Summary
In dieser Arbeit beschreiben wir eine akute, chronische und Mehrgenerationen Bioassay zur Untersuchung der Auswirkungen von Einzel- und kombinierte Stressoren auf die türkisfarbene Killifische Nothobranchius Furzeri. Dieses Protokoll dient zur Lebensgeschichte Züge (Mortalität, Wachstum, Fruchtbarkeit, Gewicht) und kritische thermische Maximum zu studieren.
Abstract
Killifische Nothobranchius Furzeri ist eine aufstrebende Modellorganismus auf dem Gebiet der Ökotoxikologie und ihre Anwendbarkeit bei akuten und chronischen Ecotoxicity Tests nachgewiesen. Insgesamt ist die Empfindlichkeit der Spezies zu toxischen Verbindungen im Bereich mit, oder höher als die der anderen Modell-Arten.
Diese Arbeit beschreibt Protokolle für akute, chronische und Mehrgenerationen Bioassays Einzel- und kombinierte Stressor Auswirkungen auf N. Furzeri. Aufgrund seiner kurzen Reifezeit und Lebenszyklus erlaubt dieses Wirbeltiere Modell die Studie von Endpunkten wie Reifezeit und Fruchtbarkeit innerhalb von vier Monaten. Transgenerationalen Ökobilanz-Belichtung Studien können in weniger als 8 Monaten durchgeführt werden. Da diese Sorte produziert Eizellen, die Trockenheit sind und bleiben für Jahre lebensfähig, die vor-Ort-Kultur der Arten ist nicht erforderlich, aber Einzelpersonen können rekrutiert werden, wenn erforderlich. Die Protokolle sind auf Maß Lebensgeschichte Züge (Mortalität, Wachstum, Fruchtbarkeit, Gewicht) und kritische thermische Maximum konzipiert.
Introduction
Empfindlichkeit-Profile aus einer Reihe von Arten, strategisch ausgewählten Schadstoffen wurden beschrieben1 für die europäischen REACH-Gesetzgebung (Registrierung, Bewertung, Zulassung und Beschränkung von Chemikalien). Akute oder kurzfristige Toxizitätstests wurden meist für diesen Zweck eingesetzt, da sie einen schnellen Hinweis auf eine Art Sensibilität geben. Jedoch in ihrer natürlichen Umgebung Organismen sind über einen viel längeren Zeitraum ausgesetzt und vollständigen Lebenszyklus oder sogar mehrere Generationen möglicherweise betroffenen2. Darüber hinaus sind Organismen in verschmutzter Umgebung in der Regel ausgesetzt mehr als ein Stressor in einer Zeit, die miteinander interagieren kann, wodurch möglicherweise die synergistische Effekte3. Daher können sichere Konzentrationen berechnet basierend auf akute, einzelne Stressor Toxizitätstests unterschätzen die tatsächlichen Risiken von Schadstoffen in natürlichen Umgebungen. Es ist daher ratsam, auch die chronischen und Mehrgenerationen subletalen Konzentrationen von Schadstoffen in einem ökologisch relevanten Kontext untersuchen wie von der Europäischen Kommission4,5 und USEPA (United befürwortet States Environmental Protection Agency)6,7. Vor allem in vertebrate Forschung sind die Kosten in Bezug auf Arbeit, Geld und Zeit hoch, bei chronischen und Mehrgenerationen Belichtung Studien wegen der relativ langen Lebensdauer der Wirbeltiere im Vergleich zu Wirbellosen Modellorganismen. Daher ist es ratsam, die am besten geeignete Fische Modellorganismus, je nach Fragestellung wählen. Darüber hinaus sollte eine breite Palette von Wirbeltieren zur Verfügung, um die Allgemeingültigkeit der Antworten über Artgrenzen Regelungen basierend auf den empfindlichsten Arten anpassen können zu testen. Denn jetzt gibt es eine Notwendigkeit zur Entwicklung neuer, effizienter Protokolle mit vertebrate Model Art zeichnet sich durch kurze Lebenszyklen, senken Sie die Kosten für die Durchführung von chronischen und Mehrgenerationen-Risiken auf Wirbeltiere7,8.
Die türkisfarbenen Killifische Nothobranchius Furzeri ist ein interessantes Modell der Fisch in solchen langfristigen Exposition Experimenten wegen seiner kurzen Reifezeit und Lebenszyklus (weniger als 4 Wochen9Generationszeit) zu verwenden. Dies bedeutet, dass ökologisch relevanter Endpunkte wie Reifezeit und Fruchtbarkeit innerhalb eines kurzen Zeitraums im Vergleich zu anderen Fisch Modelle7studiert werden können. Außerdem produzieren diese Fische Trockenheit, ruhende Eizellen, die für mehrere Jahre lebensfähig, wenn unter normalen Bedingungen, wodurch die Notwendigkeit für eine kontinuierliche Kultur9gespeichert bleiben. Ökotoxikologische Untersuchungen bedeutet dies auch, dass replizieren, die Fische alle zum exakt gleichen Zeitpunkt ausgebrütet werden können was Zeit synchron für alle Tiere, auch unter den Chargen von Eiern zu unterschiedlichen Zeiten. Wir empfehlen das Labor GRZ Stamm Belichtung Experimente durchführen. Diese Belastung führt auch unter Laborbedingungen, ist homozygot (mit Ausnahme der Geschlechtschromosomen) und das Genom ist gut charakterisierten10,11.
In Ökotoxikologische Untersuchungen ist es wichtig, den entsprechenden Testkonzentrationen auszuwählen. Verschiedene ergänzende Methoden können zu diesem Zweck verwendet werden. Der nominale Konzentrationsbereich kann auf die Empfindlichkeit von einer verwandten Art, z. B. Nothobranchius aus12beruhen. Alternativ kann die Reichweite basieren auf die Empfindlichkeit des standard Fisch Modelle, z. B. Zebrafisch (Danio Rerio)2 , die eine vergleichbare Sensibilität für die meisten Giftstoffe (Philippe Et al. (im Rückblick)). In Kombination mit beiden Optionen sollte ein Experiment zur Dosisfindung durchgeführt werden, um die sollkonzentration Bereich auszuwählen. Für akute testen, sollten Forscher Konzentration Behandlungen mit 100 % Mortalität, zwischen Mortalität und 0 % Mortalität nach 24 Stunden nach der Exposition gegenüber der Schlüpfzeit anstreben. Für chronische testen, empfiehlt es sich, laufen die Dosisfindung Experiment für zwei Wochen zu überprüfen, ob larval Sterblichkeit in der Bedingung mit der höchsten Testkonzentrationen 10 % während dieses Bezugszeitraums nicht übersteigt.
Das Protokoll dient Prüfung potenzielle Auswirkungen der Stressoren auf individueller und zellulärer Ebene als Grundlinie, akute und chronische Exposition gegenüber Wasser Schadstoffe auf N. Furzeri, durchzuführen. Es kann auch verwendet werden, um Multi-Stressor Forschung angepasst eine höhere ökologische Relevanz, Mischen von verschiedenen toxischen Verbindungen oder Studium der Wechselwirkungen zwischen Luftverschmutzung und andere natürliche Stressoren (z.B. Raub) durchzuführen oder anthropogene Stressoren (z. B. Erwärmung infolge des Klimawandels).
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Protocol
Alle hier beschriebene Methoden wurden von der Ethikkommission der KULeuven genehmigt.
(1) schlüpfen und allgemeine Wartung von N. Furzeri
- Bereiten Fisch Medium (pH 7) bei einer Temperatur von 14 ° C und eine Leitfähigkeit von 600 µS/cm (24 ° C) gereinigtes Wasser Typ II, mit zusätzlichen standardisierte Salze hinzufügen.
- Wählen Sie aus Eiern von der GRZ (Gona-Rhe-Zhou) Labor-Linie, die unter standardisierten Bedingungen13gespeichert wurden. Wählen Sie Eiern in der DIII-Phase (d. h. bereit zu schlüpfen), erkennbar durch die Anwesenheit von goldenen Augen9 und sanft mit einem weichen Pinzette auf übertragen ein Kunststoff 2 L-Tank (nicht mehr als ca. 30 Eiern pro Tank).
Hinweis: Um eine ausreichende Anzahl von gesunden Testorganismen haben, schlüpfen Sie doppelt so viele Eiern als die Anzahl der erforderlichen Fischlarven. - 1 cm des Mediums Fisch bei 12 ° C und die Wassertemperatur langsam auf Raumtemperatur (24 ° C)9konvergieren. Fisch wird innerhalb der ersten 12 h schlüpfen.
- Nach 24 h, füttern die Jungtiere eine konzentrierte Dosis von frisch geschlüpften Artemianauplii (für mehr Details über die Häufigkeit und Menge der Nahrung, beziehen sich auf die Zucht-Protokoll von Polačik Et Al. 20169) und die Wassertiefe auf 5 cm zu erhöhen Das Fisch-Medium hinzufügen.
- Nach 36 h füttern Sie die Jungtiere einer anderen konzentrierte Dosis von frisch geschlüpften Artemia-Nauplien und fügen Sie Fisch Medium um die Wassertiefe bis zu 10 cm zu erhöhen.
- Fisch-Container unter konstanter Temperatur-Bedingungen (z.B. in einem Inkubator, Klima oder beheizten Wasserbad) unter einer 14 H:10 h inkubieren hell: dunkel-Regime.
- Vor dem Start des Experiments Übernachtung komplexe Fisch Behälter (ohne Fisch) mit Verbindung durch Befüllen mit der höchsten Konzentration von Exposition Medium und verlassen sie die Belichtung um die Übertragung von Schadstoffen in den Container in der eigentlichen beschränken Experimentieren Sie.
- 48 h nach dem Schlupf, wählen Sie gesunde lebhafte Larven um die Exposition Experiment zu beginnen. So genannte Bauch-Sliders, die waren nicht in der Lage, ihre Schwimmblase zu füllen und somit eine Beeinträchtigung Auftrieb zu verwerfen (ständig auf den Boden sinken).
2. kurzfristige Exposition Protokoll
Hinweis: Forscher sollten mindestens 20 Wiederholungen (20 Fische in separaten Gläsern) pro Behandlung anstreben. Neben einem volle Kontrolle-Behandlung sollten ein Lösungsmittel-Steuerelement enthalten sein, wenn der Stammlösung der Verbindung bereit ist, mit Hilfe eines Lösungsmittels. Das Lösungsmittel Steuerelement sollte die Menge des Lösungsmittels gleich der Lösemittelkonzentration in der höchsten Expositionskonzentration enthalten.
- Bereiten Sie die experimentelle Container (0,5 L Glasgläser) durch beschriften sie und füllt sie mit dem Medium angemessene Belichtung (verschiedenen giftigen Konzentrationen). Fügen Sie die Verbindung um die richtige Konzentration zu erhalten.
- Larven (48 h nach dem Schlupf) individuell auf die Behälter (1 Fisch pro Container für individuelle Überwachung) übertragen.
Hinweis: Fische sind einzeln belichtet, um potenziell verwirrende Auswirkungen der sozialen Interaktion wie Konkurrenz um Nahrung und Aggression zu minimieren. Fische dürfen jedoch visuell in Übereinstimmung mit ethischen Standards für den Laboreinsatz Tier interagieren. - Follow-up dieses akute Exposition für eine Dauer von bis zu 2 Wochen. Während dieser Zeit füttern die Fische Ad Libitum mit Artemia Nauplien zweimal pro Tag, 7 Tage/Woche.
- Aktualisieren Sie das Medium jeden zweiten Tag, Wasserqualität zu erhalten und mögliche Auswirkungen des zusammengesetzten Abbau zu minimieren. Zentrale Wasser-Variablen zu überwachen (gelöster Sauerstoff-Niveaus sollte mehr als 80 %, Leitfähigkeit sollte im Bereich zwischen 350 und 450 mg/L, die innerhalb des Bereichs der optimalen Aufzucht Bedingungen liegt zwischen 600 und 700 µS/cm, pH zwischen 7,8 und 8,2 und Härte (wie CaCO3) für N. Furzeri 9). Nehmen Sie Wasserproben, vor und nach der Aktualisierung des Mediums, um tatsächliche Verbindung Konzentrationen bestimmen.
- Endpunkte
- Überprüfen Sie Fisch für die Mortalität, Stress (z.B. abweichendes Verhalten: Schwimmen auf dem Kopf stehend) oder Krankheit täglich (morgens, abends). Wenden Sie sich an die Veröffentlichung der Shedd Et al. (1999) 12 für Details auf die Beobachtung der Sterblichkeit, Stress oder Krankheit.
- Berechnen Sie LC50 Werte basierend auf die Mortalität mit Dosis-Wirkungs-Kurven (Ritz und Streibig, 2005) zu verschiedenen Zeitpunkten. Verwenden Sie die Drm -Funktion in der DRK-Paket R v3.2.3 (R Development Core Team, 2016) oder ähnlichen statistischen Ansätzen.
3. chronische Exposition Protokoll
Hinweis: Ziel ist es bei einem Minimum von 25 Fische/Zustand zu Beginn des Experiments, um Chancen auf einen verzerrten Geschlechterverhältnis zu minimieren und um mögliche Hintergrund Sterblichkeit aufgrund natürlicher Ursachen (zB. altersbedingte Mortalität).
- Schraffuren (siehe Abschnitt 1)
- Phase-I (2 Tage nach dem Schlupf-16 Tage nach dem Schlupf)
- Protokoll zu folgen, wie unter 2.1-2.4
- Wie in der zweiten Phase des Experiments wird das Medium im Laufe der Woche (keine Erfrischung, siehe unten) abgebaut. Speichern Sie die erforderliche Menge des Mediums für eine Woche in großen inerten Behältern um ähnliche Abbau der Verbindung zu ermöglichen.
- Phase II (16 Tage nach dem Schlupf-Ende)
- Bereiten Sie 2 L experimentelle Gläsern durch Komplexbildner sie mit der Verbindung. Füllen Sie die Gläser mit den korrekte Belichtung Medium und fügen ein Luftschlauch um das Glas zu belüften. Haus Fisch einzeln in diesen Gläsern für den Rest des Experiments. Erlauben Sie die visuelle Interaktion, ethische Standards unterzubringen.
- Das Medium einmal pro Woche zu aktualisieren. Übertragen Sie die Fische mit einem Netz auf eine neue JAR-Datei mit dem gleichen Belichtung Medium. Nehmen Sie Wasserproben jeden Tag während einer Woche, den Abbau der Verbindung in jeder Konzentration Behandlung zu überwachen. Berechnen Sie eine Abbau-Kurve für jede Behandlung wenn mehrere Stressoren sind (z. B. Toxizität eines Stoffes in verschiedenen Temperaturregime) getestet. Messen Sie abiotischer Parameter (pH-Wert, Temperatur, % gelösten Sauerstoff, Leitfähigkeit) dreimal pro Woche.
- 2 Tage nach dem Schlupf (Dph) bis 23 Dph füttern Sie die Fische zweimal pro Tag, 7 Tage pro Woche ad libitum Artemia Nauplien. Ergänzen Sie von 24 Dph - 37 Dph die Ad LibitumArtemia Ernährung mit gehackten Chironomus -Larven. Von 38 Dph auf füttern Sie die Fische zweimal pro Tag, 7 Tage pro Woche Ad Libitum Chironomus Larven eingefroren.
- Endpunkte
- Überprüfen Sie täglich Fisch für Sterblichkeit, Stress oder Krankheit12.
- Um Wachstum zu bestimmen, Messen der Körpergröße auf einer wöchentlichen Basis (9 Dph - 16 Dph - 21 Dph -...) durch die Übertragung von Fisch zu einer Petrischale mit Medium aus ihrem Reservoir gefüllt. Fotografieren Sie 4-5 Größe kalibriert die Fische von oben (auf einer bestimmten Höhe) und analysieren sie Digital mit einer räumlichen Messprogramm (z.B. ImageJ).
Hinweis: Für Erwachsene Fische, verwenden Sie eine höhere Petrischale, um Umgang mit Stress zu minimieren, indem man alle Fische unter Wasser während des gesamten Prozesses zu messen. - Für männliche Reifung Sichtkontrolle Fisch täglich für die Färbung von 15 Dph ab. Überprüfen Sie die Flossen auf erste Anzeichen einer bräutlichen Färbung (sekundäre sexuelle Merkmal). Verwenden Sie den ersten Tag, an dem das für männliche Reifezeit als Proxy sichtbar ist.
- Paar nicht geschlechtlich Fisch mit Männchen der gleichen Behandlungsgruppe oder nicht-experimentellen Männer dreimal pro Woche von 30 Dph ab um weibliche Reifezeit (der Tag, den das erste Ei hinterlegt ist) zu bestimmen. Verwenden Sie dazu das Laichen Protokoll in 3.4.5 beschrieben.
- Fruchtbarkeit, paar Reifen Frauen mit Reife Männer 3 Mal / Woche ab 30 Dph ab, innerhalb ihrer Behandlungen eine Kreuzung-Schema verwenden.
- Bereiten Sie eine laichbeckens (1 L) für jedes Paar mit Exposition Medium aus dem männlichen Aquarium ergänzt mit Substrat Laichen (feiner Sand < 500 µm).
- Transfer der männlichen und weiblichen in den Laich Tank und es ihnen ermöglichen, zwei Stunden lang zu laichen. Minimieren Sie menschliche Aktivität oder Störungen rund um den Laichen Behältern während dieses Prozesses.
- Danach übertragen Sie sanft Fisch wieder auf ihre ursprüngliche Gehäuse-Container ohne unnötige Vermischung des Wassers, die die Eier im Substrat Laichen Wirbeln würde.
- Ausfiltern Sie die Eizellen durch Gießen das Laichen Substrat über ein Netz von 500 µm her. Zählen die Eizellen und übertragen Sie sie (mit weichen einer Pinzette) in feuchten Torf in Petrischalen9,14.
- Toten Eiern täglich zu entfernen. Nach eine Woche, Siegel der Petri dish mit Abdichtung Film und bewahren Sie es an eine Temperatur gesteuert Inkubator bei 28 ° C und einem 14:10 h hell: Dunkel-Zyklus für sofortige Entwicklung der DIII-Phase (d. h. bereit, schlüpfen nach etwa drei Wochen). Für die langfristige Lagerung speichern Sie die Eizellen bei 17 ° C in ständiger Dunkelheit auf dem Eiern geben Sie die Ruhephase und bleiben für mehrere Jahre lebensfähig. Bei der Einstellung von Fischen aus diesen ruhenden Eiern für Experimente, übertragen Sie die ruhenden Eiern auf 28 ° C mit 14:10 h hell: Dunkel-Zyklus für etwa drei Wochen, um Entwicklung der DIII-Phase zu ermöglichen.
- Das kritische thermische Maximum (CTmax) (ein Maß für die Leistung15) geschlechtsreifer Fische zu messen.
- Verwenden Sie ein Wasserbad, das erhitzt wird mit einer Konstanten Rate von 0,33 ° C/min und in denen das Wasser zirkuliert kontinuierlich. Fügen Sie mehrere 1 L Aquarien für jeden einzelnen Fisch.
Hinweis: Da Platzverhältnisse im Wasserbad, ist es notwendig, in mehreren Serien zu arbeiten. Mögliche Unterschiede in den Bedingungen unter Serien sollte berücksichtigt werden, bei der statistischen Analyse von einschließlich "Serie" als einen Zufallsfaktor. - Die Testphase zu starten, indem Sie das Aquarium Fische hinzufügen, wenn das Wasser im Aquarium die experimentelle Aufzucht Temperatur der Fische (in der Regel 28 ° C) erreicht hat Überwachen Sie die Temperatur in der 1 L-Aquarien des CTmax Bades alle 5-min mit einem digitalen Thermometer (0,1 ° C-Skala).
- Am Ende der Verhandlung, wenn die Fische nicht dorsal-ventral aufrecht zu erhalten oder beginnt stark zucken16,17. Messen Sie die Temperatur in der 1 L-Aquarium, das die kritischen maximale Temperatur ist. Übertragen Sie den Fisch zurück zu seinem experimentellen Gehäuse für die Wiederherstellung.
- Verwenden Sie ein Wasserbad, das erhitzt wird mit einer Konstanten Rate von 0,33 ° C/min und in denen das Wasser zirkuliert kontinuierlich. Fügen Sie mehrere 1 L Aquarien für jeden einzelnen Fisch.
- Messen Sie das Gewicht (0,1 mg Genauigkeit) der Fische am letzten Tag des Experiments, indem klopfte es trocken und übertragen es auf einem Boot mit einem Gewicht von. Hinweis: Alle Fische sollte vier Stunden nach der letzten Fütterung um Lebensmittel Gewicht im Darmtrakt zu standardisieren gemessen werden.
- Einschläfern der Fische mit 0,1 % Tricaine.
4. transgenerationalen Exposition Protokoll
Hinweis: Zur Messung der transgenerationalen Auswirkungen von Schadstoffen auf N. FurzeriFolgen der chronischen Exposition Protokolls beschriebenen für die erste Generation.
- Zweimal wöchentlich prüfen die Entwicklung der produzierten Eier (d. h. der zweiten Generation) bei 28 ° C gelagert 14:10 h hell: Dunkel-Zyklus Bedingungen durch die Überprüfung der Petrischalen für Embryonen in der DIII-Phase (siehe Polačik Et Al. 2016-9). Wenn mehr als 50 Wiederholungen jeder elterlichen Behandlung voll entwickelt sind, schlüpfen sie nach der 1.1-Protokolls.
- Gesunde, lebhafte Fisch zu den gleichen Aufbau und Behandlung als die elterliche Fische aussetzen.
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Representative Results
Zeigen Sie die Ergebnisse der akuten Exposition von N. Furzeri , unterschiedliche Konzentrationen von Kupfer, berechnet wie in 2.5.2, Cleardose-Wirkungs-Beziehungen (Abbildung 1). Gibt es eine Zunahme der Mortalität mit zunehmender vergiftendes Konzentration. LC50 Werte sinken im Laufe der Zeit, was bedeutet, dass mit abnehmender Konzentration, mehr Zeit, vor 50 % der Wiederholungen sterben vergeht. Für detaillierte Ergebnisse auf die akute und chronische Exposition von N. Furzeri Kupfer, sowie der Vergleich der Arten Sensitivität im Vergleich zu anderen Arten, verweisen wir auf Philippe Et Al. 20177.
In die chronische Exposition Testversion sind Körpergröße und Fruchtbarkeit sensible Endpunkte. Es können umfangreiche Variation in das Wachstum der Fische, je nach Temperatur-18. Erwachsene Größen zwischen 30 und 50 mm in diesem Set-up normal gelten. Das Set-up können Unterschiede zwischen den Behandlungen (Abbildung 2A) zu finden. In eine chronische Exposition Assay mit wasserbasierten Kupfer, gab es ein signifikanten Effekt der Kupfer Exposition während der dritten Woche (χ²5,34 40,7, P = < 0,001), mit N. Furzeri ausgesetzt 19.38 µg/L Cu kleiner als alle anderen Fische (alle P < 0,001) (Abb. 2 b). Für Fruchtbarkeit sollten Werte zwischen rund 50 Eiern pro Woche pro Weibchen an der Spitze der Ei-Produktion-7schwanken. In einem weiteren Experiment mit wasserbasierten Chlorpyrifos und einen Temperaturanstieg von 2 ° C, wir fanden eine signifikante Wechselwirkung zwischen Temperatur Anstieg und Chlorpyrifos Exposition auf Fruchtbarkeit (χ22.202 25,3, P = < 0,001). Bei 28 ° C, Fische ausgesetzt bis 4 µg/L produziert weniger Eiern im Vergleich zu Fisch, 2 µg/L und Kontrolle Fische ausgesetzt (beide P < 0,001) (Abb. 2 b). Bei 30 ° C Kontrolle Fische produziert mehr Eiern im Vergleich zu allen Chlorpyrifos ausgesetzt Fisch (beide P < 0,007). Der Haupteffekt der Exposition gegenüber Chlorpyrifos (χ22.202 96,8, P = < 0,001) und die wichtigste Auswirkung der Temperatur (χ21.202 10.18, P = < 0,001) deutlich verringert Fruchtbarkeit. Die Messung ist aufgrund der Handhabung des Fisches und der Beschichtung von den Eiern auf Torf9sehr zeitaufwendig, aber es ist oft der empfindlichsten Endpunkt.
Reifezeit ist durch Schadstoffe bei Männern am häufigsten betroffen. Männliche Reifezeit wurde erheblich beeinträchtigt durch chronische Exposition gegenüber wässrigen Chlorpyrifos (χ22,41 = 11,79, P = 0,003), mit Männchen ausgesetzt bis 4 µg/L CPF (C2) mit einer 18 % langsamere Reifung im Vergleich zur Kontrolle Männchen (Abbildung 3A ). Diese Antwort sollte jedoch, mit Vorsicht zu interpretieren, da Reifezeit indirekt durch die Bestimmung des Beginn der bräutlichen Färbung als Proxy erzielt wird. Obwohl Männer als ein paar Tage nach dem Erscheinen der Färbung9Reifen gelten, möglicherweise einige Fehler auf das genaue Timing der Reifung mit dieser Maßnahme.
In der Nähe der thermischen Maximums weisen Fisch erratischen Schwimmen, erhöhte Kiemendeckel Bewegung und Verlust der Fähigkeit, in einer dorsal-ventral aufrechte Position 16,17bleiben. CTmax Werte unterscheiden zwischen N. Furzeri Stämmen. Natürliche Populationen haben CTmax Werte zwischen 39 ° C und 42 ° C bei Temperaturen zwischen 24 und 28 ° C (Abb. 3 b) aufgezogen. Die Inzucht GRZ Stamm, erreicht jedoch bereits sein thermische Maximum bei ca. 37-38 ° C, auch wenn bei 28 ° c gehalten Während dieser Prozedur nicht tödlich für die Fische ist, treten seltene Fälle von Sterblichkeit. Solche Fische sind am besten aus der CTmax Analyse ausgeschlossen, da sie am ehesten Fisch darstellen, die in relativ schlechten Allgemeinzustand sind.
Bisherige Ergebnisse meist zeigten, dass CTmax in diesem Fall von der Schadstoff betroffen sein kann, 3,4-DCA (χ22,7117,65, P = < 0,001) mit Fisch, 0,1 mg/L 3,4-DCA mit 0,32 ° C niedrigere thermische maximal im Vergleich zur Kontrolle Fische ausgesetzt (P < 0,001). CTmax wirkte sich auch durch die Aufzucht Temperatur (χ21,71= 322.0, P < 0,001) und Fische, die bei 28 ° C aufgezogen wurden, hatte eine 1,3 ° C höhere CTmax im Vergleich um zu Fischen, die bei 24 ° c aufgezogen wurden
Abbildung 1: Dosis-Wirkungs-Kurve für Kupfer Belichtung. Dosis-Wirkungs-Kurven zeigen kumulative Mortalität von Nothobranchius Furzeri in Abhängigkeit von der Kupfer Expositionskonzentration (in µg/L Cu und in Bezug auf Belichtungszeit). Punkte zeigen LC50 Werte. Diese Zahl wurde von Philippe Et Al. 20172geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Auswirkungen auf die Größe und Fruchtbarkeit als Endpunkte. (A) Größe (in cm) von Nothobranchius Furzeri verschiedene Konzentrationen ausgesetzt von Kupfer in Woche 3, 7, 11 und 15. Sternchen zeigt an, dass C5 Fisch kleiner sind nach drei Wochen auf das Signifikanzniveau von P < 0,05. Werte werden als ± SEM Sample Größen bedeuten präsentiert, sind n = 6; 6; 7; 7; 7; 7 in Woche 3, n = 6; 6; 7; 7; 4 in Woche 7, n = 5; 4; 5; 5; 3 in Woche 11 und n = 5; 3; 3; 5; 2 in Woche 15. B) Fruchtbarkeit durch die Zeit der Fische, die verschiedene Konzentrationen von Chlorpyrifos, gekreuzt mit zwei Temperatur Behandlungen ausgesetzt als die Anzahl der Eizellen pro Woche gemessen. Zur Verbesserung der Lesbarkeit und Interpretierbarkeit der Figur sind Fehlerindikatoren nicht in den Diagrammen dargestellt. Die Zahl der Frauen in jeder Behandlung am Anfang und Ende der Legeperiode Eizelle wird angezeigt durch den Buchstaben ' n '. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Auswirkungen auf die Reifezeit und CTmax. (A) mittleres Alter (in Tagen) an dem erschienen die ersten Zeichen der Färbung bei Männchen der Nothobranchius Furzeri verschiedene Chlorpyrifos Konzentrationen (0 µg/L (C0), 2 µg/L (C1) und 4 µg/L CPF (C2)) und zwei Temperaturen (28 ° C und 30 ° C) ausgesetzt. B) mittlere kritische thermische maximal (CTmax) Fische, die verschiedene Konzentrationen von 3,4-DCA (0 mg/L 3,4-DCA (C0) 0,05 mg/L 3,4-DCA (C1) und 0,1 mg/L 3,4-DCA (C2)) und zwei Temperaturen (24 ° C und 28 ° C) ausgesetzt. Geringe Konzentrationen sind als Mittelwert ± SE präsentiert Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Diese Arbeit beschreibt eine neue Bioassay mit Nothobranchius Furzeri, einer aufstrebenden Modellorganismus, um das Individuum zu studieren und langfristige Auswirkungen der Giftstoffe und andere Stressfaktoren kombiniert. Die vorgestellten Protokolle wurden erfolgreich eingesetzt, um die Empfindlichkeit der Gattung in ein Array von Schadstoffen (Kupfer, Cadmium, 3,4-Dichloroaniline und Chlorpyrifos) zu messen. Aufgrund seiner schnellen Lebenszyklus dieses Wirbeltiere Modell ermöglicht eine Beurteilung der subletalen und transgenerationalen Effekte innerhalb von vier Monaten. Ein weiterer großer Vorteil der Verwendung dieser Fischarten als ein Modell für Toxizität Screening ist die Tatsache, dass es Trockenheit Eiern produziert. Dies ermöglicht Forschern Eiern zu speichern oder sie von einem Lieferanten beziehen und eliminiert die Notwendigkeit für eine kostspielige und zeitraubende vor-Ort-Kultur. Darüber hinaus können die Embryonen für mehrere Jahre, bis Jungtiere benötigte12 sindgespeichert werden.
Nach dem Studium der Empfindlichkeit des N. Furzeri zu einer Reihe von Referenz Giftstoffe, können wir hinzufügen, dass die Empfindlichkeit der Gattung liegt im Bereich mit, oder höher als die anderen Arten, abhängig von der getesteten Verbindung zu modellieren. Messung der Auswirkungen auf die Fruchtbarkeit, kann insbesondere die Vergleichbarkeit der Empfindlichkeit von der untersuchten Spezies erhöhen, wie es ein routinemäßig gemessene Endpunkt in anderen Modell-Arten ist. Zu guter Letzt das Ausmaß, das mehrere Stressoren Nebenwirkungen, wenn einzeln verwaltet oder kombiniert, abhängig von der ausgewerteten Endpunkt und der Expositionskonzentration ist ausüben.
Es gibt noch einige Einschränkungen beim Arbeiten mit N. Furzeri. Eine der wichtigsten Einschränkungen ist die Standardisierung von Lebensmitteln. Chargen von Artemia Zysten oder Mückenlarven können unterscheiden sich in Qualität und können als solche Einfluss auf die Ergebnisse der Studie. Es ist daher ratsam, einen großen Stapel von Lebensmittel zu verwenden, während der gesamten Dauer des Experiments zu bestellen.
Wir glauben, dass dieses Protokoll für ökotoxikologische Screening allgemein anwendbar ist. N. Furzeri entwickelt sich rasch zu einer standard-Test-Spezies in der Ökotoxikologie. Die Verfügbarkeit von diesem standard-Protokoll kann der Gründung Kraftstoff.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir sind dankbar, die Kugel-Gruppe von der UAntwerpen und der Abteilung für Pflanzenschutz an der dringend für die Analyse von Wasserproben. Unterstützung bei diesem Projekt wurde von der Excellence Center bereitgestellt "Eco und sozio-evolutionäre Dynamik des Forschungsfonds KU Leuven (PF/10/007). AFG (11Q0516N) und ESJT (FWO-SB151323) wurden als Doktoranden gefördert und TP (12F0716N) als Post-Doktorand von FWO Flanders (Fonds Wetenschappelijk verwendet).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| purified water Type 1 (milli Q) | Millipore | ||
| Sea Salt | Instant Ocean | ||
| 2L plastic tank | SAVIC | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 1L plastic tank (spawning) | Avamoplast | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| nets | Aqua bilzen | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 2L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 0,5L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| Artemia eggs | Ocean Nutrition | ||
| chironomus | Ocean Nutrition | frozen | |
| tricaine | Sigma aldrich | ||
| petri dishes | VWR | ||
| Parafilm | VWR | ||
| pipettes | MLS | ||
| tweezers | FST | ||
| 500 µm mesh sieve | / | self-made | |
| microcentrifuge tube (2ml) | BRAND | To store fish in freezer | |
| glass vials | Sigma aldrich | For water analysis | |
| weighing boat | MLS | ||
| Jiffy 7c pellets | Jiffy | ||
| water bath | Gilac | for Ctmax | |
| liquid nitrogen | Air liquide | ||
| digital thermometer | Testo AG | testo 926 | |
| HETO therm heater | Anker Schmitt | ||
| calibrated balance | Mettler-Toledo AG | ||
| camera | / | ||
| platform for camera | / | self-made | |
| Multiparameter kit | HACH | ||
| Freezer (-80°C) | Panasonic Ultra low temperature freezer | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fysio | |||
| homogenisation buffer | VWR | 0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100 | |
| chloroform:methanol | Sigma Aldrich | ||
| glyceryl tripalmitate | Sigma Aldrich | ||
| amyloglucosidase | Sigma Aldrich | A7420 | |
| glucose assay reagent | Sigma Aldrich | G3293 | |
| Biorad protein dye | VWR | ||
| 96-well microtiter plate | Greiner Bio-one | ||
| 384 microtiter plates | Greiner Bio-one | ||
| 2 ml glass tubes | Fiers | For fat analysis | |
| 2,5ml eppendorf tubes | VWR | ||
| homogeniser | Ultra-turrax TP 18/10 | ||
| photospectrometer | Infinite M200 TECAN | ||
| heater for glass tubes | Hach COD REACTOR | ||
| centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5415 R | ||
| Incubator | Bumako |
References
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