Summary
В этой работе мы описываем острых, хронических и поколениями биопроб для изучения воздействия одного и комбинированной стресс на бирюзовый Пецилиевые рыбы Nothobranchius furzeri. Этот протокол предназначен для изучения истории жизни черты (смертности, рост, плодовитость, вес) и критических тепловой максимальный.
Abstract
Пецилиевые рыбы Nothobranchius furzeri является формирующейся модели организма в области экотоксикологии и продемонстрировал его применимость в острых и хронических экотоксичности тестирования. В целом чувствительность видов токсичных соединений находится в диапазоне с, или выше, чем у других видов модели.
Эта работа описывает протоколы для острых, хронических и поколениями bioassays стрессор одного и комбинированных эффектов на N. furzeri. Благодаря своей короткой созревания время и жизненный цикл эта позвоночных модель позволяет исследования конечных точек, таких как время созревания и плодовитость в течение четырех месяцев. Следующих полного жизненного цикла испытания воздействия могут быть выполнены в качестве лишь 8 месяцев. Поскольку этот вид производит яйца, которые засухоустойчивых и остаются жизнеспособными в течение лет, на месте культуры видов не нужна, но люди могут быть набраны при необходимости. Протоколы предназначены для измерения жизни история черты (смертности, рост, плодовитость, вес) и критических тепловой максимальный.
Introduction
Чувствительность профили массива видов в стратегически выбранных токсикантов были описаны1 для европейских достичь законодательства (регистрации, оценки, авторизации и ограничении химических веществ). Острый или краткосрочной токсичности тесты главным образом использовались для этой цели, как они дают краткое указание видов чувствительности. Однако в их естественной среде, организмы подвергаются более длительных периодов и полного жизненного цикла или даже несколько поколений может быть пострадавших2. Кроме того в загрязненной среде организмов обычно подвергаются более чем одного стрессор в то время, которые могут взаимодействовать друг с другом, может привести к синергических эффектов3. Следовательно тесты на токсичность вычисляемые на основе острой, единый стрессор безопасной концентрации могут недооценивать фактические риски, введенных токсикантов в естественных условиях. Это, таким образом, целесообразно также изучить хронических и застроек эффекты сублетальные концентрации токсикантов в контексте экологически значимых как пропагандируемые Европейской Комиссии4,5 и АООС США (Соединенные Агентство по охране окружающей среды государств)6,7. Особенно в позвоночных исследований затрат труда, деньги и время являются высокими, при выполнении исследований хронической и застроек воздействия из-за относительно продолжительный позвоночных, по сравнению с моделью беспозвоночных организмов. Таким образом желательно выбрать наиболее подходящие модельный организм рыбы, в зависимости от исследования вопрос. Кроме того широкий спектр видов позвоночных должны быть доступны для того чтобы испытать общность ответов различных видов, чтобы иметь возможность адаптировать правила, основанные на наиболее чувствительных видов. В настоящее время существует необходимость разработки новых, эффективных протоколов с видов позвоночных модель характеризуется короткого жизненного цикла, снизить затраты на выполнение хронических и застроек воздействия на позвоночных7,8.
Бирюзовый Пецилиевые рыбы Nothobranchius furzeri представляет собой интересную модель рыб для использования в таких долгосрочных экспериментов воздействия из-за своей короткой созревания время и жизненного цикла (поколение время меньше, чем 4 недели9). Это означает, что экологически соответствующие конечные точки как время созревания и плодовитости могут быть изучены в короткие сроки по сравнению с другими рыбы модели7. Кроме того эти рыбы производят засухе, спящие яйца, которые остаются жизнеспособными в течение нескольких лет при хранении в стандартных условиях, тем самым устраняя необходимость непрерывной культуры9. В экотоксикологических исследований это также подразумевает что повторяют, что рыбы могут все быть вылупившихся в тот же момент, результате время одновременности для всех животных, даже среди партий яиц производится в разное время. Мы советуем использовать лаборатории штамм ГРЗ для выполнения экспериментов экспозиции. Этот штамм выполняет также в лабораторных условиях, гомозиготных (за исключением половых хромосом) и геном является хорошо характеризуется10,11.
В экотоксикологических исследований важно выбрать соответствующий диапазон концентраций теста. Несколько дополнительных методов может использоваться для этой цели. Диапазон номинальной концентрации могут быть основаны на чувствительность смежных видов, таких как Nothobranchius guentheri12. Кроме того диапазон может быть основан на чувствительности моделей стандартных рыб, таких как данио рерио (Danio рерио)2 , которые имеют сопоставимые чувствительность для большинства ядовитых веществ (Филипп et al. (в обзоре)). В сочетании с обоими из этих вариантов диапазон поиска эксперимента должны проводиться для выбора диапазона Номинальная концентрация. Для острого тестирования, исследователи должны быть направлены для лечения концентрация с 100% смертности, промежуточные и 0% смертности после 24 часов воздействия токсикант. Для хронической тестирования, желательно для запуска диапазон поиска эксперимент на две недели, чтобы проверить, если личинок смертности в состоянии с самых высоких концентраций теста не превышает 10% за этот отчетный период.
Протокол может служить в качестве основы для выполнения острого и хронического воздействия загрязнителей, переносимых водой на N. furzeri, изучения потенциальных последствий стресса на индивидуальных и клеточном уровне. Он также может использоваться для выполнения исследований многолетних стрессор для размещения выше экологической значимости, смешивания различных токсичных соединений или изучая интерактивные эффекты между загрязнением и другие природные раздражители (например хищничества) или антропогенных стресс (например потепление вследствие изменения климата).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь были утверждены Комитетом по этическим KULeuven.
1. штриховки и общего обслуживания N. furzeri
- Подготовить рыбу средних (рН 7) при температуре 14 ° C и добавить очищенной воды типа II, добавлены стандартизированные солями, проводимость 600 мкСм/см (24 ° C).
- Выберите яйца от линии Лаборатория ГРЗ (гона-летящего-Чжоу), которые были сохранены при стандартных условиях13. Выберите яйца в DIII стадии (т.е. готовы люк), узнаваемые наличием Золотой глаз9 и аккуратно их передачи с мягкой парой пинцетов пластичный бак 2 Л (не более чем приблизительно 30 яиц в бак).
Примечание: Для того чтобы иметь достаточное количество здоровых тест организмов, Люк дважды как много яиц, как количество требуемых мальков. - Добавить 1 см рыба средних 12 ° c и пусть температуру воды постепенно сходятся к комнатной температуре (24 ° C)9. Рыбы будут люк в течение первых 12 ч.
- После 24 часов, кормить молодь концентрированной дозы недавно вылупившиеся Artemianauplii (для более подробно на частоту и количество пищи, обратитесь к протоколу размножения Polačik et al. 20169) и увеличить глубину воды до 5 см, Добавление средних рыб.
- После 36 h кормить молодь другой концентрированной дозы недавно вылупившиеся науплий артемии и добавить рыб среднего увеличить глубину до 10 см.
- Инкубировать рыбы контейнерами (например в инкубатор, климат номер или ванна с подогревом воды) в условиях постоянной температуры под h 14 h:10 свет: Темный режим.
- Перед началом эксперимента сложные рыбы контейнеров (без рыбы) с воздействием комплекса, заполнения их с самой высокой концентрацией воздействия среды и оставить его на ночь для того, чтобы ограничить передачу токсикантов в контейнер в фактическом эксперимент.
- 48 ч после вылупления, выбрать Здоровое оживление личинки начать эксперимент экспозиции. Отказаться от так называемого живот ползунки, которые не смогли заполнить их пузырь и следовательно имеют нарушение плавучести (непрерывно опускаться на дно).
2. краткосрочные экспозиции протокол
Примечание: Исследователи должны стремиться по меньшей мере 20 реплицирует (20 рыб в отдельных банках) за лечение. В дополнение к полный контроль лечения растворителя управления должны быть включены, если раствор смеси подготовлен с помощью растворителя. Растворителя управления должен содержать количество растворителя, равная растворителя концентрация в самую высокую концентрацию воздействия.
- Подготовьте экспериментальный контейнеры (0,5 Л стеклянных банок), снабдив их и заполнения их с соответствующей экспозиции среднего (различные токсиканта концентрации). Добавьте соединение для получения правильной концентрации.
- Переноса личинок (48 ч после вылупления) индивидуально в контейнеры (1 рыбы в контейнер для индивидуального мониторинга).
Примечание: Рыбы подвергаются индивидуально для сведения к минимуму потенциальных смешанные последствия социального взаимодействия, таких как конкуренция за питание и агрессии. Однако визуально взаимодействовать в соответствии с этическими стандартами для использования лабораторных животных разрешается рыба. - Последующие этот острого воздействия продолжительностью до 2 недель. В это время кормить рыб ad libitum с науплий артемии два раза в день, 7 дней в неделю.
- Обновление среды каждый день для поддержания качества воды и сведения к минимуму потенциальных последствий составных деградации. Мониторинг ключевых воды переменных (растворенного кислорода должна превышать 80%, проводимость должна варьироваться между 600 и 700 мкСм/см, рН между 7,8 и 8.2 и твердость (как СаСО3) между 350 и 450 мг/Л, которая находится в пределах оптимальных условий выращивания 9 н. furzeri ). Взять пробы воды до и после обновления среды для определения фактической составные концентрации.
- Конечные точки
- Проверка рыбы для смертности, стресс (например аберрантное поведение: плавание вниз) или болезни ежедневно (утро, вечер). Обратитесь к публикации Шедда и др. (1999) 12 сведения о наблюдении за смертности, стресса или болезни.
- Рассчитать LC50 значения основаны на смертность, с использованием доза реакция кривых (Ритц и Streibig, 2005) в разное время точках. Используйте функцию drm в пакете ДРК в v3.2.3 R (R развития Core Team, 2016) или аналогичных статистических подходов.
3. хронического воздействия протокол
Примечание: Цель как минимум 25 рыбы/состояние в начале эксперимента, чтобы свести к минимуму шансы перекос соотношения полов и для размещения потенциальных фон смертности от естественных причин (т.е. Возрастная смертность).
- Инкубационные (см. раздел 1)
- Этап I (2 дней после вылупления-16 дней после вылупления)
- Следовать протоколу, как описано в 2.1-2.4
- Как на втором этапе эксперимента, носитель будет деградировать на протяжении недели (не буфет, см. ниже). Храните необходимое количество среднего за неделю в больших контейнерах инертным для того, чтобы разрешить подобные деградации соединения.
- Этап II (16 дней после вылупления-конец)
- Приготовить 2 Л экспериментальной стеклянные баночки, комплексообразующие их с территории комплекса. Заполнить банки с правильной экспозиции среднего и добавить воздушную трубку для аэрации банку. Рыба в дом индивидуально в этих банках на оставшуюся часть эксперимента. Возможность визуального взаимодействия для размещения этических стандартов.
- Обновление среды один раз в неделю. Рыба с чистой передать новый jar, содержащий же среднего воздействия. Взять пробы воды каждый день на протяжении недели для мониторинга деградации комплекса в каждом лечения концентрация. Вычислить, что деградация кривую для каждого лечения, если несколько стресс тестирование (например , токсичность комплекса в различных температурных режимов). Мера абиотических параметров (рН, температура, % растворенного кислорода, проводимость) три раза в неделю.
- От 2 дней после вылупления (dph) до 23 dph корма рыбы два раза в сутки, 7 дней в неделю науплий артемии ad libitum . От 24 dph - 37 dph, дополняют объявление libitumArtemia диета с нарезанным Chironomus личинки. От 38 dph на корма рыбы два раза в сутки, 7 дней в неделю Ад Либитум замороженные Chironomus личинки.
- Конечные точки
- Ежедневно проверяйте рыбы для12смертности, стресса или болезни.
- Для определения роста, измерьте размер тела на еженедельной основе (9 dph - 16 dph - 21 dph -...) путем передачи рыбы на чашку Петри, наполненный среднего от их водохранилище. 4-5 размер калиброванные фотографии рыбы сверху (на фиксированную высоту) и анализировать их цифровой подписью с использованием пространственного измерения программы (например ImageJ).
Примечание: Для взрослых рыб, используйте выше Петри блюдо для сведения к минимуму обработку стресс, сохраняя все рыбы, погруженной в течение всего процесса измерения. - Для мужчин созревания осмотрите рыбы ежедневно для окраски от 15 dph года. Проверьте лопасти для первые признаки брачного цветностью (вторичные сексуальные характеристики). Используйте в первый день, на котором это видно как прокси для мужчин созревания время.
- Пара-сексуальны рыбы с мужчины той же группы лечения или не экспериментальный мужчин три раза в неделю с 30 dph начиная с тем, чтобы определить время женщины созревания (в день сдачи первое яйцо). Для этого используйте описанные в 3.4.5 нереста протокол.
- Для плодовитости, пара Зрелые самки с пожилые мужчины 3 раза / неделя с 30 dph, в пределах их лечения с использованием схемы пересечения.
- Подготовить нереста танк (1 Л) для каждой пары, с использованием среднего воздействия от мужской аквариум, дополнена нереста субстрата (мелкий песок < 500 мкм).
- Передача мужское и женское в нерестовый бак и позволяют им икру на два часа. Свести к минимуму человеческой деятельности или помеха вокруг нереста контейнеров в ходе этого процесса.
- После этого аккуратно передачи рыбы обратно в их оригинальный корпус контейнеров, без ненужных смешивания воды, которая будет кружиться вверх яйца в Нерестовый субстрат.
- Отфильтруйте яйца, поливая Нерестовый субстрат над сеткой 500 мкм. Количество яиц и передавать их (с помощью мягкой пинцет) на влажный торф верховой кипованный в Петри9,14.
- Удалите мертвые яйца ежедневно. После того, как в неделю, печать Петри блюдо с пленки для запайки и хранить его в температуре контролируемых инкубатор на 28 ° C и в 14:10 h свет: темные цикла для немедленной разработки к этапу DIII (т.е. готовы люк после примерно трех недель). Для длительного хранения Храните яйца в 17 ° C в постоянной темноты на которой яйца Фаза покоя и оставаться жизнеспособным в течение нескольких лет. При наборе рыбы из этих спящих яйца для экспериментов, передать условий 28 ° C с 14:10 h свет: темные цикла примерно на три недели для разработки к этапу DIII спящие яйца.
- Измерьте критических тепловой максимальный (CTmax) (мера производительности15) взрослых рыб.
- Использовать ванну с водой, который подогревается с постоянной скоростью 0,33 ° C/мин и в которых непрерывно циркулирует вода. Добавьте несколько 1 Л аквариумов для каждого индивидуального рыбы.
Примечание: Учитывая ограничения пространства на водяной бане, это необходимо для работы в нескольких серий. При выполнении статистического анализа, включив «серии» как случайный фактор следует учитывать потенциальные различия в условиях между серии. - Начало судебного разбирательства путем добавления рыб в аквариум, когда вода в аквариуме достиг экспериментального выращивания температуры рыбы (как правило 28 ° C). Мониторинг температуры в 1 Л аквариумов CTmax ванны каждые 5 мин с использованием цифровой термометр (0,1 ° C шкала).
- Конце судебного разбирательства, когда рыба не удается поддерживать dorso вентрально вертикально или начинает дергаться сильно16,17. Измерение температуры в 1 Л аквариум, который является критическим максимальная температура. Передача рыбу обратно в его экспериментального жилья для восстановления.
- Использовать ванну с водой, который подогревается с постоянной скоростью 0,33 ° C/мин и в которых непрерывно циркулирует вода. Добавьте несколько 1 Л аквариумов для каждого индивидуального рыбы.
- Измерения веса (с точностью до 0,1 мг) рыбы в последний день эксперимента, погладив ее сухой и передачи его на лодке взвешивания. Примечание: Вся рыба должна измеряться четыре часа после последнего кормления стандартизировать вес пищи в желудочно-кишечном тракте.
- Усыпить рыбы с использованием 0,1% Tricaine.
4. следующим воздействия протокол
Примечание: Для измерения следующих воздействия загрязнителей на N. furzeri, следуйте хронического воздействия протокола, изложенные выше для первого поколения.
- Два раза в неделю, проверьте развитие производства яиц (т.е. Второе поколение) хранится на 28 ° C 14:10 h свет: темные условия цикла, проверяя Петри для эмбрионов в фазе DIII (см. Polačik и др. 92016). Когда более чем 50 реплицирует каждого родительского обращения полностью развиты, Люк их после протокол 1.1.
- Разоблачить здорового, динамичного рыбы set-up и лечения как родительский рыбы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Результаты острого воздействия N. furzeri различных концентраций меди, рассчитывается как 2.5.2, показать cleardose-реакция (рис. 1). Существует увеличение смертности с увеличением концентрации токсиканта. LC50 значения уменьшаться с течением времени, что означает, что с уменьшением концентрации, больше времени проходит до 50% реплицирует умирают. Подробные результаты на острые и хронические воздействия N. furzeri меди, а также сравнение видов чувствительности, по сравнению с другими видами мы ссылаемся на Филипп et al. 20177.
Хронического воздействия на суда размер тела и плодовитость, чувствительные. Там может быть обширные изменения в росте рыбы, в зависимости от температуры18. Взрослых размеров между 30 и 50 мм считается нормальным в этой настройке. Настройки позволяют находить различия между процедурами (рис. 2A). В assay хронического воздействия, с использованием водного меди, было существенное влияние меди воздействия во время недели три (χ²5,34 40,7, P = < 0,001), с N. furzeri подвергается 19.38 мкг/Л Cu, меньше, чем все другие рыбы (все P < 0,001) (рис. 2B). Для плодовитости значения элементов управления должен колебаться между около 50 яиц в неделю девушки на пике яйцо производства7. В другом эксперименте с использованием водного хлорпирифос и повышение температуры на 2 ° C, мы нашли существенного взаимодействия между ростом и хлорпирифос воздействием температуры на плодовитость (χ22 202 25,3, P = < 0,001). На 28 ° C, рыбы, подвержены 4 мкг/Л производится меньше яиц, по сравнению с рыбы подвергаются 2 мкг/Л и управления рыбы (оба P < 0,001) (рис. 2B). При 30 ° C, управления рыбы производится больше яиц, по сравнению с всех хлорпирифос подвергаются рыбы (оба P < 0,007). Основной эффект воздействия хлорпирифос (χ22 202 96,8, P = < 0,001) и основной эффект температуры (χ21202 = 10,18, P < 0,001) значительно сократила плодовитость. Измерение является довольно много времени из-за обработки рыбы и обшивка яйца на торф9, но это часто наиболее чувствительных конечной точки.
Время созревания чаще всего пострадавших от загрязняющих веществ у мужчин. Мужчины созревания время значительно пострадал от хронического воздействия водного хлорпирифос (χ22,41 = 11.79, P = 0,003), с мужчины подвержены 4 мкг/Л СПЛ (C2) с 18% медленнее созревания, по сравнению с управления мужчины (рис. 3A ). Этот ответ следует, однако, интерпретироваться с осторожностью, так как время созревания забил косвенно путем определения наступления брачного окраски как прокси. Хотя мужчины считаются пожилые через несколько дней после появления окраски9, могут существовать некоторые ошибки на точные сроки созревания, используя эту меру.
Вблизи тепловой максимальный рыба экспонат неустойчивой плавание, увеличение opercular движение и потере способности оставаться в dorso вентрально вертикальном положении 16,17. CTmax значения отличаются между н. furzeri штаммов. Природных популяций имеют значения CTmax 39 ° C до 42 ° C при выращены в температурах между 24 и 28 ° C (рисунок 3B). Инбредных деформации ГРЗ, однако, уже достигает максимума тепловой примерно 37-38 ° c, даже когда выращенные на 28 ° C. Эта процедура не является смертельным для рыбы, в то время как редкие случаи смертности происходят. Такая рыба лучше всего исключены из CTmax анализа, поскольку они скорее представляют собой рыб, которые находятся в относительно плохом состоянии общий.
Предыдущие результаты, главным образом показали, что CTmax могут быть затронуты загрязнителей, в этом случае, 3,4-DCA (χ22,7117.65, P = < 0,001) с рыбой подвержены 0,1 мг/Л 3,4-DCA 0,32 ° C ниже Максимальная тепловая по сравнению с управления рыбы (P < 0,001). Кроме того, CTmax было пострадавших от температуры воспитании (χ21,71322.0, P = < 0,001) и рыбы, которые были выращены на 28 ° C 1.3 ° C выше CTmax по сравнению с рыбы, воспитывались в 24 ° C.
Рисунок 1: кривая доза ответ для меди экспозиции. Доза реакция кривых показаны совокупные смертности Nothobranchius furzeri в функции концентрация меди воздействия (мкг/Л Cu и по отношению к времени экспозиции). Точки обозначают LC50 значений. Эта цифра была изменена от Филипп et al. 20172. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: влияние на размер и плодовитость как конечные точки. A) размер (в см) Nothobranchius furzeri подвергается воздействию различных концентраций меди на неделю 3, 7, 11 и 15. Звездочка указывает, что C5 рыбы меньше после трех недель на уровне значимости P < 0,05. Значения представлены как средний ± SEM. образца размеры, n = 6; 6; 7; 7; 7; 7 в неделю 3, n = 6; 6; 7; 7; 4 в неделю 7, n = 5; 4; 5; 5; 3 недели 11 и n = 5; 3; 3; 5; 2 в неделю 15. B) плодовитость через время рыбы, воздействию различных концентраций хлорпирифос, пересекается с двумя температуры лечения, измеряется как число яиц в неделю. Чтобы улучшить читаемость и интерпретируемость фигуры, погрешностей не показаны на графиках. Количество женщин в каждом лечения в начале и в конце периода откладки указывается с помощью буквы 'n'. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: влияние на время созревания и CTmax. A) средний возраст (в днях), в котором появились первые признаки окраски самцов Nothobranchius furzeri подвергается различным хлорпирифос концентрации (0 мкг/Л (C0), 2 мкг/Л (C1) и 4 мкг/Л СПЛ (C2)) и две температуры (28 ° C и 30 ° C). B) среднее критических тепловой максимальный (CTmax) рыбы, воздействию различных концентраций 3,4-DCA (0 мг/Л 3,4-DCA (C0), 3,4-DCA 0,05 мг/Л (C1) и 0,1 мг/Л 3,4-DCA (C2)) и две температуры (24 ° C до 28 ° C). Номинальная концентрация представлены как среднее значение ± SE. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта работа описывает новый биопроб, используя Nothobranchius furzeri, новые модели организма, для изучения личности и комбинированные долгосрочные последствия токсикантов и другие раздражители. Представлены протоколы были успешно применяется для измерения чувствительности видов ядовитых веществ (медь, кадмий, 3,4-dichloroaniline и хлорпирифос) в массив. Из-за его быстрого жизненного цикла эта позвоночных модель позволяет для оценки сублетальных и следующих эффектов в течение четырех месяцев. Другое главное преимущество использования этого вида рыб как модель для проверки токсичности является тот факт, что она производит засухоустойчивых яйца. Это позволяет исследователям хранить яйца или получить их от поставщика и устраняет необходимость в дорогостоящие и трудоемкие культуры на территории отеля. Кроме того эмбрионы можно хранить на протяжении нескольких лет до тех пор, пока молодь являются необходимой12.
После изучения чувствительности N. furzeri ряда токсикантов ссылка, мы можем добавить, что чувствительность видов находится в диапазоне с, или модели выше, чем у других видов, в зависимости от испытания комплекса. Измерения воздействие на плодовитость, в частности, может увеличить сопоставимости чувствительности на изученных видов, как это обычно измеренных конечной точки в других видов модели. Наконец степень которой несколько раздражители оказывают неблагоприятные последствия, когда осуществляется индивидуально или в сочетании, зависит от вычисленного конечной точки и концентрация воздействия.
Есть еще некоторые ограничения при работе с N. furzeri. Одним из наиболее важных ограничений является стандартизация пищевых продуктов. Партии артемии или bloodworms могут отличаться по качеству и может таким образом, влияют на результаты исследования. Поэтому рекомендуется заказать большую партию продовольствия для использования в течение всей длине эксперимента.
Мы считаем, что этот протокол широко применяется для экотоксикологических скрининга. N. furzeri стремительно развивается в стандартный тест видов в экотоксикологии. Наличие этого стандартного протокола может топлива его создания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы признательны группе сфере UAntwerpen и Департамента защиты культур Ugent для анализа проб воды. Была оказана поддержка в ходе этого проекта центр передового опыта ' Эко и социально Эволюционная динамика (PF/10/007) ку Лёвен научный фонд. AFG (11Q0516N) и ESJT (FWO-SB151323) финансировались как докторских и ТП (12F0716N) как после защиты докторской диссертации по FWO Фландрии (Fonds Wetenschappelijk институте).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| purified water Type 1 (milli Q) | Millipore | ||
| Sea Salt | Instant Ocean | ||
| 2L plastic tank | SAVIC | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 1L plastic tank (spawning) | Avamoplast | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| nets | Aqua bilzen | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 2L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 0,5L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| Artemia eggs | Ocean Nutrition | ||
| chironomus | Ocean Nutrition | frozen | |
| tricaine | Sigma aldrich | ||
| petri dishes | VWR | ||
| Parafilm | VWR | ||
| pipettes | MLS | ||
| tweezers | FST | ||
| 500 µm mesh sieve | / | self-made | |
| microcentrifuge tube (2ml) | BRAND | To store fish in freezer | |
| glass vials | Sigma aldrich | For water analysis | |
| weighing boat | MLS | ||
| Jiffy 7c pellets | Jiffy | ||
| water bath | Gilac | for Ctmax | |
| liquid nitrogen | Air liquide | ||
| digital thermometer | Testo AG | testo 926 | |
| HETO therm heater | Anker Schmitt | ||
| calibrated balance | Mettler-Toledo AG | ||
| camera | / | ||
| platform for camera | / | self-made | |
| Multiparameter kit | HACH | ||
| Freezer (-80°C) | Panasonic Ultra low temperature freezer | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fysio | |||
| homogenisation buffer | VWR | 0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100 | |
| chloroform:methanol | Sigma Aldrich | ||
| glyceryl tripalmitate | Sigma Aldrich | ||
| amyloglucosidase | Sigma Aldrich | A7420 | |
| glucose assay reagent | Sigma Aldrich | G3293 | |
| Biorad protein dye | VWR | ||
| 96-well microtiter plate | Greiner Bio-one | ||
| 384 microtiter plates | Greiner Bio-one | ||
| 2 ml glass tubes | Fiers | For fat analysis | |
| 2,5ml eppendorf tubes | VWR | ||
| homogeniser | Ultra-turrax TP 18/10 | ||
| photospectrometer | Infinite M200 TECAN | ||
| heater for glass tubes | Hach COD REACTOR | ||
| centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5415 R | ||
| Incubator | Bumako |
References
- European-Chemicals-Bureau. TAPIR Three point three-A Project for the Information Requirements of REACH. Final Report-2 August 2005. Scoping study on the development of a Technical Guidance Document on information requirements on intrinsic properties of substances (RIP 3.3-1). , (2005).
- Philippe, C., et al. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , 26-35 (2017).
- Noyes, P. D., Lema, S. C. Forecasting the impacts of chemical pollution and climate change interactions on the health of wildlife. Current Zoology. 61 (4), 669-689 (2015).
- Consommateurs, S. S. d Health & Consumer Protection Directorate-General European Commission. 4, Brussels (BE). SANCO/3268/2001 rev. 4 (final) (2002).
- Commission, E. E. Guidance document on aquatic ecotoxicology. Under Council directive 91/414/EEC. SANCO/3268/2001 Rev 4. 2002b. , (2002).
- EPA. Ecological Effects Test Guidelines, OPPTS 850.1500 Fish life cycle toxicity. , Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-07/documents/850-1500.pdf (1996).
- Philippe, C. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , (2017).
- Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future. Aquatic Toxicology. 78 (1), 91-102 (2006).
- Polačik, M., Blažek, R., Reichard, M. Laboratory breeding of the short-lived annual killifish Nothobranchius furzeri. Nature Protocols. 11 (8), 1396-1413 (2016).
- Reichwald, K., et al. Insights into Sex Chromosome Evolution and Aging from the Genome of a Short-Lived Fish. Cell. 163 (6), 1527-1538 (2015).
- Valenzano, D. R., et al. The African Turquoise Killifish Genome Provides Insights into Evolution and Genetic Architecture of Lifespan. Cell. 163 (6), 1539-1554 (2015).
- Shedd, T. R., Widder, M. W., Toussaint, M. W., Sunkel, M. C., Hull, E. Evaluation of the annual killifish Nothobranchius guentheri as a tool for rapid acute toxicity screening. Environ. Toxicol. Chem. 18 (10), 2258-2261 (1999).
- Platzer, M., Englert, C. Nothobranchius furzeri: a model for aging research and more. Trends Genet. 32 (9), 543-552 (2016).
- Watters, B. The ecology and distribution of Nothobranchius fishes. J Am Killifish Assoc. 42, 58-61 (2009).
- Op de Beeck, L., Verheyen, J., Stoks, R. Competition magnifies the impact of a pesticide in a warming world by reducing heat tolerance and increasing autotomy. Environ Pollut. 233, 226-234 (2018).
- Patra, R. W., Chapman, J. C., Lim, R. P., Gehrke, P. C. The effects of three organic chemicals on the upper thermal tolerances of four freshwater fishes. Environ. Toxicol. Chem. 26 (7), 1454-1459 (2007).
- Beitinger, T. L., Bennett, W. A., McCauley, R. W. Temperature tolerances of North American freshwater fishes exposed to dynamic changes in temperature. Environ Biol Fishes. 58 (3), 237-275 (2000).
- Cellerino, A., Valenzano, D. R., Reichard, M. From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology. Biological Reviews. , (2015).
