Summary
在这项工作中, 我们描述了一种急性, 慢性和几代生物测定, 以研究单一和联合压力源对绿松石鳉鱼Nothobranchiusfurzeri 的影响。本协议旨在研究生命史特征 (死亡、生长、繁殖力、体重) 和临界热最大值。
Abstract
鳉鱼Nothobranchius furzeri 是生态领域新兴的模型有机体, 它在急性和慢性毒性试验中的适用性已经证明。总体而言, 该物种对有毒化合物的敏感性与其他模型物种的敏感程度相同。
这项工作描述了对furzeri的单一和联合应激作用的急性、慢性和几代生物鉴定的协议。由于它的成熟时间短和生命周期, 这脊椎动物模型允许研究终点, 如成熟时间和生育力在四月内。跨代全生命周期暴露试验可以在8月内进行。由于这一物种生产的鸡蛋具有抗旱性, 并且在多年内仍然可行, 所以不需要这种物种的现场养殖, 但在需要时可以招募个人。这些协议旨在测量生命历史特征 (死亡率、生长、繁殖力、体重) 和临界热最大值。
Introduction
将一组物种的敏感度配置为战略性地选定的毒物被描述为欧洲范围立法 (注册、评估、授权和限制化学品) 的1 。急性或短期毒性试验主要用于这一目的, 因为它们给出了一个物种的敏感性的快速迹象。然而, 在它们的自然环境中, 生物体暴露在较长的时间内, 而完整的生命周期, 甚至几代可能会影响到2。此外, 受污染环境中的有机体通常会一次暴露于多个压力源, 这可能相互作用, 可能导致协同效应3。因此, 基于急性单源压力毒性试验计算的安全浓度可能低估了有毒物质在自然环境中的实际风险。因此, 最好还要研究欧洲委员会4、5和环保局 (联合致死) 所倡导的与环境有关的有毒物质的长期和几代效应。国家环境保护局)6,7。特别是在脊椎动物的研究中, 由于脊椎动物的寿命比无脊椎动物模型生物体长, 所以在从事慢性和几代人的暴露研究时, 劳动力、金钱和时间方面的成本很高。因此, 根据研究的问题, 选择最合适的鱼类模型有机体是可取的。此外, 还应提供广泛的脊椎动物种类, 以检验跨物种的反应的普遍性, 以便能够根据最敏感的物种来调整规章。目前, 有必要制定新的、有效的协议, 以短寿命周期为特征的脊椎动物模型物种, 以降低在脊椎动物身上进行慢性和多代暴露的成本7,8。
绿松石鳉鱼Nothobranchius furzeri 是一个有趣的鱼模型, 用于这种长期暴露实验, 因为它的成熟时间短和生命周期 (生成时间少于4周 9).这意味着与其他鱼类模型7相比, 可以在短时间内研究与生态相关的终点, 如成熟时间和繁殖力。此外, 这些鱼生产抗旱的休眠蛋, 在标准条件下储存数年后仍然可行, 从而消除了对连续养殖的需要9。在生态的研究中, 这也意味着复制鱼可以在完全相同的时刻孵化, 导致所有动物的时间同步, 甚至在不同时间生产的鸡蛋批次中。我们建议使用实验室 GRZ 应变进行暴露实验。这种菌株在实验室条件下表现良好, 是纯合的 (除了性染色体), 基因组的特征很好10,11。
在生态研究中, 选择合适的测试浓度范围是很重要的。为此, 可以使用几种互补方法。标称浓度范围可以基于相关物种的灵敏度, 如Nothobranchius guentheri12。或者, 该范围可以基于标准鱼模型的灵敏度, 如斑马鱼 (斑马斑马)2 , 对大多数毒物具有可比性的敏感性 (菲利普et 。(回顾))。结合上述两种选择, 应进行范围发现实验, 选择标称浓度范围。对于急性试验, 研究人员应瞄准100% 的死亡率, 中间死亡率和0% 的死亡后24小时接触毒物的浓度治疗。对于慢性试验, 最好在两周内进行范围发现实验, 以验证在这个参考期内, 测试浓度最高的条件下的幼虫死亡率是否不超过10%。
该议定书可以作为基线, 在furzeri上对水上污染物进行急性和长期接触, 检查压力源在个体和细胞层面的潜在影响。它还可用于执行多源压力研究, 以适应更高的生态相关性, 混合不同的有毒化合物或研究污染与其他自然压力源 (例如捕食) 之间的交互作用或人为压力源 (例如因气候变化而变暖)。
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Protocol
这里描述的所有方法都得到了 KULeuven 伦理委员会的批准。
1. furzeri的孵化和一般维护
- 准备鱼培养基 (pH 值 7), 温度为14摄氏度, 并加入纯化型 II 水, 加标准化盐, 电导率为600µS/厘米 (24 摄氏度)。
- 从已存储在标准条件13下的 GRZ 实验室线中选择鸡蛋。选择 DIII 阶段的鸡蛋 (即准备孵化), 可识别的金色眼睛9 , 并轻轻地把它们与软镊子对塑料 2 L 坦克 (不超过大约30鸡蛋每罐)。
注: 为了有足够数量的健康测试有机体, 孵化两次尽可能多的卵作为所需的鱼幼虫数量。 - 添加1厘米的鱼培养基在12摄氏度, 让水温逐渐收敛到室温 (24 °c)9。鱼将孵化在前12小时。
- 24小时后, 喂养幼仔一种浓缩剂量的新鲜孵化的Artemianauplii (有关食物频率和数量的详细信息, 请参阅 Polačik et 等) 的育种协议 20169), 并将水深提高到5厘米添加鱼培养基。
- 36小时后, 喂养幼仔另一种浓缩剂量的新鲜孵化的卤虫幼体和添加鱼培养基, 增加水深到10厘米。
- 在恒温条件下孵化鱼容器 (例如在孵化器、气候室或温水浴中) 在 14 h:10 h 灯以下: 黑暗政权。
- 在实验开始之前, 复杂的鱼容器 (没有鱼) 与暴露化合物, 填充他们的最高浓度的接触介质, 并留在一夜之间, 以限制转移有毒物质的容器在实际实验。
- 48小时孵化后, 选择健康的浮力幼虫开始接触实验。放弃所谓的肚皮滑块, 无法填满他们的游泳膀胱, 因此有一个受损的浮力 (持续下沉到底部)。
2. 短期曝光协议
注: 研究人员应针对每项治疗至少20次复制 (20 条鱼在单独的罐子里)。除完全控制处理外, 如果用溶剂制备该化合物的溶液, 则应包括溶剂控制。溶剂控制应包含在最高接触浓度中溶剂浓度的溶剂量。
- 将实验容器 (0.5 升玻璃罐) 贴上标签, 用适当的曝光介质 (不同的毒物浓度) 填充。添加化合物以获得正确的浓度。
- 将幼虫 (48 小时孵化后) 分别转移到容器 (每容器1条鱼进行单独监测)。
注意: 鱼类被单独暴露, 以尽量减少社会互动的潜在混淆效应, 例如对食物和侵略的竞争。然而, 鱼被允许视觉上的互动, 根据道德标准的实验室动物使用。 - 随访2周以上的急性暴露。在这段时间里, 用卤虫幼体每天两次喂鱼ad 随意, 每星期7天/周。
- 每隔一天刷新培养基以维持水质, 并尽量减少复合降解的潜在影响。监测关键水分变量 (溶解氧水平应超过 80%, 电导率应介于600和700µS/厘米之间, pH 值介于7.8 和8.2 之间, 硬度 (如碳酸钙3) 介于350和450毫克/升之间, 位于最佳饲养条件范围内。N. furzeri 9)。在刷新培养基之前和之后取水样品, 以确定实际的复合浓度。
- 端点
- 检查鱼的死亡率, 压力 (例如反常行为: 游泳颠倒) 或疾病每天 (上午, 晚上)。查阅谢德et的发布。(1999)12了解有关死亡率、压力或疾病的观察的详细信息。
- 使用剂量-响应曲线 (丽思和 Streibig, 2005) 在不同的时间点计算 LC50值。使用 r v3.2.3 (r 开发核心团队, 2016) 中的刚果民主共和国包中的drm函数或类似的统计方法。
3. 慢性暴露协议
注: 在实验开始时, 至少瞄准25条鱼/条件, 以尽量减少性别比例偏倚的几率, 并考虑自然原因导致的潜在背景死亡率 (i. e. 与年龄有关的死亡率)。
- 孵化 (见1节)
- 第一阶段 (孵化后2天-孵化后16天)
- 按照 2.1-2.4 所述的协议执行
- 在实验的第二阶段, 培养基会在一周内降解 (没有茶点, 见下文)。将所需的介质在大型惰性容器中存放一周, 以允许化合物的类似降解。
- 第二阶段 (孵化后16天)
- 通过与化合物络合, 制备2升实验玻璃罐。用正确的曝光介质填充罐子, 并添加一个空气管通气罐子。在这些罐子里单独的把鱼放在实验的其余部分。允许视觉交互以适应道德标准。
- 每星期刷新一次介质。将鱼与网转移到含有相同曝光介质的新罐子上。在每一周内每天抽取水样来监测化合物在每次浓度处理过程中的降解情况。如果测试多个压力源 (例如在不同温度下的化合物的毒性), 则计算每种处理的降解曲线。测量非生物参数 (pH 值, 温度, 溶解氧%, 电导率) 每周三次。
- 从孵化后2天 (dph) 直到 23 dph, 每天喂鱼两次, 每周7天, ad 随意卤虫幼体。从 24 dph-37 dph, 补充ad libitumArtemia饮食与切碎的摇幼虫。从 38 dph, 每天喂鱼两次, 每周7天, ad 随意冷冻摇幼虫。
- 端点
- 每日检查鱼的死亡率, 压力或疾病12。
- 为了确定生长, 每周测量身体大小 (9 dph-16 dph 21 dph-...) 通过把鱼转移到从他们的水库中填充培养基的培养皿中。采取 4-5 大小校准图片的鱼从上面 (在一个固定的高度) 和分析他们数字使用空间测量程序 (例如ImageJ)。
注: 对于成年鱼, 使用更高的培养皿, 以尽量减少处理压力, 保持所有的鱼淹没在整个测量过程中。 - 对于男性成熟, 视觉检查鱼每天的着色从 15 dph 起。检查鳍的第一个迹象, 婚礼着色 (第二性特征)。使用第一天, 这是可见的作为一个代理的男性成熟时间。
- 夫妇非奸鱼与男性相同的治疗组或非实验性男性每周三次从 30 dph 开始, 以确定女性成熟时间 (第一个卵子的一天)。为此, 请使用3.4.5 中描述的产卵协议。
- 对于生育力, 夫妇成熟的女性与成熟男性3次/周从 30 dph 开始, 在他们的治疗使用交叉计划。
- 为每对夫妇准备一个产卵池 (1 升), 使用暴露培养基从男性水族馆补充产卵基质 (细砂 < 500 µm)。
- 将雄性和雌性转移到产卵池中, 让它们产卵两个小时。在此过程中尽量减少产卵容器周围的人类活动或干扰。
- 然后, 将鱼轻轻地转移回原来的外壳容器, 不需要水的混合, 这将会在产卵基质中旋转卵。
- 通过在500µm 网格上浇产卵基板来过滤卵。计数的鸡蛋和转移 (使用软镊子) 潮湿泥炭苔藓在培养皿中9,14。
- 每天清除死卵。一个星期后, 密封的培养皿与密封膜, 并存储在一个温度控制孵化器在28摄氏度和14:10 小时的光: 黑暗循环, 立即发展到 DIII 阶段 (即准备孵化后约三周)。长期贮存时, 将卵存放在17摄氏度的恒定黑暗中, 卵子进入休眠阶段, 并保持多年存活。当从这些休眠卵子中招募鱼类进行实验时, 将休眠的卵转移到28°c 条件, 14:10 小时光: 黑暗周期约三周, 以允许发展到 DIII 阶段。
- 测量成年鱼的临界热最大值 (CTmax) (用于性能15的度量值)。
- 使用水浴, 以恒定的速度加热0.33 摄氏度/分钟, 并在其中的水不断循环。为每条鱼加1升水族馆。
注: 给定的空间限制在水浴, 有必要在几个系列工作。通过将 "系列" 作为随机因素进行统计分析时, 应考虑系列中条件之间的潜在差异。 - 当水族馆的水达到实验饲养温度 (一般为28摄氏度) 时, 将鱼加入水族馆, 开始试验。使用数字温度计 (0.1 摄氏度) 监测 CTmax 浴1升水族馆中的温度每5分钟。
- 当鱼无法保持 dorso 腹部直立位置或开始严重抽搐16,17时, 结束试验。测量 1 L 水族馆的温度, 这是临界最大温度。把鱼转回到实验房里恢复。
- 使用水浴, 以恒定的速度加热0.33 摄氏度/分钟, 并在其中的水不断循环。为每条鱼加1升水族馆。
- 在实验的最后一天测量鱼的重量 (0.1 毫克的准确度), 拍干并把它转移到一艘称量船上。注: 所有鱼类应在最后一次进食后四小时测量, 以规范肠道内的食物重量。
- 用 0.1% Tricaine 弄死鱼。
4. 跨代曝光协议
注: 要测量污染物对furzeri的跨代影响, 请遵循上文概述的第一代的慢性暴露协议。
- 每周两次, 检查生产的鸡蛋 (即第二代) 的发展, 储存在28°c 14:10h 光: 黑暗的周期条件通过检查培养皿的胚胎在 DIII 阶段 (见 Polačik et 等。20169)。当50多项父母治疗的复制被充分开发时, 在1.1 中根据该协议孵化他们。
- 将健康的、浮力的鱼暴露在与父母鱼完全相同的设置和治疗中。
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Representative Results
furzeri的严重暴露结果与不同的铜浓度 (如在2.5.2 中计算) 显示 cleardose 响应关系 (图 1)。随着毒物浓度的增加, 死亡率增加。LC50值随着时间的推移而减少, 这意味着随着浓度的降低, 50% 的复制死前会有更多的时间通过。有关furzeri对铜的急性和慢性暴露的详细结果, 以及与其他物种相比, 该物种的灵敏度比较, 我们指的是菲利普et . 20177。
在慢性暴露试验中, 身体大小和生育力是敏感的终点。在鱼的生长可能有广泛的变化, 取决于温度18。成人大小在30和50毫米之间被认为是正常的在这个设置。设置允许查找处理之间的差异 (图 2A)。在使用水性铜的慢性暴露试验中, 铜暴露在三周 (χ²534 = 40.7, P < 0.001) 中有显著影响, N. furzeri暴露于19.38 µg/升铜小于所有其他鱼类 (所有P< 0.001) (图 2B)。对于生育力, 控制值应在卵子生产高峰期的每位女性每周大约50个卵子之间波动7。在另一项实验中, 使用水性毒死蜱和2摄氏度的温度升高, 我们发现了温度升高和毒死蜱暴露在生育力之间的显著相互作用 (χ22202 = 25.3, P < 0.001)。在28摄氏度时, 暴露于4µg/升的鱼比接触2µg 和控制鱼 ( P < 0.001) (图 2B) 的鱼生产的鸡蛋少。在30摄氏度, 控制鱼生产更多的鸡蛋比所有毒死蜱暴露鱼 ( P < 0.007)。暴露于毒死蜱的主要影响 (χ22202 = 96.8, P < 0.001) 和温度的主要影响 (χ21202 = 10.18, P < 0.001) 显著降低了生育力。由于处理鱼和在泥煤9上的蛋的电镀, 测量是相当费时的, 但它通常是最敏感的端点。
成熟时间最常受到男性污染物的影响。男性成熟时间受水性毒死蜱 (χ2241 = 11.79, P = 0.003) 的长期接触影响很大, 男性暴露于4µg/升森林公积金 (C2), 与对照男性相比有18% 的缓慢成熟度 (图3A).然而, 这一反应应谨慎解释, 因为成熟时间是通过确定婚后着色作为代理而间接得分的。尽管雄性在着色9出现后几天被认为成熟, 但使用此量值的确切时间可能会出现一些错误。
在最热的最大值附近, 鱼类呈现不稳定的游泳, 增加鳃盖运动和丧失保持在 dorso 腹部直立位置 16, 17 的能力. CTmax 值在furzeri菌株之间有所不同。在温度介于24和28°c 之间 (图 3B) 中, 自然种群的 CTmax 值介于39摄氏度和42摄氏度之间。然而, 近交的 GRZ 菌株, 即使在28摄氏度时, 也已经达到了大约 37-38 摄氏度的热最大值。虽然这个程序不是致命的鱼, 罕见的死亡病例发生。这种鱼类最好排除在 CTmax 分析之外, 因为它们最有可能代表的是处于相对较差的总体状况的鱼类。
以往的结果大多表明, CTmax 可能受到污染物的影响, 在这种情况下, 34 DCA (χ2271= 17.65, P < 0.001), 鱼接触到0.1 毫克/升 34-DCA, 比控制鱼 (P < 0.32) 有0.001 摄氏度的热最大值。另外, CTmax 受饲养温度的影响 (χ2171= 322.0, P < 0.001) 和饲养在28°c 的鱼有1.3 °c 更高的 CTmax 比养殖在24°c 的鱼。
图 1: 铜暴露的剂量响应曲线.剂量-反应曲线显示了Nothobranchius furzeri在铜暴露浓度 (在µg/升铜和与暴露时间有关) 中的累积死亡率。点表示 LC50值。此数字已从菲利普et 20172中修改。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 对大小和生殖力作为端点的影响。A) Nothobranchius furzeri在3、7、11和15周暴露在不同铜浓度下的大小 (以 cm 为厘米)。星号表示, C5 鱼在三周后在 P < 0.05 的意义水平上较小。数值显示为平均值. 样本大小为 n = 6;6;7;7;7;7在星期 3, n = 6;6;7;7;4在星期 7, n = 5;4;5;5;3在星期11和 n = 5;3;3;5;2在15周。B)在接触到不同浓度的毒死蜱的鱼类时, 通过两种温度处理方法进行繁殖, 以每周的卵数来衡量。为了提高图形的可读性和解读, 在图上不显示误差线。在产卵期开始和结束时, 每种治疗中雌性的数量用字母 "n" 表示。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 对成熟时间和 CTmax 的影响。A)平均年龄 (以天为表示), 其中第一个着色标志出现在Nothobranchius furzeri暴露于不同的毒死蜱浓度 (0 µg/升 (C0) 的雄性中; 2 µg/升 (C1) 和4µg/升森林公积金 (C2)) 和两个温度 (28 °c 和30°c)。B)指暴露在不同浓度的 34-dca (0 毫克/升 34-dca (C0) 的鱼类的临界热最大值 (CTmax), 0.05 毫克/升 34-dca (C1), 0.1 毫克/升 34-dca (C2)) 和两个温度 (24 °c 和28°c)。标称浓度被显示为平均值.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
这项工作描述了一种新的生物测定方法, 使用Nothobranchius furzeri(一种新兴的模型有机体) 来研究毒物和其他压力源的个体和组合的长期效应。提出的协议已成功地应用于测量物种对一系列有毒物质 (铜、镉、34-dichloroaniline 和毒死蜱) 的敏感性。由于它的快速生命周期, 这个脊椎动物模型允许评估致死和跨代的影响在四月内。使用这种鱼类作为毒性筛选模型的另一个主要优点是它生产抗旱蛋。这使研究人员可以储存鸡蛋或从供应商那里获得, 并消除了昂贵和耗时的现场文化的需要。此外, 胚胎可以储存数年, 直到需要幼仔的12。
在研究了furzeri对许多参考毒物的敏感性之后, 我们可以补充说, 物种的敏感性与其他模型物种的灵敏度范围相同, 或者高于其他模式种类, 这取决于所测试的化合物。测量对生育力的影响, 特别是可以增加对研究物种的敏感性的可比性, 因为它是其他模型物种的常规测量终点。最后, 在单独或组合的情况下, 多重压力源施加不良影响的程度取决于所评估的端点和暴露浓度。
使用furzeri时仍有一些限制。最重要的限制之一是食品的标准化。批次的卤虫囊肿或 bloodworms 可以不同的质量, 并可以这样, 影响研究结果。因此, 在整个实验过程中, 最好订购大量的食物。
我们认为, 该协议广泛适用于生态筛查。furzeri正在迅速发展为生态中的标准测试种。这一标准议定书的提供可能会助长其建立。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢 UAntwerpen 的球体小组和 Ugent 的作物保护部对水样进行分析。该项目的支持是由 PF/10/007 研究基金的卓越中心的生态和社会进化动态提供的。afg 胶 (11Q0516N) 和 ESJT (FWO-SB151323) 以博士和 TP (12F0716N) 为博士后研究员, FWO 佛兰德 (全宗 Wetenschappelijk Onderzoek)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| purified water Type 1 (milli Q) | Millipore | ||
| Sea Salt | Instant Ocean | ||
| 2L plastic tank | SAVIC | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 1L plastic tank (spawning) | Avamoplast | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| nets | Aqua bilzen | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 2L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 0,5L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| Artemia eggs | Ocean Nutrition | ||
| chironomus | Ocean Nutrition | frozen | |
| tricaine | Sigma aldrich | ||
| petri dishes | VWR | ||
| Parafilm | VWR | ||
| pipettes | MLS | ||
| tweezers | FST | ||
| 500 µm mesh sieve | / | self-made | |
| microcentrifuge tube (2ml) | BRAND | To store fish in freezer | |
| glass vials | Sigma aldrich | For water analysis | |
| weighing boat | MLS | ||
| Jiffy 7c pellets | Jiffy | ||
| water bath | Gilac | for Ctmax | |
| liquid nitrogen | Air liquide | ||
| digital thermometer | Testo AG | testo 926 | |
| HETO therm heater | Anker Schmitt | ||
| calibrated balance | Mettler-Toledo AG | ||
| camera | / | ||
| platform for camera | / | self-made | |
| Multiparameter kit | HACH | ||
| Freezer (-80°C) | Panasonic Ultra low temperature freezer | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fysio | |||
| homogenisation buffer | VWR | 0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100 | |
| chloroform:methanol | Sigma Aldrich | ||
| glyceryl tripalmitate | Sigma Aldrich | ||
| amyloglucosidase | Sigma Aldrich | A7420 | |
| glucose assay reagent | Sigma Aldrich | G3293 | |
| Biorad protein dye | VWR | ||
| 96-well microtiter plate | Greiner Bio-one | ||
| 384 microtiter plates | Greiner Bio-one | ||
| 2 ml glass tubes | Fiers | For fat analysis | |
| 2,5ml eppendorf tubes | VWR | ||
| homogeniser | Ultra-turrax TP 18/10 | ||
| photospectrometer | Infinite M200 TECAN | ||
| heater for glass tubes | Hach COD REACTOR | ||
| centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5415 R | ||
| Incubator | Bumako |
References
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