיכות, בתור שכזה, יכול, להשפיע על התוצאות של המחקר. לכן רצוי להזמין מנה גדולה של אוכל להשתמש במהלך לכל אורך הניסוי.
אנו מאמינים כי פרוטוקול זה הוא החלים נרחב להקרנה ecotoxicological. (ש ע) furzeri מתפתחת במהירות לתוך מין מבחן סטנדרטי ב- ecotoxicology. הזמינות של פרוטוקול סטנדרטי זה ייתכן דלק הקמתה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנחנו אסירי תודה על קבוצת כדור UAntwerpen ומחלקת של הגנת הצומח של Ugent לניתוח של דגימות מים תמיכה במהלך פרויקט זה סופק על ידי המרכז למצוינות ' לסביבה, דינמיקה חברתית-אבולוציונית (PF 10 007) של קרן המחקר ליובן KU. אתי כהן (11Q0516N), ESJT (FWO-SB151323) היו במימון כמו דוקטורט, TP (12F0716N) כמו פוסט-דוקטורנט מאת פלנדרס FWO (Fonds Wetenschappelijk Onderzoek).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| purified water Type 1 (milli Q) | Millipore | ||
| Sea Salt | Instant Ocean | ||
| 2L plastic tank | SAVIC | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 1L plastic tank (spawning) | Avamoplast | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| nets | Aqua bilzen | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 2L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 0,5L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| Artemia eggs | Ocean Nutrition | ||
| chironomus | Ocean Nutrition | frozen | |
| tricaine | Sigma aldrich | ||
| petri dishes | VWR | ||
| Parafilm | VWR | ||
| pipettes | MLS | ||
| tweezers | FST | ||
| 500 µm mesh sieve | / | self-made | |
| microcentrifuge tube (2ml) | BRAND | To store fish in freezer | |
| glass vials | Sigma aldrich | For water analysis | |
| weighing boat | MLS | ||
| Jiffy 7c pellets | Jiffy | ||
| water bath | Gilac | for Ctmax | |
| liquid nitrogen | Air liquide | ||
| digital thermometer | Testo AG | testo 926 | |
| HETO therm heater | Anker Schmitt | ||
| calibrated balance | Mettler-Toledo AG | ||
| camera | / | ||
| platform for camera | / | self-made | |
| Multiparameter kit | HACH | ||
| Freezer (-80°C) | Panasonic Ultra low temperature freezer | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fysio | |||
| homogenisation buffer | VWR | 0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100 | |
| chloroform:methanol | Sigma Aldrich | ||
| glyceryl tripalmitate | Sigma Aldrich | ||
| amyloglucosidase | Sigma Aldrich | A7420 | |
| glucose assay reagent | Sigma Aldrich | G3293 | |
| Biorad protein dye | VWR | ||
| 96-well microtiter plate | Greiner Bio-one | ||
| 384 microtiter plates | Greiner Bio-one | ||
| 2 ml glass tubes | Fiers | For fat analysis | |
| 2,5ml eppendorf tubes | VWR | ||
| homogeniser | Ultra-turrax TP 18/10 | ||
| photospectrometer | Infinite M200 TECAN | ||
| heater for glass tubes | Hach COD REACTOR | ||
| centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5415 R | ||
| Incubator | Bumako |
References
- European-Chemicals-Bureau. TAPIR Three point three-A Project for the Information Requirements of REACH. Final Report-2 August 2005. Scoping study on the development of a Technical Guidance Document on information requirements on intrinsic properties of substances (RIP 3.3-1). , (2005).
- Philippe, C., et al. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , 26-35 (2017).
- Noyes, P. D., Lema, S. C. Forecasting the impacts of chemical pollution and climate change interactions on the health of wildlife. Current Zoology. 61 (4), 669-689 (2015).
- Consommateurs, S. S. d Health & Consumer Protection Directorate-General European Commission. 4, Brussels (BE). SANCO/3268/2001 rev. 4 (final) (2002).
- Commission, E. E. Guidance document on aquatic ecotoxicology. Under Council directive 91/414/EEC. SANCO/3268/2001 Rev 4. 2002b. , (2002).
- EPA. Ecological Effects Test Guidelines, OPPTS 850.1500 Fish life cycle toxicity. , Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-07/documents/850-1500.pdf (1996).
- Philippe, C. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , (2017).
- Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future. Aquatic Toxicology. 78 (1), 91-102 (2006).
- Polačik, M., Blažek, R., Reichard, M. Laboratory breeding of the short-lived annual killifish Nothobranchius furzeri. Nature Protocols. 11 (8), 1396-1413 (2016).
- Reichwald, K., et al. Insights into Sex Chromosome Evolution and Aging from the Genome of a Short-Lived Fish. Cell. 163 (6), 1527-1538 (2015).
- Valenzano, D. R., et al. The African Turquoise Killifish Genome Provides Insights into Evolution and Genetic Architecture of Lifespan. Cell. 163 (6), 1539-1554 (2015).
- Shedd, T. R., Widder, M. W., Toussaint, M. W., Sunkel, M. C., Hull, E. Evaluation of the annual killifish Nothobranchius guentheri as a tool for rapid acute toxicity screening. Environ. Toxicol. Chem. 18 (10), 2258-2261 (1999).
- Platzer, M., Englert, C. Nothobranchius furzeri: a model for aging research and more. Trends Genet. 32 (9), 543-552 (2016).
- Watters, B. The ecology and distribution of Nothobranchius fishes. J Am Killifish Assoc. 42, 58-61 (2009).
- Op de Beeck, L., Verheyen, J., Stoks, R. Competition magnifies the impact of a pesticide in a warming world by reducing heat tolerance and increasing autotomy. Environ Pollut. 233, 226-234 (2018).
- Patra, R. W., Chapman, J. C., Lim, R. P., Gehrke, P. C. The effects of three organic chemicals on the upper thermal tolerances of four freshwater fishes. Environ. Toxicol. Chem. 26 (7), 1454-1459 (2007).
- Beitinger, T. L., Bennett, W. A., McCauley, R. W. Temperature tolerances of North American freshwater fishes exposed to dynamic changes in temperature. Environ Biol Fishes. 58 (3), 237-275 (2000).
- Cellerino, A., Valenzano, D. R., Reichard, M. From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology. Biological Reviews. , (2015).
