Summary
इस काम में, हम एक तीव्र, जीर्ण और multigenerational के लिए फ़िरोज़ा killifish Nothobranchius furzeriपर एकल और संयुक्त तनाव के प्रभाव का अध्ययन परख का वर्णन । इस प्रोटोकॉल जीवन का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है इतिहास लक्षण (मृत्यु दर, विकास, fecundity, वजन) और महत्वपूर्ण थर्मल अधिकतम ।
Abstract
killifish Nothobranchius furzeri ecotoxicology के क्षेत्र में एक उभरते मॉडल जीव और तीव्र और जीर्ण ecotoxicity परीक्षण में अपनी प्रयोज्यता का प्रदर्शन किया गया है । कुल मिलाकर, विषाक्त यौगिकों के लिए प्रजातियों की संवेदनशीलता के साथ रेंज में है, या अधिक से अधिक है, कि अन्य मॉडल प्रजातियों की.
यह काम तीव्र, जीर्ण, और multigenerational के एकल और संयुक्त चाले प्रभाव के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है N. furzeriपर । अपनी छोटी परिपक्वता समय और जीवन चक्र के कारण, इस हड्डीवाला मॉडल चार महीने के भीतर परिपक्वता समय और fecundity जैसे समापन के अध्ययन की अनुमति देता है । Transgenerational पूर्ण जीवन चक्र जोखिम परीक्षणों में प्रदर्शन किया जा सकता है के रूप में छोटे रूप में 8 महीने । चूंकि इस प्रजाति के अंडे है कि सूखा प्रतिरोधी रहे है और साल के लिए व्यवहार्य रहने का उत्पादन, पर प्रजातियों की साइट संस्कृति की जरूरत नहीं है, लेकिन व्यक्तियों जब आवश्यक भर्ती किया जा सकता है । प्रोटोकॉल जीवन को मापने के लिए डिज़ाइन कर रहे है इतिहास लक्षण (मृत्यु दर, विकास, fecundity, वजन) और महत्वपूर्ण थर्मल अधिकतम ।
Introduction
सामरिक रूप से चयनित विषालु प्रजातियों की एक सरणी के संवेदनशीलता प्रोफाइल यूरोपीय पहुंच कानून के लिए1 बताया गया है (पंजीकरण, मूल्यांकन, प्राधिकरण, और रसायनों के प्रतिबंध) । तीव्र या अल्पकालिक विषाक्तता परीक्षण ज्यादातर इस प्रयोजन के लिए इस्तेमाल किया गया के रूप में वे एक ' प्रजातियों की संवेदनशीलता का एक त्वरित संकेत दे । हालांकि, उनके प्राकृतिक वातावरण में, जीवों बहुत लंबी अवधि और पूर्ण जीवन चक्र या यहां तक कि कई पीढ़ियों को प्रभावित किया जा सकता है पर उजागर कर रहे हैं2. इसके अलावा, प्रदूषित वातावरण में जीवों को आम तौर पर एक समय में एक से अधिक तनाव के संपर्क में हैं, जो एक दूसरे के साथ बातचीत कर सकते हैं, संभवतः synergistic प्रभाव3में जिसके परिणामस्वरूप । इसलिए, सुरक्षित सांद्रता तीव्र, एकल तनाव विषाक्तता परीक्षणों के आधार पर गणना वास्तविक जोखिम प्राकृतिक वातावरण में विषालु द्वारा लगाया मूल्यवान समझना हो सकता है । इसलिए, यह भी एक पर्यावरण की दृष्टि से प्रासंगिक संदर्भ में विषालु के जीर्ण और multigenerational प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उचित है के रूप में यूरोपीय आयोग ने4,5 और यूएसईपीए (संयुक्त राज्यों पर्यावरण संरक्षण एजेंसी)6,7. विशेष रूप से हड्डीवाला अनुसंधान में, श्रम, धन के मामले में लागत, और समय उच्च रहे है जब invertebrate मॉडल जीवों की तुलना में रीढ़ की अपेक्षाकृत लंबी उंर की वजह से पुरानी और multigenerational जोखिम अध्ययन प्रदर्शन । इसलिए, यह सबसे उपयुक्त मछली मॉडल जीव का चयन करने के लिए सलाह दी जाती है, अनुसंधान के सवाल पर निर्भर करता है । इसके अलावा, हड्डीवाला प्रजातियों की एक विस्तृत सरणी के क्रम में सबसे अधिक संवेदनशील प्रजातियों के आधार पर नियमों को अनुकूल करने में सक्षम होने के लिए प्रजातियों में प्रतिक्रियाओं की सामान्यता का परीक्षण करने के लिए उपलब्ध होना चाहिए । अभी के लिए, हड्डीवाला मॉडल प्रजातियों के साथ नए, कुशल प्रोटोकॉल विकसित करने की जरूरत है, लघु जीवन चक्र द्वारा विशेषता के लिए रीढ़7,8पर जीर्ण और multigenerational जोखिम प्रदर्शन की लागत कम है ।
फ़िरोज़ा killifish Nothobranchius furzeri एक दिलचस्प मछली के लिए अपनी छोटी परिपक्वता समय और जीवन चक्र की वजह से इस तरह के दीर्घकालिक जोखिम प्रयोगों में उपयोग करने के लिए मॉडल है (पीढ़ी कम समय से 4 सप्ताह9) । इसका मतलब यह है कि इस तरह की परिपक्वता समय और fecundity के रूप में पारिस्थितिकी प्रासंगिक समापन अंय मछली मॉडल7की तुलना में एक कम समय सीमा के भीतर अध्ययन किया जा सकता है । इसके अलावा, इन मछली सूखे का उत्पादन-प्रतिरोधी, निष्क्रिय अंडे है कि कई वर्षों के लिए व्यवहार्य रहते है जब मानक शर्तों के तहत संग्रहित है, जिससे एक सतत संस्कृति9की आवश्यकता को नष्ट करने । ecotoxicological अध्ययन में, यह भी संकेत मिलता है कि मछली दोहराने सभी सटीक एक ही पल में रचा जा सकता है, सभी जानवरों के लिए समय synchrony में जिसके परिणामस्वरूप, यहां तक कि विभिंन समय में उत्पादित अंडे के बैचों के बीच । हम जोखिम प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए प्रयोगशाला GRZ तनाव का उपयोग करने की सलाह. यह तनाव प्रयोगशाला शर्तों के तहत अच्छी तरह से करता है, homozygous है (सेक्स गुणसूत्रों को छोड़कर) और जीनोम अच्छी तरह से10,11विशेषता है ।
ecotoxicological अध्ययन में, यह परीक्षण सांद्रता के उपयुक्त सीमा का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है । कई पूरक तरीकों इस अंत करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । नाममात्र एकाग्रता रेंज जैसे Nothobranchius guentheri12के रूप में एक संबंधित प्रजातियों, की संवेदनशीलता पर आधारित हो सकता है । वैकल्पिक रूप से, सीमा मानक मछली मॉडल की संवेदनशीलता पर आधारित हो सकता है, जैसे zebrafish (ढाणियो rerio)2 कि सबसे विषालु (फिलिप एट अल करने के लिए एक तुलनीय संवेदनशीलता है । (समीक्षा में)). संयोजन में, इन विकल्पों में से दोनों के साथ, एक प्रयोग खोज रेंज नाममात्र एकाग्रता रेंज का चयन करने के लिए आयोजित किया जाना चाहिए । तीव्र परीक्षण के लिए, शोधकर्ताओं ने विषाक्तता के लिए जोखिम के 24 ज के बाद १००% मृत्यु दर, मध्यवर्ती मृत्यु दर और 0% मृत्यु दर के साथ एकाग्रता उपचार के लिए लक्ष्य होना चाहिए । जीर्ण परीक्षण के लिए, यह दो सप्ताह के लिए प्रयोग खोज रेंज चलाने के लिए सलाह दी जाती है यदि उच्चतम परीक्षण सांद्रता के साथ हालत में लार्वा मृत्यु इस संदर्भ अवधि के दौरान 10% से अधिक नहीं है ।
प्रोटोकॉल एक आधार रेखा के रूप में सेवा कर सकते है करने के लिए तीव्र और क्रोनिक प्रदर्शन करने के लिए एन furzeriपर जलजनित प्रदूषण, तनाव के संभावित प्रभाव की जांच दोनों व्यक्तिगत और सेलुलर स्तर पर । यह भी बहु तनावपूर्ण अनुसंधान प्रदर्शन के लिए एक उच्च पारिस्थितिक प्रासंगिकता को समायोजित किया जा सकता है, विभिंन विषाक्त यौगिकों मिश्रण या प्रदूषण और अंय प्राकृतिक तनाव के बीच इंटरैक्टिव प्रभाव का अध्ययन (उदा predation) या anthropogenic तनाव (जैसे जलवायु परिवर्तन के कारण वार्मिंग) ।
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Protocol
यहां बताई गई सभी विधियों को KULeuven की नैतिक समिति ने मंजूरी दे दी है ।
1. सेने और एन furzeri के सामांय रखरखाव
- तैयार मछली मध्यम (पीएच 7) 14 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर और जोड़ा मानकीकृत लवण के साथ, शुद्ध प्रकार द्वितीय पानी जोड़ने के लिए, ६०० µS/मुख्यमंत्री (24 डिग्री सेल्सियस) की एक चालकता के लिए ।
- GRZ (गोना-Rhe-झोउ) प्रयोगशाला लाइन है कि मानकीकृत शर्तों के तहत संग्रहित किया गया है से अंडे का चयन करें13। DIII चरण में अंडे का चयन करें (यानी हैच करने के लिए तैयार), गोल्डन आंखें9 की उपस्थिति से पहचानने योग्य है और धीरे से एक प्लास्टिक 2 एल टैंक (कोई टैंक प्रति लगभग 30 अंडे से) को चिमटी की एक नरम जोड़ी के साथ स्थानांतरण ।
नोट: स्वस्थ परीक्षण जीवों की एक पर्याप्त संख्या के लिए आवश्यक मछली लार्वा की संख्या के रूप में दो बार कई अंडे के रूप में हैच करने के लिए । - 12 डिग्री सेल्सियस पर मछली के माध्यम से 1 सेमी जोड़ें और पानी के तापमान धीरे से कमरे के तापमान (24 डिग्री सेल्सियस)9के लिए एकाग्र करने दें । मछली पहले 12 घंटे के भीतर हैच होगा ।
- 24 घंटे के बाद, hatchlings हौसले से रचा Artemianauplii की एक केंद्रित खुराक फ़ीड (आवृत्ति और भोजन की राशि पर और अधिक विस्तार के लिए, Polačik एट अल. २०१६9के प्रजनन प्रोटोकॉल का उल्लेख) और पानी की गहराई को बढ़ाने के द्वारा 5 सेमी मछली माध्यम को जोड़ना ।
- ३६ ज के बाद, hatchlings हौसले से रची Artemia nauplii की एक और केंद्रित खुराक फ़ीड और मछली माध्यम जोड़ने के लिए 10 सेमी पानी की गहराई बढ़ाने के लिए ।
- लगातार तापमान की स्थिति के तहत मछली कंटेनरों की मशीन (एक मशीन, जलवायु कक्ष या गर्म पानी के स्नान मेंउदाहरण के लिए) एक 14 h:10 एच प्रकाश के तहत: डार्क शासन ।
- प्रयोग के शुरू होने से पहले, जटिल मछली कंटेनर (मछली के बिना) जोखिम यौगिक के साथ उंहें जोखिम मध्यम के उच्चतम एकाग्रता के साथ भरने के द्वारा और यह रातोंरात छोड़ने के क्रम में वास्तविक में कंटेनर के लिए विषालु के हस्तांतरण को सीमित करने के लिए प्रयोग.
- ४८ ज, सेने के बाद स्वस्थ बोया लार्वा का चयन करने के लिए जोखिम का प्रयोग शुरू करते हैं । त्यागें तथाकथित पेट-स्लाइडर है कि उनके तैरने मूत्राशय को भरने में असमर्थ थे और फलस्वरूप एक ख़राब उछाल है (लगातार नीचे करने के लिए सिंक) ।
2. अल्पकालिक जोखिम प्रोटोकॉल
नोट: शोधकर्ताओं ने उपचार के प्रति कम से 20 प्रतिकृति (अलग जार में 20 मछली) के लिए लक्ष्य करना चाहिए । एक पूर्ण नियंत्रण उपचार के अलावा, एक विलायक नियंत्रण शामिल किया जाना चाहिए यदि यौगिक के शेयर समाधान एक विलायक का उपयोग कर तैयार है । विलायक नियंत्रण विलायक उच्चतम जोखिम एकाग्रता में विलायक एकाग्रता के बराबर की राशि शामिल होना चाहिए ।
- प्रायोगिक कंटेनरों (०.५ एल ग्लास जार) उंहें लेबल और उंहें उचित जोखिम मध्यम (विभिंन विषैले सांद्रता) के साथ भरने के द्वारा तैयार करते हैं । सही एकाग्रता प्राप्त करने के लिए यौगिक जोड़ें ।
- स्थानांतरण लार्वा (४८ एच के बाद हैच) व्यक्तिगत रूप से कंटेनरों करने के लिए (व्यक्तिगत निगरानी के लिए कंटेनर प्रति 1 मछली) ।
नोट: मछलियों व्यक्तिगत रूप से इस तरह के भोजन और आक्रामकता के लिए प्रतिस्पर्धा के रूप में सामाजिक बातचीत के संभावित पाया प्रभाव को कम करने के लिए उजागर कर रहे हैं । हालांकि, मछली नेत्रहीन प्रयोगशाला पशु उपयोग के लिए नैतिक मानकों के अनुसार बातचीत करने के लिए अनुमति दी जाती है । - अप करने के लिए 2 सप्ताह की अवधि के लिए इस तीव्र जोखिम का पालन करें । उस समय के दौरान, मछली विज्ञापन libitum फ़ीड Artemia nauplii के साथ प्रति दिन दो बार, 7 दिन/
- पानी की गुणवत्ता बनाए रखने और यौगिक क्षरण के संभावित प्रभावों को कम करने के लिए हर दूसरे दिन मध्यम को रिफ्रेश करें । मॉनिटर कुंजी जल चर (भंग ऑक्सीजन का स्तर ८०% से अधिक होना चाहिए, चालकता के बीच सीमा चाहिए ६०० और ७०० µS/सेमी, ७.८ और ८.२ के बीच पीएच, और कठोरता (कएको छैन के रूप में 3) के बीच ३५० और ४५० mg/L, जो इष्टतम पालन शर्तों की सीमा के भीतर निहित है N. furzeri 9) के लिए । वास्तविक यौगिक सांद्रता निर्धारित करने के लिए माध्यम को ताज़ा करने से पहले और बाद में पानी के नमूने लें ।
- अंतिमबिंदु
- मृत्यु दर के लिए मछली की जांच करें, तनाव (जैसे ंयायपालिका व्यवहार: उल्टा तैराकी) या बीमारी दैनिक (सुबह, शाम) । शेड एट अल के प्रकाशन से परामर्श करें । (१९९९) 12 मृत्यु दर, तनाव या बीमारी के अवलोकन पर विवरण के लिए ।
- नियंत्रण रेखा की गणना५० खुराक-प्रतिक्रिया curves (रिट्ज और Streibig, २००५) अलग समय बिंदुओं पर का उपयोग कर मृत्यु के आधार पर मूल्यों । r v 3.2.3 (r विकास कोर टीम, २०१६) या समान सांख्यिकीय दृष्टिकोण में डीआरसी पैकेज में drm फ़ंक्शन का उपयोग करें ।
3. क्रोनिक एक्सपोजर प्रोटोकॉल
नोट: प्रयोग की शुरुआत में कम से कम 25 मछली/शर्त का उद्देश्य, एक विषम लिंग अनुपात की संभावना को कम करने के लिए और प्राकृतिक कारणों (यानीउंर से संबंधित मृत्यु दर) के कारण संभावित पृष्ठभूमि मृत्यु दर को समायोजित करने के लिए ।
- सेने (अनुभाग 1 देखें)
- चरण मैं (2 दिन के बाद सेने-16 दिनों के बाद सेने)
- २.१-२.४ में वर्णित के रूप में प्रोटोकॉल का पालन करें
- के रूप में प्रयोग के दूसरे चरण के दौरान, मध्यम सप्ताह भर में नीचा होगा (कोई जलपान, नीचे देखें) । बड़े निष्क्रिय कंटेनरों में एक सप्ताह के लिए मध्यम की आवश्यक राशि की दुकान में आदेश यौगिक के समान क्षरण की अनुमति के लिए ।
- द्वितीय चरण (16 दिनों के बाद सेने के अंत)
- उन्हें यौगिक के साथ जटिल द्वारा 2 एल प्रयोगात्मक ग्लास जार तैयार करें । सही जोखिम के माध्यम से जार भरें और जार aerate करने के लिए एक एयर ट्यूब जोड़ें । घर मछली व्यक्तिगत रूप से प्रयोग के शेष के लिए इन जार में । दृश्य बातचीत नैतिक मानकों को समायोजित करने की अनुमति दें ।
- मीडियम को प्रति सप्ताह एक बार रिफ्रेश करें । एक नया एक ही जोखिम माध्यम युक्त जार के लिए एक शुद्ध के साथ मछली हस्तांतरण । प्रत्येक एकाग्रता उपचार में यौगिक की गिरावट की निगरानी करने के लिए एक सप्ताह के दौरान हर दिन पानी के नमूने ले लो । एकाधिक तनावों का परीक्षण कर रहे हैं, तो प्रत्येक उपचार के लिए एक क्षरण वक्र की गणना (विभिन्न तापमान सरकारों में एक यौगिक की विषाक्तताउदा ). माप अजैव मापदंडों (पीएच, तापमान,% भंग ऑक्सीजन, चालकता) प्रति सप्ताह तीन बार ।
- 2 दिनों के बाद से सेने (dph) 23 dph तक, प्रति दिन दो बार मछली फ़ीड, 7 दिन प्रति सप्ताह विज्ञापन libitum Artemia nauplii । से 24 dph-३७ dph, कटा Chironomus लार्वा के साथ विज्ञापन libitumArtemia आहार पूरक । ३८ dph से, प्रति दिन दो बार मछली फ़ीड, 7 दिन प्रति सप्ताह विज्ञापन libitum जमे हुए Chironomus लार्वा ।
- अंतिमबिंदु
- दैनिक मृत्यु, तनाव या बीमारी12के लिए मछली की जांच करें ।
- वृद्धि का निर्धारण करने के लिए, एक साप्ताहिक आधार पर शरीर के आकार को मापने (9 dph-16 dph-21 dph-...) एक पेट्री उनके जलाशय से मध्यम से भरा पकवान को स्थानांतरित करके । 4-5 आकार ले ऊपर से मछली के चित्र नपे (एक निश्चित ऊंचाई पर) और उंहें डिजिटल एक स्थानिक मापने कार्यक्रम( उदा ImageJ) का उपयोग कर विश्लेषण ।
नोट: वयस्क मछली के लिए, एक उच्च पेट्री डिश का उपयोग करने के लिए पूरे मापने की प्रक्रिया के दौरान जलमग्न सभी मछली रखने से हैंडलिंग तनाव को कम । - पुरुष परिपक्वता के लिए, नेत्रहीन 15 dph के बाद से रंगाई के लिए दैनिक मछली का निरीक्षण । मंगल रंगाई (माध्यमिक यौन विशेषता) के पहले लक्षण के लिए पंख की जाँच करें । पहले दिन का उपयोग करें जिस पर यह पुरुष परिपक्वता समय के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में दिखाई दे रहा है ।
- एक ही उपचार समूह या गैर प्रयोगात्मक नर के पुरुषों के साथ sexed मछली युगल 30 dph के बाद से तीन बार प्रति सप्ताह में आदेश महिला परिपक्वता समय निर्धारित करने के लिए (दिन पहले अंडा जमा है) । इसके लिए, 3.4.5 में वर्णित अंडे का उपयोग करें ।
- के लिए fecundity, जोड़ा परिपक्व महिलाओं के साथ परिपक्व नर 3 बार/सप्ताह से 30 dph के बाद, उनके उपचार के भीतर एक पार योजना का उपयोग कर ।
- एक अंडे (ठीक रेत < 500 µm) के साथ पूरक पुरुष मछलीघर से जोखिम के माध्यम का उपयोग कर, प्रत्येक जोड़े के लिए एक टैंक (1 एल) तैयार ।
- अंडे के टैंक में दोनों पुरुष और महिला हस्तांतरण और उंहें दो घंटे के लिए अंडे के लिए अनुमति देते हैं । इस प्रक्रिया के दौरान मानव गतिविधि या अंडे के चारों ओर अशांति को कम करें ।
- बाद में, धीरे से अपने मूल आवास कंटेनरों को वापस मछली हस्तांतरण, पानी की अनावश्यक मिश्रण के बिना, जो अंडे में चक्कर सब्सट्रेट होगा ।
- फ़िल्टर अंडे एक ५०० µm मेष पर पैदा सब्सट्रेट डालने से बाहर । अंडे गिनती और उन्हें (नरम चिमटी का उपयोग) पेट्री व्यंजन में पीट काई को नम करने के लिए स्थानांतरण9,14.
- मरे हुए अंडे रोज़ निकालें । एक सप्ताह के बाद, सील फिल्म के साथ पेट्री डिश सील और यह 28 डिग्री सेल्सियस और एक 14:10 एच प्रकाश में एक तापमान नियंत्रित मशीन में स्टोर: DIII चरण के लिए तत्काल विकास के लिए डार्क चक्र (यानी के लिए तैयार लगभग तीन सप्ताह के बाद हैच) । लंबी अवधि के भंडारण के लिए, लगातार अंधेरे में 17 डिग्री सेल्सियस पर अंडे की दुकान है, जिस पर अंडे सुप्त चरण में प्रवेश और कई वर्षों के लिए व्यवहार्य रहते हैं । जब प्रयोगों के लिए इन निष्क्रिय अंडे से मछली की भर्ती, 14:10 एच प्रकाश के साथ 28 डिग्री सेल्सियस स्थितियों के लिए निष्क्रिय अंडे हस्तांतरण: DIII चरण के विकास के लिए अनुमति देने के लिए लगभग तीन सप्ताह के लिए डार्क साइकिल ।
- महत्वपूर्ण थर्मल अधिकतम (CTmax) को मापने (प्रदर्शन के लिए एक उपाय15) वयस्क मछली के ।
- एक जल स्नान है कि ०.३३ ° c/मिनट की एक स्थिर दर पर गर्म है और जिसमें पानी लगातार परिचालित है का उपयोग करें । प्रत्येक व्यक्ति मछली के लिए कई 1 एल aquaria जोड़ें ।
नोट: जल स्नान में स्थान की कमी को देखते हुए, यह कई श्रृंखला में काम करने के लिए आवश्यक है । श्रृंखला के बीच की स्थिति में संभावित मतभेदों को ध्यान में रखा जाना चाहिए जब एक यादृच्छिक कारक के रूप में ' श्रृंखला ' सहित द्वारा सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन । - मछलीघर में मछली जब पानी एक्वैरियम मछली (आम तौर पर 28 डिग्री सेल्सियस) के प्रायोगिक रियर तापमान तक पहुंच गया है जोड़कर परीक्षण शुरू करो । एक डिजिटल थर्मामीटर (०.१ डिग्री सेल्सियस पैमाने) का उपयोग कर हर 5 मिनट CTmax स्नान के 1 एल aquaria में तापमान की निगरानी ।
- जब मछली एक dorso-ventrally ईमानदार स्थिति को बनाए रखने के लिए विफल रहता है या भारी16,17चिकोटी शुरू परीक्षण समाप्त । 1 एल मछलीघर, जो महत्वपूर्ण अधिकतम तापमान है में तापमान को मापने । वसूली के लिए अपने प्रायोगिक आवास के लिए मछली वापस स्थानांतरण ।
- एक जल स्नान है कि ०.३३ ° c/मिनट की एक स्थिर दर पर गर्म है और जिसमें पानी लगातार परिचालित है का उपयोग करें । प्रत्येक व्यक्ति मछली के लिए कई 1 एल aquaria जोड़ें ।
- मापने के वजन (०.१ मिलीग्राम सटीकता) मछली के अंतिम दिन को ठोक द्वारा प्रयोग के पर यह सूखी और यह एक वजनी नाव पर स्थानांतरित । नोट: सभी मछली आंत्र पथ में भोजन के वजन को मानकीकृत करने के लिए पिछले खिलाने के बाद चार घंटे मापा जाना चाहिए ।
- ०.१% Tricaine का उपयोग कर मछली Euthanize ।
4. Transgenerational एक्सपोजर प्रोटोकॉल
नोट: transgenerational पर प्रदूषकों के प्रभाव को मापने के लिए N. furzeri, पहली पीढ़ी के लिए ऊपर उल्लिखित पुरानी एक्सपोज़र प्रोटोकॉल का पालन करें ।
- दो बार साप्ताहिक, उत्पादित अंडे के विकास की जांच (दूसरी पीढ़ी यानी) 28 डिग्री सेल्सियस 14:10h प्रकाश: DIII चरण में भ्रूण के लिए पेट्री व्यंजन का निरीक्षण करके अंधेरे चक्र की स्थिति में संग्रहित (Polačik एट अल देखें । २०१६9). जब से अधिक ५० प्रत्येक माता पिता के इलाज की प्रतिकृति पूरी तरह से विकसित कर रहे हैं, उंहें १.१ में प्रोटोकॉल निंनलिखित हैच ।
- ठीक ही सेट अप और माता पिता की मछली के रूप में उपचार के लिए स्वस्थ, बोया मछली बेनकाब ।
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Representative Results
कॉपर के विभिंन सांद्रता के लिए एन furzeri के तीव्र जोखिम के परिणाम, 2.5.2 में के रूप में गणना की, शो cleardose प्रतिक्रिया रिश्ते (चित्रा 1) । बढ़ती विषाक्तता एकाग्रता के साथ मृत्यु दर में वृद्धि हुई है । नियंत्रण रेखा५० मान समय के साथ कम है, जिसका अर्थ है कि कम सांद्रता के साथ, और अधिक समय गुजरता से पहले ५०% की प्रतिकृति मर जाते हैं । तांबे के लिए एन furzeri के तीव्र और जीर्ण जोखिम पर विस्तृत परिणाम के लिए, साथ ही अंय प्रजातियों की तुलना में ' प्रजातियों की संवेदनशीलता की तुलना, हम फिलिप एट अल. २०१७7को देखें ।
जीर्ण जोखिम परीक्षण में, शरीर का आकार और fecundity संवेदनशील अंतिमबिंदु हैं । वहां मछली के विकास में व्यापक भिंनता है,18तापमान पर निर्भर कर सकते हैं । 30 और ५० mm के बीच वयस्क आकार इस सेट-अप में सामांय माने जाते हैं । सेट अप उपचार (चित्रा 2a) के बीच मतभेदों को खोजने की अनुमति । एक पुरानी जोखिम परख में जलजनित तांबे का उपयोग, तीन सप्ताह के दौरान तांबे के जोखिम का एक महत्वपूर्ण प्रभाव था (χ ²5, 34 = ४०.७, पी < 0.001), के साथ N. furzeri १९.३८ µ g/L घन अन्य सभी मछली से छोटा होने के साथ (सभी p < 0.001) (चित्र b) । fecundity के लिए, नियंत्रण मूल्यों अंडे उत्पादन7के शिखर पर प्रति महिला सप्ताह के आसपास ५० अंडे के बीच में उतार चढ़ाव चाहिए । एक अन्य प्रयोग में, जलजनित chlorpyrifos और एक 2 ° c तापमान वृद्धि का उपयोग करते हुए, हम तापमान वृद्धि और fecundity पर chlorpyrifos एक्सपोजर के बीच एक महत्वपूर्ण बातचीत (χ2२,२०२ = २५.३, पी < 0.001) पाया. 28 डिग्री सेल्सियस से कम, 4 µ g/l को उजागर मछली 2 µ g/l और नियंत्रण मछली (दोनों पी < 0.001) (चित्रा 2 बी) के लिए उजागर मछली की तुलना में कम अंडे का उत्पादन किया । 30 डिग्री सेल्सियस पर, नियंत्रण मछली सभी chlorpyrifos उजागर मछली की तुलना में अधिक अंडे का उत्पादन किया (दोनों पी < 0.007) । chlorpyrifos के लिए एक्सपोज़र का मुख्य प्रभाव (χ2२,२०२ = ९६.८, P < 0.001) और तापमान का मुख्य प्रभाव (χ2१,२०२ = १०.१८, P < 0.001) काफी कम fecundity । माप मछली की हैंडलिंग और पीट पर अंडे की चढ़ाना के कारण काफी समय लगता है9, लेकिन यह अक्सर सबसे संवेदनशील समापन बिंदु है ।
परिपक्वता समय सबसे अधिक बार पुरुषों में प्रदूषकों से प्रभावित है । पुरुष परिपक्वता समय काफी जलजनित chlorpyrifos के लिए पुरानी जोखिम से प्रभावित था (χ22, 41 = ११.७९, पी = ०.००३), 4 µ जी के संपर्क में पुरुषों के साथ/L सीपीएफ (c2) एक 18% धीमी परिपक्वता होने नियंत्रण पुरुषों की तुलना में (चित्र 3 ए ). इस प्रतिक्रिया, तथापि, सावधानी के साथ परिपक्वता समय के बाद से व्याख्या की जानी चाहिए परोक्ष रूप से एक प्रॉक्सी के रूप में मंगल रंगाई की शुरुआत का निर्धारण करके रन बनाए हैं । हालांकि पुरुषों को कुछ दिनों के लिए9रंगाई की उपस्थिति के बाद परिपक्व माना जाता है, वहां परिपक्वता के सटीक समय पर कुछ त्रुटि इस उपाय का उपयोग कर सकते हैं ।
थर्मल अधिकतम के पास, मछली प्रदर्शन अनिश्चित तैराकी, वृद्धि हुई opercular आंदोलन और एक dorso-ventrally ईमानदार स्थिति 16,17में रहने की क्षमता के नुकसान । CTmax मान N. furzeri उपभेदों के बीच भिंन होते हैं । प्राकृतिक आबादी ३९ ° c और ४२ ° c के बीच CTmax मूल्यों है जब 24 और 28 डिग्री सेल्सियस के बीच तापमान में रियर (चित्र बी) । GRZ तनाव, तथापि, पहले से ही लगभग ३७-३८ डिग्री सेल्सियस पर अपने थर्मल अधिकतम पहुंचता है, यहां तक कि जब 28 डिग्री सेल्सियस पर पीछे । जबकि इस प्रक्रिया मछली के लिए घातक नहीं है, मृत्यु के दुर्लभ मामलों होते हैं । ऐसी मछली सबसे अच्छा CTmax विश्लेषण से बाहर रखा जाता है, क्योंकि वे सबसे अधिक संभावना मछली है कि अपेक्षाकृत गरीब समग्र हालत में है प्रतिनिधित्व करते हैं ।
पिछले परिणाम ज्यादातर पता चला है कि CTmax प्रदूषक से प्रभावित किया जा सकता है, इस मामले में, 3, 4-dca (χ22, 71= १७.६५, P < 0.001) ०.१ mg/L 3 के लिए उजागर मछली के साथ, 4-dca एक ०.३२ डिग्री सेल्सियस कम थर्मल अधिकतम मछली नियंत्रण की तुलना में (P < 0.001). इसके अलावा, CTmax पालन तापमान (χ21, 71= ३२२.०, पी < 0.001) और मछली है कि 28 डिग्री सेल्सियस पर पीछे थे द्वारा प्रभावित किया गया था एक १.३ डिग्री सेल्सियस उच्च CTmax मछली है कि 24 डिग्री सेल्सियस पर पीछे थे की तुलना में था ।
चित्रा 1: खुराक-तांबे जोखिम के लिए प्रतिक्रिया वक्र । खुराक-प्रतिक्रिया (µ g/L घन में और जोखिम समय के संबंध में) तांबे जोखिम एकाग्रता के समारोह में Nothobranchius furzeri की संचई मृत्यु दर दिखा रहा है । डॉट्स नियंत्रण रेखा५० मान इंगित करता है । यह आंकड़ा फिलिप एट अल २०१७2से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2: अंतिमबिंदु के रूप में आकार और fecundity पर प्रभाव । एक) आकार (सेमी में) Nothobranchius furzeri 3, 7, 11, और 15 सप्ताह में तांबे के विभिंन सांद्रता को उजागर । तारांकन चिह्न इंगित करता है कि P < 0.05 के माहात्म्य स्तर पर तीन सप्ताह के बाद C5 fish छोटे होते हैं । मान ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । नमूना आकार n = 6 हैं; 6; 7; 7; 7; 7 सप्ताह में 3, n = 6; 6; 7; 7; 4 सप्ताह में 7, n = 5; 4; 5; 5; 3 सप्ताह में 11 और n = 5; 3; 3; 5; 2 सप्ताह में 15 । ख) chlorpyrifos के विभिंन सांद्रता को उजागर मछली के समय के माध्यम से Fecundity, दो तापमान उपचार के साथ पार, प्रति सप्ताह अंडे की संख्या के रूप में मापा । पठनीयता और चित्र की व्याख्याता में सुधार करने के लिए, त्रुटि पट्टियों पर रेखांकन नहीं दिखाए जाते हैं । शुरुआत और अंडे की अवधि बिछाने के अंत में प्रत्येक उपचार में महिलाओं की संख्या पत्र ' n ' का उपयोग कर संकेत दिया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: परिपक्वता समय और CTmax पर प्रभाव । क) मतलब उंर (दिनों में) जो रंगाई का पहला संकेत Nothobranchius furzeri के पुरुषों में दिखाई अलग chlorpyrifos सांद्रता (0 µ g/L (c0) के संपर्क में, 2 µ g/l (c1) और 4 µ g/l सीपीएफ (C2)) और दो तापमान (28 ° c और 30 ° c). 3 के विभिन्न सांद्रता के लिए उजागर मछली की महत्वपूर्ण थर्मल अधिकतम (CTmax) का मतलब है ख) , 4-dca (0 mg/l 3, 4-डीसीए (c0), ०.०५ mg/l 3, 4-dca (C1), और ०.१ mg/l 3, 4-dca (C2)) और दो तापमान (24 ° c और 28 ° c). नाममात्र की सांद्रता मतलब मूल्य ± एसई के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
यह काम एक नया Nothobranchius furzeri, एक उभरते मॉडल जीव का उपयोग कर परख का वर्णन, व्यक्ति और संयुक्त विषालु और अंय तनाव के दीर्घकालिक प्रभाव का अध्ययन । प्रस्तुत प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक विषालु (तांबा, कैडमियम, 3, 4-dichloroaniline, और chlorpyrifos) की एक सरणी के लिए प्रजातियों की संवेदनशीलता को मापने के लिए लागू किया गया । अपनी तेजी से जीवन चक्र के कारण, इस हड्डीवाला मॉडल चार महीने के भीतर घातक और transgenerational प्रभाव के आकलन के लिए अनुमति देता है । विषाक्तता स्क्रीनिंग के लिए एक मॉडल के रूप में इस मछली प्रजातियों का उपयोग करने का एक अंय प्रमुख लाभ यह है कि यह सूखा प्रतिरोधी अंडे का उत्पादन तथ्य है । यह शोधकर्ताओं अंडे की दुकान या उंहें एक आपूर्तिकर्ता से प्राप्त करने के लिए सक्षम बनाता है और एक महंगा और समय लेने पर साइट संस्कृति की जरूरत समाप्त । इसके अलावा, भ्रूण कई वर्षों के लिए संग्रहित किया जा सकता है जब तक hatchlings12की जरूरत है ।
संदर्भ विषालु की एक संख्या के लिए एन furzeri की संवेदनशीलता का अध्ययन करने के बाद, हम जोड़ सकते हैं कि प्रजातियों की संवेदनशीलता के साथ रेंज में है, या अधिक से अधिक, परीक्षण यौगिक पर निर्भर करता है कि अन्य मॉडल प्रजातियों में से. fecundity पर प्रभाव को मापने, विशेष रूप से, अध्ययन किया प्रजातियों पर संवेदनशीलता की तुलना में वृद्धि कर सकते हैं, के रूप में यह अन्य मॉडल प्रजातियों में एक नियमित रूप से मापा समापन बिंदु है. अंत में, किस हद तक एकाधिक तनावों प्रतिकूल प्रभाव डालती है, जब व्यक्तिगत या संयुक्त प्रशासित, मूल्यांकन समापन बिंदु और जोखिम एकाग्रता पर निर्भर है ।
N. furzeriके साथ कार्य करते समय अभी भी कुछ सीमाएं हैं । सबसे महत्वपूर्ण सीमाओं में से एक भोजन का मानकीकरण है । Artemia अल्सर या bloodworms के बैचों गुणवत्ता में अलग और कर सकते हैं, जैसे, प्रभाव अध्ययन के परिणाम कर सकते हैं । इसलिए यह उचित है के लिए भोजन का एक बड़ा बैच आदेश प्रयोग की पूरी लंबाई के दौरान उपयोग करें ।
हमें विश्वास है कि इस प्रोटोकॉल ecotoxicological स्क्रीनिंग के लिए व्यापक रूप से लागू है । एन furzeri तेजी से ecotoxicology में एक मानक परीक्षण प्रजातियों में विकसित कर रहा है । इस मानक प्रोटोकॉल की उपलब्धता से इसकी स्थापना ईंधन हो सकती है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम UAntwerpen के क्षेत्र समूह और पानी के नमूनों के विश्लेषण के लिए Ugent के फसल संरक्षण विभाग के लिए आभारी हैं । इस परियोजना के दौरान सहायता, केयू Leuven रिसर्च फंड के उत्कृष्टता केंद्र ' इको और सामाजिक-विकासवादी गतिशीलता (पीएफ/10/007) द्वारा प्रदान की गई थी । AFG (11Q0516N) और ESJT (FWO-SB151323) डॉक्टरेट और टी. पी. (12F0716N) के रूप में पोस्ट डॉक्टरेट फेलो द्वारा FWO Flanders (शौकीनों Wetenschappelijk Onderzoek) के रूप में वित्त पोषित किया गया ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| purified water Type 1 (milli Q) | Millipore | ||
| Sea Salt | Instant Ocean | ||
| 2L plastic tank | SAVIC | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 1L plastic tank (spawning) | Avamoplast | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| nets | Aqua bilzen | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 2L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 0,5L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| Artemia eggs | Ocean Nutrition | ||
| chironomus | Ocean Nutrition | frozen | |
| tricaine | Sigma aldrich | ||
| petri dishes | VWR | ||
| Parafilm | VWR | ||
| pipettes | MLS | ||
| tweezers | FST | ||
| 500 µm mesh sieve | / | self-made | |
| microcentrifuge tube (2ml) | BRAND | To store fish in freezer | |
| glass vials | Sigma aldrich | For water analysis | |
| weighing boat | MLS | ||
| Jiffy 7c pellets | Jiffy | ||
| water bath | Gilac | for Ctmax | |
| liquid nitrogen | Air liquide | ||
| digital thermometer | Testo AG | testo 926 | |
| HETO therm heater | Anker Schmitt | ||
| calibrated balance | Mettler-Toledo AG | ||
| camera | / | ||
| platform for camera | / | self-made | |
| Multiparameter kit | HACH | ||
| Freezer (-80°C) | Panasonic Ultra low temperature freezer | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fysio | |||
| homogenisation buffer | VWR | 0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100 | |
| chloroform:methanol | Sigma Aldrich | ||
| glyceryl tripalmitate | Sigma Aldrich | ||
| amyloglucosidase | Sigma Aldrich | A7420 | |
| glucose assay reagent | Sigma Aldrich | G3293 | |
| Biorad protein dye | VWR | ||
| 96-well microtiter plate | Greiner Bio-one | ||
| 384 microtiter plates | Greiner Bio-one | ||
| 2 ml glass tubes | Fiers | For fat analysis | |
| 2,5ml eppendorf tubes | VWR | ||
| homogeniser | Ultra-turrax TP 18/10 | ||
| photospectrometer | Infinite M200 TECAN | ||
| heater for glass tubes | Hach COD REACTOR | ||
| centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5415 R | ||
| Incubator | Bumako |
References
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