Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Menneskelige Pluripotent stamceller kultur på polyvinylacetat alkohol-Co-Itaconic syre Hydrogels med varierende stivhet Under Xeno-gratis forhold

Published: February 3, 2018 doi: 10.3791/57314
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3,4, 1, 1, 1, 2, 2, 5, 6, 7,8
1Department of Chemical and Materials Engineering, National Central University, 2Department of Botany and Microbiology, King Saud University, 3Cathay Medical Research Institute, Cathay General Hospital, 4Graduate Institute of Systems Biology and Bioinformatics, National Central University, 5Department of Medical Microbiology and Parasitology, Universiti Putra Malaysia, 6Department of Internal Medicine, Taiwan Landseed Hospital, 7Department of Zoology, Bharathiar University, 8Thiruvalluvar University
* These authors contributed equally

Summary

En protokoll er presentert for å forberede polyvinylacetat alkohol-co-itaconic syre hydrogels med varierende stivhet, som ble podet med og uten oligopeptides, for å undersøke effekten av stivhet av biologisk materiale på differensiering og spredning stamceller. Stivhet av hydrogels ble kontrollert av crosslinking tiden.

Abstract

Effekten av fysisk stikkord, for eksempel stivhet av biologisk materiale om spredning og differensiering av stamceller, har blitt undersøkt av flere forskere. Men har de fleste av disse etterforskere brukt polyakrylamid hydrogels for stamcelleforskningen kultur i sine studier. Derfor er resultatene kontroversielle fordi disse resultatene kan stamme fra Karakteristika av polyakrylamid og ikke fysisk køen (stivhet) av de biologisk materiale. Her beskriver vi en protokoll for å forberede hydrogels, som ikke er basert på polyakrylamid, hvor ulike stilk, cellene menneskelig embryonic stem (ES) celler og menneskelige indusert pluripotent-stamceller (iPS), kan kultivert. Hydrogels med varierende stivhet var forberedt fra bioinert polyvinylacetat alkohol-co-itaconic syre (P-IA), med stivhet kontrollert av crosslinking grad ved å endre crosslinking tid. P-IA hydrogels podet med og uten oligopeptides fra ekstracellulær matrix ble undersøkt som fremtidige plattform for stamcelleforskningen kultur og differensiering. Kulturen og tidens amniotic væske stamceller, liggende under adipose-avledet stilk celler, human ES celler og menneskelige iPS celler er beskrevet i detalj her. Oligopeptide P-IA hydrogels viste overordnede forestillinger, som ble indusert etter stivhet egenskaper. Denne protokollen rapporter syntese av biomateriale, deres overflate manipulasjon, samt kontrollere egenskapene stivhet og til slutt deres innvirkning på stamcelleforskningen skjebne xeno-fri kultur betingelser. Basert på studier, kan slike endrede underlag fungere som fremtidige plattformer støtte og direkte skjebnen til ulike stamceller linje til ulike koblinger; og videre, regenerere og gjenopprette funksjonene tapt organ eller vev.

Introduction

Skjebnen til stamcelleforskningen differensiering inn en bestemt avstamning av celler og langsiktig spredning av stamceller, spesielt menneskelige indusert pluripotent (iPS) celler og menneskelig embryonic stem (ES) celler, er kjent for å være regulert av hemmere, vekstfaktorer, og / eller små bioaktive molekyler i kultur medier. Nylig, de fysiske signaler av biologisk materiale, spesielt stivhet av celle kultur biologisk materiale, har blitt anerkjent å være en viktig faktor guiding skjebnen til stamcelleforskningen spredning og differensiering1,2, 3,4,5,6. Derfor begynte flere forskere å undersøke skjebnen til stamceller, som er kultivert på hydrogels, på differensiering, hovedsakelig bruker polyakrylamid hydrogels med varierende stivhet.

Stivhet av biologisk materiale kan kontrollere fokal adhesjon, celle morfologi, celle fenotypen og stamcelleforskningen vedheft, spesielt i todimensjonale (2D) dyrking1,2,3,5. Mechano-sensing av biologisk materiale av stamceller kontrolleres vanligvis av fokal vedheft signalering via integrin reseptorer. NMMIIA, nonmuscle myosin IIA-avhengige contractility i cytoskeleton av utgangen spiller en avgjørende rolle i mechanosensing prosessen med stamceller i 2D-cellen dyrking systemer3,4,5, 7,8,9,10,11.

Engler og hans kolleger utviklet en interessant forestilling at voksne stamceller, som benmargen (BMS) stamceller dyrket på celle kultur biologisk materiale med en lignende stivhet som bestemt vev, tendens til å skille ut celler stammer fra bestemt vev5. BMS celler ruges på 2D-myk polyakrylamid hydrogels belagt med kollagen type I (med en stivhet sammenlignes med hjernen vev) i utvidelse medier var spontant overtalt til å skille ut tidlig Nevron linjene, mens BMS celler kultivert på hydrogels med en stivhet ligner på muskel eller collagenous bein vev ble funnet for å indusere differensiering inn tidlig linjene av myocytter og osteoblasts, henholdsvis på 2D-polyakrylamid hydrogels3,5. Mange forskere har undersøkt skjebne stamcelleforskningen differensiering kultivert på polyakrylamid hydrogels immobilisert med kollagen type I-12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. men det bør nevnes at noen motstridende rapporter1,18,22,23,24 finnes for kjente ideen foreslått av Engler et al. 5 dette er fordi englers idé5 ble utviklet utelukkende på polyakrylamid hydrogels og resultatene har sin opprinnelse fra bestemte egenskaper av biomateriale (polyakrylamid), og ikke bare fysisk køen (stivhet) av biomateriale. Derfor er det viktig å utvikle en annen type hydrogel, som stivhet styres av crosslinking av hydrogels. For dette formålet, ble bioinert hydrogels utviklet, som ble utarbeidet fra polyvinylacetat alkohol-co-itaconic syre (P-IA) med en annen stivhet, som var kontrollert av crosslinking graden med en skiftende crosslinking tid25, 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. stamceller kan være dyrket på nonmodified P-IA hydrogels, i tillegg til P-IA hydrogels podet med ekstracellulære matriser (ECMs) og oligopeptides. I en tidligere studie25, ble menneskelige blodkreft stamceller (hHSCs) fra navlestrengsblod dyrket på P-IA hydrogels med forskjellige stivhet verdier mellom en 3 kPa 30 kPa lagring modulus der fibronectin eller en oligopeptide avledet fra fibronectin (CS1, EILDVPST) ble podet inn på P-IA hydrogels. Høy ex vivo fold utvidelse av hHSCs ble observert i P-IA hydrogels podet med CS1 eller fibronectin, som viste en middels stivhet mellom 12 kPa 30 kPa25.

Menneskelige iPS og ES celler kan ikke være dyrket på konvensjonelle vev kultur polystyren (TCP) retter33,34 fordi human ES og iPS celler krever bestemte binding til ECMs, for eksempel vitronectin eller laminin å opprettholde deres pluripotency under langsiktige kultur. Derfor ble flere strukturer av oligopeptide-podet P-IA hydrogels med optimal stivhet egenskaper designet og utarbeidet i formasjoner av et enkelt kjede, et enkelt kjede med en felles segment, en dobbel kjede med et felles segment og en forgrenet-type kjeden32. Oligopeptide sekvenser ble valgt fra integrin - og glycosaminoglycan-binding domener av ECMs. P-IA hydrogels podet med vitronectin-avledet oligopeptides med dobbelt kjede eller felles segment, som har en lagring modulus på ca. 25 kPa, støtte langsiktig kultur human ES og iPS celler for over 12 ganger under xeno-fri og kjemiske definerte vilkårene32. Den felles segment og dobbelt kjede med celle vedheft molekyler på hydrogels muliggjorde spredning og pluripotency human ES og iPS cellene32. Her, en protokoll for å forberede P-IA hydrogels (med en lagring modulus fra 10 kPa til 30 kPa, som ble målt under våte forhold i luften) podet med og uten oligopeptides eller ECMs er beskrevet. Hvordan kultur og passasje flere stamceller (inkludert amniotic væske stamceller, liggende under adipose-avledet stilk celler, human ES celler og menneskelige iPS celler) vises.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimenter i denne studien ble godkjent av komiteene av Taiwan Landseed sykehuset (IRB-13-05) og National Central University. Alle eksperimentene ble utført i samsvar med alle relevante og gjeldende statlige og institusjonelle retningslinjer og regler i denne studien.

1. løsning og Media forberedelse

  1. Polymer rensing
    1. Rense P-IA med karboksylsyre gruppen med en grad av hydrolyse av > 96,5% ved å vaske P-IA med etanol. Plasser 20 g P-IA i 200 mL av etanol i et 500 mL koniske beaker og agitere på en magnetisk rørestang for 24-30 h. Exchange etanol med fersk etanol hver 8-10 h.
    2. Fjerne P-IA fra etanol ved filtrering ved hjelp av en Büchner-trakt.
    3. Tørke P-IA ved vakuumtørking ved romtemperatur for 24 timer.
      Merk: Det er anbefalt å rengjøre fellen i vakuumtørking system (ved fjerning av etanol) ofte, spesielt i første timene fordi fellen tendens til å bli tett etter fjerning av en stor mengde etanol fra P-IA.
  2. Tilberedning av P-IA
    Merk: Legge til polymer veldig sakte i løsemiddelet (vann). Det anbefales å ta minst 15 min til P-IA i løsemiddelet. Hvis løsemiddel legges inn i polymer, ville polymer ikke løses helt. Vær forsiktig med å generere eksplosive koking av P-IA løsningen. Bruk beskyttende briller i tilberedning av P-IA. Varme-prosessen av P-IA løsningen er avgjørende å oppløse krystallinsk P-IA. Det er foreslått (og fortrinnsvis) å forberede P-IA løsningen i et relativt ren eksperimentell rom, hvis mulig.
    1. Oppløse den P-IA i rent vann en 0,050 vekt % konsentrasjon for cellen dyrking eksperimentet eller en 0,50 vekt % konsentrasjon for rheometer måling: for eksempel oppløse 50 mg P-IA i 100 mL rent vann for cellekultur og 500 mg av P-IA i 100 mL de ionisert (DI) vann for rheometer-målinger.
    2. Agitere P-IA løsningen 1t på kokeplate.
      Merk: For å unngå eksplosive kokende, ikke varme løsningen over 95 ° C. Eksplosive koking av polymer løsningen ved høy temperatur kan generere hud brannsår. Derfor utføre oppvarming av P-IA nøye, og temperaturen av P-IA løsningen under oppvarming.
    3. Etter P-IA løsningen var avkjølt ved omgivelsestemperatur, agitere P-IA løsningen ved romtemperatur for 48 h. la hot P-IA-løsningen på kokeplate uten varme, og så la den uten agitering ved romtemperatur for 20-24 h å sikre at luftbobler finnes ikke i P-IA løsningen.
  3. Tilberedning av crosslinking
    1. Gjøre sammensetningen av crosslinking løsning 1.0 vekt % glutaraldehyde fra 25% vandig glutaraldehyde løsning, 20,0 vekt % Na2så4 bruke 99% > renhet og 1.0 vekt % H2så4. For eksempel for en 6 eller 12 vel celle kultur plate, Legg 100 µL glutaraldehyde løsning, 2 g av natrium sulfat, og 100 µL av svovelsyre til 10 mL av rent vann.
  4. Human ES/PS celle kultur medier
    Merk: Bruk DMEM/F12 media, grunnleggende 6 media og viktig 8 media for cellekultur.
    1. Returnere frosset 50 X viktig 8 supplement sakte til løsningen natten av tiner i 4 ° C kjøleskap.
    2. Legg til en flaske 50 X viktig 8 supplement til en flaske med essensielle 8 basale media. Skille media i små dele (50 mL hver) i 100 mL sentrifugering rør, og deretter lagre media på 20 ° C.

2. P-IA Hydrogel parabolen forberedelse

  1. P-IA filmen forberedelse
    1. Sette inn en 1 mL aliquot P-IA løsningen i en 35 mm TCP rett, og tørr parabolen i 45 ° C ovn for 2 dager til å produsere en P-IA film i en ren benk.
  2. Crosslinking P-IA hydrogel retter
    1. Dyppe P-IA filmene i en vandig crosslinking løsning for 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 og 48 timer.
      Merk: ' P-IA -X"(f.eks, P-IA-12 h) refererer til en P-IA hydrogel krysskoblet X h (f.eks, 12 h).
    2. Crosslinking, skyll P-IA hydrogels med rent vann ved omgivelsestemperatur og deretter holde hydrogels i rent vann ved omgivelsestemperatur i en ren benk.
    3. Sterilisere P-IA hydrogels ved nedsenkning i en 75.0 volume/volume% etanol løsning for 1 min, skyll P-IA hydrogels i rent vann seks ganger, og deretter holde P-IA hydrogels i rent vann til brukes for cellen dyrking.
  3. P-IA hydrogel rettene podet med oligopeptide eller ECM
    1. Aktivere P-IA hydrogels via nedsenking i 1 mL av en vannløsning inneholdende 10 mg/mL N-(3-Dimethylaminopropyl) -N'- ethylcarbodiimide hydroklorid (EDC) og 10 mg/mL N- hydroxysuccinimide (NHS) for 1 h 37 ° C eller 4 h på 4 ° C.
    2. Skyll P-IA-hydrogels med 1 mL av fosfat bufret saltvann (PBS, pH 7.2) 3 ganger og fordype P-IA hydrogels i en PBS løsning som inneholder 1 mL av oligopeptide (100-1500 µg/mL) eller ECM (10-100 µg/mL) for 24 timer på 4 ° C.
      Merk: Oligopeptide sekvenser og ECMs brukes for stamcelleforskningen kultur oppsummeres i tabell 1.
    3. Pode oligopeptide eller ECM, vaskes P-IA hydrogels med rent vann 3 ganger.
      Merk: P-IA hydrogels podet med Y µg/mL oligopeptide eller ECM (Z) er heretter kalt P-IA -Xh -Z ellerP-IA-Xh -Z-Y, der X refererer til crosslinking tiden (h), Y angir konsentrasjonen av oligopeptide eller ECM, og Z angir en annen oligopeptide eller ECM.

3. human ES/iPS cellekultur

  1. Passasje og vedlikehold av udifferensierte human ES og iPS celler
    1. Opprettholde human ES (f.eksWA09 eller H9) celler eller menneskelig iPS (f.eksHS0077) celler på Matrigel i viktige 8 medier i 6 cm matretter med standard human ES/iPS celle kultur protokoller28,32.
    2. Inkuber nær confluent human ES/iPS celler med 2,0 mg/mL dispase II i DMEM/F-12 medier på 37 ° C i 8-10 minutter og skyll ES/iPS menneskeceller to ganger med DMEM/F12 media.
    3. Etter tillegg av 2 mL DMEM/F-12 media human ES/iPS celle kultur retter, koble svakt tilhenger kolonier ved hjelp av en celle skraper eller pipettering.
    4. Samle human ES/iPS cellene i 15 mL sentrifugering rør og sentrifuge ES/iPS menneskeceller 160 × g i 5 min på 37 ° C.
    5. Etter sentrifugering, kast på DMEM/F12 suspendere human ES/iPS cellene i 1 mL av E8 media og regnes cellen tettheten ved hjelp av en celle teller.
    6. Vaksinere ES/iPS cellene etter riktig tettheten justeringen (1-5 x 104 celler per cm2 for passaging eller som angitt) i ny kultur retter (P-IA hydrogels podet med oligopeptide eller ECM).

4. karakterisering av menneskelig ES/iPS celle karakteristikk

  1. Evaluering av alkalisk fosfatase (AP) aktivitet
    1. Måle alkalisk fosfatase (AP) aktiviteten til ES/iPS-menneskeceller som bruker en standard isoenzymer lever flekker.
  2. Immunostaining
    1. Utføre immunostaining av Tra-1-81, SSEA-4, Sox2 og Oct3/4 på HMS og hofter celler å undersøke pluripotency etter den konvensjonelle protokoll28,32.
    2. Legge til en 0,5 mL volum 4% (volum/volum) paraformaldehyde i hver 24 godt rett der menneskelige ES/iPS cellene var kulturperler, og deretter ruge rettene i 15 min på 4 ° C å fikse cellene.
    3. Sug opp den paraformaldehyde løsningen i hver brønn. Deretter legge 1 mL av PBS per brønn og Sug opp PBS å skylle cellene. Utføre skyllingsprosess prosessen 3 ganger.
    4. Permeabilize cellemembraner ved å legge til 0,5 mL 0,3% (volum/volum) Triton-X 100 løsning i PBS for 30 min ved romtemperatur.
    5. Sug opp Triton-X 100 løsningen legger 300 µL av 2% (vekt/volum) bovin serum albumin (BSA) i PBS (blokkering buffer) i hver brønn og ruge i 30 min ved romtemperatur.
    6. Fjerne blokkering bufferen ved pipettering, og deretter legge til ønsket primære antistoffer (Oct3/4 (1:200), Sox2 (1:200), SSEA-4 (1:200), og Tra-1-81(1:200) av pipette, se tabell 2) i hver brønn, hvor 1:200 angir antistoffer var fortynnet med PBS 200-fold og inkubert for en dag på 4 ° C.
    7. Sug opp den primære antistoff løsningen og vaskes cellene med 300 µL på 0,05% mellom 20 i PBS løsning 3 ganger ved romtemperatur.
    8. Legge til 300 µL av sekundær antistoffer (1:200, se tabell 2), som er spesifikke for primære IgG undertypen, i 2% (vekt/volum) BSA løsning i hver vel og ruge 1t ved romtemperatur i mørket.
    9. Vask cellene med 300 µL på 0,05% mellom 20 i PBS løsning 3 ganger i romtemperatur i mørket.
    10. Analysere farget cellene fluorescens mikroskopi eller AC confocal mikroskopi.
  3. Embryoid kroppen formasjon
    1. Undersøke pluripotency av menneskelige ES/iPS celler av embryoid kroppen (EB) formasjon på passasjer 10 og 20.
      Merk: Nær 80% samløpet i 6-vel plater er tilstrekkelig for utarbeidelse av EB formasjon.
    2. Skyll human ES eller iPS celler med 2 mL DMEM/F-12 media to ganger, og deretter fordype cellene i 1,5 mL viktig 6 medium.
    3. Kuttet nær 80% confluent ES eller iPS menneskeceller i omtrent 32 biter med 200 µL tips. Deretter koble cellene fra retter ved hjelp av en celle skraper.
    4. Samle ES/iPS menneskeceller og overføre til en 6-vel ultralow vedlegg rett.
    5. Utveksle Essential 6 media ved pipettering gamle medier og legge til frisk media hver 2 dager.
      Merk: Kultur cellene i suspensjon i 2 uker på 37 ° C med 5% CO2.
    6. Etter EBs ble homogenously suspendert i viktige 6 media, overføre EBs å kultur på 24-vel TCP retter belagt med 0,1 vekt % gelatin og kultur cellene i viktige 6 media for en ekstra uke.
    7. Stain cellene med antistoffer mot markører av cellene stammer fra tre embryonale germline lag [AFP (endoderm), GFA (ektoderm), β III-Tubulin (ektoderm) og SMA (mesoderm)] og evaluere cellene av immunostai-metoden beskrevet ovenfor.
  4. Teratoma formasjon
    1. Undersøke pluripotency av menneskelige ES/iPS celler av teratoma formasjon på passasjer 10 og 20.
      NOTE 5 retter av nær 80% samløpet i 6-vel plater er tilstrekkelig for teratoma dannelse (minst 3 x 106 celler er nødvendig for teratoma formasjon eksperimenter).
    2. Skyll cellene med 2 mL DMEM/F-12 media to ganger, og deretter legge til 1,5 mL DMEM/F-12 media celle kultur retter.
    3. Kuttet nesten 80% confluent ES eller iPS menneskeceller i omtrent 32 biter ved hjelp av 200 µL tips. Deretter koble cellene fra retter ved hjelp av en celle skraper.
    4. Samle ES/iPS menneskeceller i en 15 mL sentrifugeringsrøret og sentrifuge cellene på 160 × g i 5 min på 37 ° C.
    5. Etter sentrifugering, avbryte celle pellets 100 µL DMEM/F12 og og bland cellen pellets med 100 µL Matrigel (1:1 volumkontrollen).
    6. Overføre celle suspensjon 20 ° C før avkjølt sprøyter til. Injisere, totalt minst 3 × 106 celler subcutaneously i mannlige NIKK-SCID (NIKKER. CB17 -Prkdascid/JNarl) mus (5-8 uker).
    7. Etter 5-8 uker, analysere teratomer, fastsette med 4,0% (vekt/volum) paraformaldehyde løsningen og deretter lagre på 4 ° C.
    8. Fastsette teratoma med parafin, skjær parafin-innebygd teratomer og flekker med hematoxylin og eosin (H & E) bruker en standardprotokoll28,32.
      Merk: Forskere kan sende fast teratoma vev til selskapet å fastsette teratomer med parafin, slice parafin-innebygde teratomer, og flekken prøven med H & E, som vanligvis brukes i avdeling for patologi på sykehus.
  5. Menneskelige liggende under adipose-avledet stilk (ADS) cellekultur
    1. Varm kultur medier (DMEM som inneholder 1% antimycotic antibiotika og 10% fosterets bovin serum (FBS)), 0,25% av trypsin-EDTA, og PBS 37 ° c i en vann bad før bruk.
    2. Vask menneskeceller annonser av pipettering 10 mL PBS i hver 6 cm kultur parabol hvor cellene er kultivert.
    3. Legg 1 mL av trypsin-EDTA løsning (0,25%) i 6 cm kultur-retter og ruge i løsning på 37 ° C i 5 minutter.
    4. Observere cellene i 6 cm kultur retter under mikroskopi å bekrefte at cellene er koblet fra.
    5. Samle cellene i et 15-mL sentrifuge rør, og legge til en lik mengde kultur medier (DMEM som inneholder 1% antimycotic antibiotika og 10% FBS) inn i sentrifuge røret å nøytralisere trypsin-EDTA.
    6. Sentrifuge cellene på 250 × g i 5 min på 37 ° C.
    7. Etter sentrifugering, forkaste nedbryting nøye av pipettering, uten å forstyrre det cellen pellet.
    8. Resuspend cellene i kultur-media, og deretter frø cellene på riktig tettheten (5-10 x 103 celler per cm2 for passaging eller som angitt) i ny kultur retter (P-IA hydrogels podet med og uten oligopeptides og ECM).
  6. Menneskelige fostervann stammer (AFS) cellekultur
    1. Varme dyrking media (DMEM/MCDB 201 (2:3) som inneholder 20% fosterets bovin serum (FBS), 5 ng/mL bFGF og 1% antimycotic antibiotika), 0,25% av trypsin-EDTA, og PBS 37 ° c i en vann bad før bruk.
    2. Vask AFS menneskeceller av pipettering 10 mL PBS i hver 6 cm kultur rett der cellene er kultivert.
    3. Legg 1 mL av trypsin-EDTA løsning (0,25%) i 6 cm kultur retter, og ruge cellene på 37 ° C i 5 minutter.
    4. Observere cellene i 6 cm kultur retter under mikroskopi å bekrefte cellene er koblet fra.
    5. Samle cellene i et 15-mL sentrifuge rør, og Legg en lik mengde kultur medier (DMEM/MCDB 201 (2:3) som inneholder 20% fosterets bovin serum (FBS), 5 ng/mL bFGF og 1% antimycotic antibiotika) i sentrifuge røret å nøytralisere trypsin-EDTA.
    6. Sentrifuge cellene på 250 × g i 5 min på 37 ° C.
    7. Etter sentrifugering, forkaste nedbryting forsiktig uten å forstyrre den cellen pellet av pipettering.
    8. Resuspend cellene i dyrking media og deretter frø cellene på riktig tettheten (5-10 x 103 celler per cm2 for passaging eller som angitt) i ny kultur retter (P-IA hydrogels podet med og uten oligopeptide og ECM).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

P-IA hydrogels podet med ECM-avledet oligopeptide (oligoECM) eller ECM med forskjellige elastisiteter ble utarbeidet etter reaksjon ordningen, som vist i figur 1A, bruker ulike typer oligoECM (figur 1B). Er elastisiteter av hydrogels ble regulert av anvendt crosslinking intensiteten (tid) (figur 1 c). P-IA hydrogels podet med vitronectin-avledet oligopeptides, som har en lagring modulus av 25.3 kPa (24 h crosslinking tid), støttet langsiktige kultur menneskelige iPS og ES celler for over 10-20 ganger. Spesielt, P-IA hydrogels podet med et felles segment (P-IA-24h-VN1G) eller en dobbel kjede (P-IA-24h-VN2G) støttes pluripotency menneskelige iPS og ES celler, som ble utarbeidet med en relativt lavere konsentrasjon av oligoECM (200-500 μg/mL) enn P-IA-VN1 hydrogels, noe som gjør bruk av en høy konsentrasjon av oligoECM (> 1000 μg/mL) for å opprettholde pluripotency menneske iPS og ES celler28,32.

Human ES celler vedlikeholdes på mus embryonale fibroblaster (MEFs) ble flyttet til kultur på andre syntetisert belegg materialer (f.eksSynthemax II) belagt retter og P-IA-24 h-VN1 hydrogel retter (figur 2)28. Human ES celler kultivert på kommersielt tilgjengelig belegg retter fant enklere skille, spesielt på kanten av koloniene (figur 2a og 2 c), mens human ES celler kunne opprettholde deres pluripotency på P-IA-24 h-VN1-1000 hydrogel retter fordi de differensierte cellene ikke kan være observert fra morfologi av human ES celler på P-IA-24h-VN1-1000 hydrogel retter (figur 2b og 2d)28.

Pluripotency human ES (figur 3A) og iPS (figur 3B) celler kultivert på P-IA - 24 h hydrogels podet med oligoECM (P-IA-24 h-VN1-1000, P-IA-24 h-VN1G-1000, P-IA-24 h-VN2C), samt konvensjonelle rekombinant vitronectin ( rVitronectin)-belagt retter, ble evaluert basert på uttrykk for pluripotent maker proteiner (Nanog, Sox2 og Oct3/4) etter cellene ble kultivert på hver rett xeno-gratis forhold bruke viktig 8 media for 10 passasjer32. Disse pluripotency proteinene ble tilfredsstillende uttrykt på menneskelig iPS og ES celler kulturperler P-IA hydrogels podet med oligoECM samt rVitronectin-belagt retter i xeno uten betingelser.

Evaluering av differensiering evnen til cellene stammer fra tre bakterie lag i vitro (EB formasjon) og i vivo (teratoma formasjon) er viktig å kontrollere pluripotency human ES og iPS celler etter dyrking på syntetisk biologisk materiale. Derfor human ES celler (Figur 4) og menneskelige iPS celler (figur 5) ble dyrket på P-IA-oligoECM hydrogel retter og rekombinant vitronectin-belagt retter for 10 passasjer, og deretter celler ble kultivert i suspensjon i skjema EBs. EBs ble videre dyrket gelatin-belagt retter for et par uker å observere evnen til cellene å spre på retter (figur 4A og figur 5A)32. Differensiert human ES (figur 4B) og iPS (figur 5B) celler var immunostained for proteiner fra tre bakterie lag: alpha-fetoprotein (AFP, endoderm), glatt muskel utgangen (SMA, mesoderm) og glial fibrillary Sure protein (GFAP ektoderm)32. Både menneskelige iPS og ES celler ble funnet for å skille ut cellene stammer fra alle tre bakterie lag, som indikerer en verifikasjon av pluripotency menneskelige iPS og ES celler, selv etter dyrking på P-IA hydrogels podet med oligoECM i xeno-fri forholdene på lang sikt (passasje > 10 avsnitt).

Differensiering evne til human ES celler inn i cellene stammer fra tre bakterie lag i vivo (teratoma formasjon analysen) ble også vurdert. Human ES celler, som ble dyrket på P-IA-VN1-1000 (figur 6A) og P-IA-VN2C-1000 (figur 6B) i xeno-fri kultur forhold for 10 passasjer, ble injisert subcutaneously i NIKK-SCID mus32. Teratomer ble isolert fra mus og teratoma vev deler var fast og farget med H & E (figur 6A og 6B)32. Teratomer vises eksistensen av cellene stammer fra alle tre bakterie lag: endoderm (intestinal epitel, figur 6A(b) og 6B(b)), mesoderm (brusk, figur 6A(c) og 6B(c)) og ektoderm ( neuroepithelium, figur 6A(d); netthinnens pigment epitel, figur 6B(d)). Disse resultatene tyder på at human ES celler kultivert på P-IA-24h-VN1-1000 og P-IA-24h-VN2C-1000 xeno-gratis forhold for 10 passasjer kan skille ut celler som stammer fra tre bakterie lag, som indikerer at deres pluripotency opprettholdes i vivo.

AFS menneskeceller var også kultivert uforandret P-IA hydrogel, P-IA-oligoECM hydrogel og TCP retter i utvidelse medier. Figur 7 viser morphologies av menneskelige AFS celler dyrket etter fire dager med kultur i P-IA og P-IA-oligoECM hydrogel retter med elastisiteter (E') av 12.2 (crosslinking tid = 6 h), 18.3 (crosslinking tid = 12 h), 25.3 (crosslinking tid = 24 h), og 30,4 kPa (crosslinking tid = 48 h) bruker en oligoECM konsentrasjon av 0 eller 50 μg/mL samt TCP retter med 3-12 GPa stivhet30.

AFS menneskeceller kunne ikke sprer P-IA hydrogel retter med eller uten oligoECM når stivhet av P-IA hydrogels var mindre enn 11 kPa (PV - 2h, PV-2h-Y, PV - 4h og PV-4h-Y), mens AFS menneskeceller kunne spre med eller uten oligoECM når E' var større enn 12 kPa, med unntak av P-IA - 6 h og PV-IA-6 h-Kol1 hydrogel retter. P-IA - 6h og P-IA-6h-Kol1 synes ikke å være gunstig for kulturen i menneskeceller AFS fordi de myke celle kultur biologisk materiale stoppe celle syklus progresjon30.

Over resultatene tyder på at P-IA hydrogel retter er en optimal materiale for lang sikt stamcelleforskningen dyrking og opprettholde pluripotency av stamceller ved bestemte stivhet og oligoECM, samt den optimale reaksjon konsentrasjonen av oligoECM (overflate tetthet av oligoECM).

Figure 1
Figur 1: utarbeidelse av P-IA hydrogels podet med oligoECM eller ECM. (A) ordningen av reaksjonen for P-IA hydrogels podet med ECM og ECM-avledet oligopeptide (oligoECM)29. Copyright 2015. Tilpasset med tillatelse fra The Royal Society of Chemistry. (B) Design og sekvens av oligopeptides podet på P-IA hydrogels. Enkelt kjede oligopeptides (P-IA-BSP, P-IA-VN1 og P-IA-HBP1), enkelt kjede oligopeptides med et felles segment (P-IA-VN1G), og to kjeder (P-IA-VN2C og P-IA-HBP2C) og ECM (P-IA-EFM) ble podet på P-IA hydrogels32. Tilpasset under en Creative Commons Attribution License. (C) stivhet av P-IA hydrogels utarbeidet av ulike perioder av crosslinking29. Copyright 2015. Tilpasset med tillatelse fra The Royal Society of Chemistry. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: sammenligning av human ES celle kulturer på P-IA-24h-VN1 hydrogels og kommersielt tilgjengelig belegg retter. Morfologi av human ES celler (WA09) dyrket på kommersielt tilgjengelig belegg retter (a, b) og P-IA-24 h-VN1-1000 (c, d) retter på passering 1 når human ES celler ble flyttet fra dyrking på mus embryonale fibroblaster (MEFs) i dyrking på kommersielt tilgjengelig belegg retter eller PVA-24h-VN1-1000 retter. Røde piler viser differensiert human ES celler. Skala stolper angir 50 µm (a, b) og 100 µm (c, d)28. Tilpasset under en Creative Commons Attribution License. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: karakterisering av pluripotency human ES og iPS celler på P-IA hydrogels podet med ulike oligopeptide design. (A) uttrykk for pluripotency proteiner Nanog (rød), Sox2 (grønn) og Oct3/4 (grønn) på human ES (H9) celler analysert av immunostaining med dobbelt farging med Hoechest33342 for kjernefysisk merking (blå) etter dyrking på (en) P-IA-24h-VN1-1000, (b) P-IA-24 h-VN1G-1000, og (c) P-IA-24 h-VN2C-1000 hydrogels, og (d) rekombinant vitronectin (rVitronectin)-belagt retter under xeno uten betingelser for 10 passasjer. (B) uttrykk for pluripotency proteiner Nanog (rød), Sox2 (grønn) og Oct3/4 (grønn) på menneskelig iPS celler analysert av immunostaining med dobbelt farging med Hoechest33342 for kjernefysisk merking (blå) etter dyrking på (en) P-IA-24 h-VN1-1000 hydrogel, (b) P-IA-24 h-VN2C-1000 hydrogel, og (c) rekombinant vitronectin (rVitronectin)-hydrogels belagt retter under xeno uten betingelser for 10 passasjer32. Skala stolper angir 50 µm. tilpasset under en Creative Commons Attribution License. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: karakterisering av differensiering evne til human ES celler på P-IA hydrogels podet med ulike oligopeptide design. (A) morfologi av celler fra EBs differensiert fra human ES (H9) celler etter dyrking på (en) P-IA-24 h-VN1-1000, (b) P-IA-24 h-VN1G-1000, og (c) P-IA-24 h-VN2C-1000 hydrogels, og (d) rekombinant vitronectin (rVitronectin)-belagt retter under xeno uten betingelser for 10 passasjer. Skala stolper angir 100 µm. (B) uttrykk for en ektoderm protein (GFAP, rød), mesoderm protein (SMA, grønn) og endoderm protein (AFP, grønn) i human ES (H9) celler evalueres av immunostaining med dobbelt farging med Hoechest33342 for kjernefysisk merking (blå) etter dyrking på P-IA-24h-VN1-1000, P-IA-24h-VN1G-1000 og P-IA-24h-VN2C-1000 hydrogels og rekombinant vitronectin (rVitronectin)-belagt retter under xeno uten betingelser for 10 passasjer32. Skala stolper angir 50 µm. tilpasset under en Creative Commons Attribution License. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: karakterisering av differensiering muligheten for menneskelig iPS celler på P-IA hydrogels podet med ulike oligopeptide design. (A) morfologi av celler fra EBs differensiert fra menneskelige iPS (HPS0077) celler etter dyrking (en) P-IA-24 h-VN1-1000 hydrogels, (b) P-IA-24 h-VN2C-1000 hydrogels og (c) rekombinant vitronectin (rVitronectin)- bestrøket retter under xeno uten betingelser for 10 passasjer. Skala stolper angir 100 µm. (B) uttrykk for en ektoderm protein (GFAP, rød), mesoderm protein (SMA, grønn) og endoderm protein (AFP, grønn) i menneskelig iPS (HPS0077) celler analysert av immunostaining med dobbelt farging med Hoechest33342 for kjernefysisk merking (blå) etter dyrking (en) P-IA-24 h-VN1-1000 hydrogels, (b) P-IA-24 h-VN2C-1000 hydrogels og (c) rekombinant vitronectin (rVitronectin)-belagt retter under xeno uten betingelser for 10 passasjer32. Skala stolper angir 50 µm. tilpasset under en Creative Commons Attribution License. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Karakterisering av differensiering muligheten for menneskelig ES (H9) celler i vivo etter dyrking på P-IA-24 h-VN1 og P-IA-24 h-VN2C hydrogels. (A) (en) bilde av en teratoma ved injeksjon med human ES celler etter dyrking på P-IA-24 h-VN1-1000 hydrogels under xeno-fri celle kultur forhold etter 10 passasjer. Vev inkludert (b) intestinal epitel (endoderm), kan (c) brusk (mesoderm), og (d) neuroepithelium (ektoderm) observeres. (B) (en) bilde av en teratoma ved injeksjon med human ES celler etter dyrking på P-IA-24 h-VN2C-1000 hydrogels under xeno-fri celle kultur forhold etter 10 passasjer. Vev inkludert (b) intestinal epitel (endoderm), kan (c) brusk (mesoderm), og (d) netthinnens pigment epitel (ektoderm) observeres32. Skala stolper angir 100 µm. tilpasset under en Creative Commons Attribution License. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: morfologi av menneskelige AFS celler dyrket TCP retter og P-IA hydrogel retter immobilisert med eller uten ECM-avledet oligopeptides etter 4 dager kultur. (A) morfologi av AFS menneskeceller TCP retter. (B) morfologi av menneskelig AFS celler på P-IA - 6 h og P-IA-6 h -Z hydrogel retter (P-IA - 6 h, P-IA-6 h-Kol1-50, P-IA-6 h-FN1-50, P-IA-6 h-VN1-50, P-IA-6 h-HBP1-50 og P-IA-6 h-cRGD-50). (C) morfologi av hAFCs P-IA - 12 h og P-IA-12 h -Z hydrogel retter (P-IA - 12 h, P-IA-12 h-Kol1-50, P-IA-12 h-FN1-50, P-IA-12 h-VN1-50, P-IA-12 h-HBP1-50 og P-IA-12 h-cRGD-50). (D) morfologi av menneskelig AFS celler på P-IA - 24 h og P-IA-24 h -Z hydrogel retter (P-IA - 24 h, P-IA-24 h-Kol1-50, P-IA-24 h-FN1-50, P-IA-24 h-VN1-50, P-IA-24 h-HBP1-50 og P-IA-24 h-cRGD-50). (E) morfologi av menneskelig AFS celler på P-IA - 48 h og P-IA-48 h -Z hydrogel retter (P-IA - 48 h, P-IA-48 h-Kol1-50, P-IA-48 h-FN1-50, P-IA-48 h-VN1-50, P-IA-48 h-HBP1-50 og P-IA-48 h-cRGD-50). Skala stolper angir 100 μm30. Copyright 2017. Tilpasset med tillatelse fra The Royal Society of Chemistry. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Navnet på materiale / utstyr Forkortelse
GTPGPQGIAGQRGVV KOL1
GACRGDCLGA Syklisk RGD (cRGD)
KGGAVTGRGDSPASS FN1
EILDVPST CS1
KGGPQVTRGDVFTMP VN1
GKKQRFRHRNRKG HBP1
CGGGKKQRFRHRNRKG HBP2C
GGGGKGGPQVTRGDVFTMP VN1G
GCGGKGGPQVTRGDVFTMP VN2C
Vitronectin rVN
Fibronectin FN

Tabell 1: ECM-avledet oligopeptide sekvenser og ECM brukt i denne studien.

Antistoffer Konsentrasjon (fortynning rate)
Nanog 1:200
SSEA4 1:200
OCT3/4 1:200
Sox2 1:200
Glatt muskel utgangen 1:200
(Α-SMA) 1:200
AFP 1:200
GFAP 1:200
Alexa Fluor 555-konjugert geit anti-mus 1:200

Tabell 2: Antistoffer brukes for immunostaining i denne studien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

P-IA-oligoECM og P-IA-ECM hydrogels med varierende stivhet ble utviklet for langsiktig utvidelse av human ES og iPS celler opprettholde deres pluripotency for over ti passasjer i xeno uten betingelser og kultur av AFS menneskeceller, annonser celler, og blodkreft stamceller25,28,32. P-IA hydrogels immobilisert med oligoECM er en utmerket kandidat for cellen dyrking materialer å undersøke effekten av celle kultur materialer på skjebnen til differensiering og spredning av ulike typer stamceller som primær celler og kreftceller.

P-IA løsningen skal være gjennomsiktig, når P-IA løsning er på rettene. Crosslinking tiden bestemmer crosslinking intensiteten av P-IA hydrogels. 24 h crosslinking av P-IA hydrogels gir optimal hydrogels for menneskelig ES/iPS cellekultur. Alle oligopeptides og ECMs kan bli podet på P-IA hydrogels bruker denne protokollen, der oligopeptides og ECMs har gratis amino grupper25,28,29,30,31, 32. overflate tettheten av oligopeptides eller ECMs kan oppdages av X-ray photoelectron spektroskopi (XPS) målinger, selv om XPS utgjør en absoluttverdien av overflaten tetthet, men eksistensen av oligopeptides eller ECMs kan trygt analysert.

P-IA hydrogels med og uten podet oligopeptides eller ECMs kan tilberedes, som har lagring modulus fra 3-30 kPa, avhengig crosslinking. Det er ganske vanskelig å forberede P-IA hydrogels har mindre lagringsplass modulus enn 3 kPa og høyere lagring modulus enn 30 kPa25,28,29,30,31,32. Dette er begrensning av nåværende hydrogel forberedelse metoden for kjemiske crosslinking av P-IA hydrogels. Nåværende protokollen gir imidlertid et annet alternativ for hydrogels har forskjellige elastisitet, som kan støtte kultur primære celler og kreftceller stamceller som menneskelige ES og iPS celler, men er ikke laget av polyakrylamid. Spesielt, human ES og iPS celler sprer ikke på polyakrylamid hydrogels, men kan spre på P-IA hydrogels som vist i figur 2, Figur 3, Figur 4, figur 5og figur 6. Faktisk, P-IA-24h-VN1 hydrogels støttet human ES cellekultur bedre enn kommersielt tilgjengelige belegg retter (figur 2). P-IA hydrogels er derfor å foretrekke for kulturen i human ES og iPS celler.

Det ville være interessant å undersøke optimal elastisitet av hydrogels der menneskelige ES og iPS celler skilles i bestemte overleveringslinjer cellene som cardiomyocytes35, netthinnens pigment epitel36, β celler6og TH + celler6 for fremtidig utvikling av regenerativ medisin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble delvis støttet av departementet for vitenskap og teknologi, Taiwan under grant tall 106-2119-M-008-003, 105-2119-M-008-006 og 104-2221-E-008-107-MY3. Denne forskningen ble også støttet av Taiwan Landseed Hospital Project (NCU-LSH-105-A-001). En Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning (nummer 15K 06591) fra Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan er også anerkjent. A. Higuchi ønsker å erkjenne for internasjonale vitenskapelige partnerskapsprogram (ISPP-0062) Vice Rectorate for høyere grads studier og forskning, King Saud University, Riyadh 11451, Kongeriket Saudi-Arabia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GTPGPQGIAGQRGVV PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: Cyclic RGD, cRGD
GACRGDCLGA PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: FN1
KGGAVTGRGDSPASS PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: CS1
EILDVPST PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1
KGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP1
GKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP2C
CGGGKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1G
GGGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN2C
GCGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: rVN
Vitronectin Thermo Fisher scientific A14700 Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: FN
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006 Specification: Commercially available coating material
Abbreviation: Synthemax II
Synthemax II Corning 3535 Specification: Polymer
Polyvinylalcohol-co-itaconic acid Japan VAM & Poval AF-17 Specification: Chemical
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882 Specification: Chemical
Na2SO4 Sigma-Aldrich 239313 Specification: Chemical
H2SO4 Sigma-Aldrich 339741 Specification: Chemical
Abbreviation: EDC
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich E7750 Specification: Chemical
Abbreviation: NHS
N-hydroxysuccinimide Sigma-Aldrich 56480 Specification: Chemical
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Specification: Chemical
Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787 Specification: Cell culture consumable
Cell scraper Corning 3008 Specification: Cell culture consumable
Dispase II Sigma-Aldrich SI-D4693 Specification: Cell culture medium
Essential 6 Thermo Fisher scientific A1516401 Specification: Cell culture medium
Essential 8 Thermo Fisher scientific A1517001 Specification: Cell culture medium
DMEM/F12 Thermo Fisher scientific 11330-032 Specification: Cell culture medium
DMEM Thermo Fisher scientific 12800-017 Specification: Cell culture medium
MCDB 201 Sigma-Aldrich M6770 Specification: ES cell
Human ES cell WiCell Research Institute, Inc.. WA09 Specification: iPS cell
Human iPS cell Riken Cell Bank HS0077 Specification: 35 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353001 Specification: 60 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353002 Specification: 24 well dish
24 well dish Corning 353047 Specification: Blocking agent
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A8806 Specification: Detection reagent
Alkaline phosphatase live stain Thermo Fisher scientific A14353 Specification: Detection reagent
Hematoxylin & eosin Sigma-Aldrich 1.05175 Specification: EB formation dish
6-well ultralow attachment dish Corning 3471 Specification: Coating material
gelatin Sigma-Aldrich G9391 Specification: Coating material
Matrigel Corning 354230 Specification: Mice
NOD-SCID mice National Applied Research Laboratories None Specification: Serum
Fetal bovine serum Biological Industries 04-001-1A Specification: Antibiotic
antimycotic antibiotic Thermo Fisher scientific 15240-062 Specification: Antibody
Antibody for Nanog Invitrogen MA1-017 Specification: Antibody
Antibody for SSEA4 Abcam ab16287 Specification: Antibody
Antibody for OCT3/4 Invitrogen PA5-27438 Specification: Antibody
Antibody for Sox2 Invitrogen 48-1400 Specification: Antibody
Antibody for Smooth Muscle Actin Invitrogen PA5-19465 Specification: Antibody
Antibody for AFP Invitrogen PA5-21004 Specification: Antibody
Antibody GFAP Invitrogen MA5-15086 Specification: Antibody
Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse antibody Invitrogen A-21422 Specification: Antibody
Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit antibody Invitrogen A-11008 Specification: Antibody

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Higuchi, A., Ling, Q. D., Chang, Y., Hsu, S. T., Umezawa, A. Physical cues of biomaterials guide stem cell differentiation fate. Chem. Rev. 113, 3297-3328 (2013).
  2. Higuchi, A., et al. Physical cues of cell culture materials lead the direction of differentiation lineages of pluripotent stem cells. J. Mater. Chem. B. 3, 8032-8058 (2015).
  3. Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13, 979-987 (2014).
  4. Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat. Mater. 13, 547-557 (2014).
  5. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  6. Higuchi, A., et al. Polymeric design of cell culture materials that guide the differentiation of human pluripotent stem cells. Prog. Polym. Sci. 65, 83-126 (2017).
  7. Chen, W. Q., et al. Nanotopography Influences Adhesion, Spreading, and Self-Renewal of Human Embryonic Stem Cells. ACS Nano. 6, 4094-4103 (2012).
  8. Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat. Mater. 9, 82-88 (2010).
  9. McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
  10. Li, D., et al. Integrated biochemical and mechanical signals regulate multifaceted human embryonic stem cell functions. J. Cell Biol. 191, 631-644 (2010).
  11. Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat. Protoc. 6, 187-213 (2011).
  12. Shih, Y. R. V., Tseng, K. F., Lai, H. Y., Lin, C. H., Lee, O. K. Matrix Stiffness Regulation of Integrin-Mediated Mechanotransduction During Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. J. Bone Miner. Res. 26 (4), 730-738 (2011).
  13. Du, J., et al. Integrin activation and internalization on soft ECM as a mechanism of induction of stem cell differentiation by ECM elasticity. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 9466-9471 (2011).
  14. Xue, R., Li, J. Y., Yeh, Y., Yang, L., Chien, S. Effects of matrix elasticity and cell density on human mesenchymal stem cells differentiation. J. Orthop. Res. 31 (9), 1360-1365 (2013).
  15. Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
  16. Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on differentiation of umbilical cord stem cells. Acta Biochim. Pol. 59 (2), 261-264 (2012).
  17. Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on the osteogenic differentiation of bone marrow stem cells and bone-derived cells. Cell Biol. Int. 37 (6), 608-616 (2013).
  18. Macri-Pellizzeri, L., et al. Substrate stiffness and composition specifically direct differentiation of induced pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 21 (9-10), 1633-1641 (2015).
  19. Cozzolino, A. M., et al. Modulating the Substrate Stiffness to Manipulate Differentiation of Resident Liver Stem Cells and to Improve the Differentiation State of Hepatocytes. Stem Cells Int. , 5481493 (2016).
  20. Mattei, G., Ferretti, C., Tirella, A., Ahluwalia, A., Mattioli-Belmonte, M. Decoupling the role of stiffness from other hydroxyapatite signalling cues in periosteal derived stem cell differentiation. Sci. Rep. 5, 10778 (2015).
  21. Zouani, O. F., Kalisky, J., Ibarboure, E., Durrieu, M. C. Effect of BMP-2 from matrices of different stiffnesses for the modulation of stem cell fate. Biomaterials. 34 (9), 2157-2166 (2013).
  22. Ye, K., Cao, L., Li, S., Yu, L., Ding, J. Interplay of Matrix Stiffness and Cell-Cell Contact in Regulating Differentiation of Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 8 (34), 21903-21913 (2016).
  23. Hogrebe, N. J., Gooch, K. J. Direct influence of culture dimensionality on human mesenchymal stem cell differentiation at various matrix stiffnesses using a fibrous self-assembling peptide hydrogel. J. Biomed. Mater. Res. A. 104 (9), 2356-2368 (2016).
  24. Olivares-Navarrete, R., et al. Substrate Stiffness Controls Osteoblastic and Chondrocytic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells without Exogenous Stimuli. PLoS One. 12, e0170312 (2017).
  25. Kumar, S. S., et al. The combined influence of substrate elasticity and surface-grafted molecules on the ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 34, 7632-7644 (2013).
  26. Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol) membranes. Polymer. 26, 1207-1211 (1985).
  27. Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol-co-itaconic acid) membranes. Polymer. 26, 1833-1837 (1985).
  28. Higuchi, A., et al. Long-term xeno-free culture of human pluripotent stem cells on hydrogels with optimal elasticity. Sci Rep. 5, 18136 (2015).
  29. Wang, P. Y., et al. Pluripotency maintenance of amniotic fluid-derived stem cells cultured on biomaterials. J Mater Chem B. 3, 3858-3869 (2015).
  30. Muduli, S., et al. Proliferation and osteogenic differentiation of amniotic fluid-derived stem cells. J Mater Chem B. 5, 5345-5354 (2017).
  31. Muduli, S., et al. Stem cell culture on polyvinyl alcohol hydrogels having different elasticity and immobilized with ECM-derived oligopeptides. JPoly Eng. 37, 647 (2017).
  32. Chen, Y. M., et al. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells on oligopeptide-grafted hydrogels with various molecular designs. Sci Rep. 7, 45146 (2017).
  33. Higuchi, A., Ling, Q. D., Ko, Y. A., Chang, Y., Umezawa, A. Biomaterials for the feeder-free culture of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Chem Rev. 111 (5), 3021-3035 (2011).
  34. Higuchi, A., et al. Design of polymeric materials for culturing human pluripotent stem cells: Progress toward feeder-free and xeno-free culturing. Prog Polym Sci. 39, 1348-1374 (2014).
  35. Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for myocardial infarction in clinical trials: bioengineering and biomaterial aspects. Lab Invest. 97, 1167-1179 (2017).
  36. Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for reversing vision loss. Trends Biotechnol. 35, 1102-1117 (2017).

Tags

Bioteknologi problemet 132 Hydrogel indusert pluripotent stamceller embryonale stamcelleforskningen elastisitet cellekultur oligopeptide overflate modifisering nanosegment
Menneskelige Pluripotent stamceller kultur på polyvinylacetat alkohol-Co-Itaconic syre Hydrogels med varierende stivhet Under Xeno-gratis forhold
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sung, T. C., Li, H. F., Higuchi, A., … More

Sung, T. C., Li, H. F., Higuchi, A., Ling, Q. D., Yang, J. S., Tseng, Y. C., Pan, C. H. P., Alarfaj, A. A., Munusamy, M. A., Kumar, S., Hsu, S. T., Murugan, K. Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions. J. Vis. Exp. (132), e57314, doi:10.3791/57314 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter