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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

टर्मिनल ट्रांस्फ़्रेज़ का उपयोग-मध्यस्थता dUTP निक अंत लेबलिंग (TUNEL) और Caspase 3/7 परख एपिडर्मल के साथ मेंढक में Chytridiomycosis कोशिका मृत्यु को मापने के लिए

Published: May 16, 2018 doi: 10.3791/57345
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1One Health Research Group, College of Public Health, Medical and Veterinary Sciences, James Cook University, 2Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh

Summary

हम दो तरीकों का उपयोग chytridiomycosis के साथ मेंढ़क में एपिडर्मल कोशिका मौत यों तो । सबसे पहले, हम नैदानिक संक्रमित और संक्रमित पशुओं के बीच मतभेद का निर्धारण करने के लिए सीटू प्रोटोकॉल में टर्मिनल ट्रांस्फ़्रेज़-मध्यस्थता dUTP निक एंड-लेबलिंग (TUNEL) का उपयोग करें । दूसरा, हम एक caspase 3/7 प्रोटीन विश्लेषण का उपयोग कर संक्रमण पर apoptosis की एक समय श्रृंखला विश्लेषण आचरण ।

Abstract

उभयचर वैश्विक स्तर पर जैव विविधता में एक महान नुकसान का सामना कर रहे है और प्रमुख कारणों में से एक संक्रामक रोग chytridiomycosis है । यह रोग कवक रोगजनक Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) के कारण होता है, जो मेंढक एपिडर्मिस को संक्रमित और बाधित कर जाता है; हालांकि, रोग परिवर्तन स्पष्ट रूप से विशेषता नहीं किया गया है । Apoptosis (क्रमादेशित सेल मौत) रोगज़नक़ों द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता को नुकसान मेजबान ऊतक, लेकिन यह भी रोगज़नक़ हटाने के लिए रोग प्रतिरोध की एक मेजबान तंत्र हो सकता है । टर्मिनल ट्रांस्फ़्रेज़-मध्यस्थता dUTP निक अंत-लेबलिंग (TUNEL), और caspase 3/7: इस अध्ययन में, हम संक्रमित और संक्रमित दो अलग परख का उपयोग पशुओं के एपिडर्मल कोशिका मौत यों तो । TUNEL परख में ventral, पृष्ठीय, और जांघ त्वचा ऊतक का प्रयोग, हम नैदानिक संक्रमित पशुओं की सीटू में एपिडर्मल कोशिकाओं में कोशिका मृत्यु का पालन और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर पशुओं के साथ सेल मौत की तुलना करें । आदेश में निर्धारित करने के लिए कैसे संक्रमण के पाठ्यक्रम पर एपिडर्मिस परिवर्तन में apoptosis स्तर हम पैर की अंगुली को हटाने-टिप नमूने एक 8 सप्ताह की अवधि में पाक्षिक, और निकाले गए प्रोटीन के साथ एक caspase 3/7 परख का उपयोग करने के लिए नमूने के भीतर गतिविधि यों तो । हम तो संक्रमण लोड के साथ caspase 3/7 गतिविधि सहसंबंधी बनाना । TUNEL परख सीटू मेंसेल मौत के स्थानीयकरण के लिए उपयोगी है, लेकिन महंगा है और नमूना प्रति गहन समय है । caspase 3/7 परख बड़े नमूना आकार और समय पाठ्यक्रम प्रयोगों के लिए कुशल है । हालांकि, क्योंकि मेंढक पैर की अंगुली टिप बायोप्सी छोटे है वहां सीमित निकालने प्रोटीन ठहराव तरीकों, जैसे ब्रैडफोर्ड परख के माध्यम से नमूना मानकीकरण के लिए उपलब्ध है । इसलिए, हम सुझाव है कि पैर की अंगुली बायोप्सी के फोटोग्राफिक विश्लेषण के माध्यम से त्वचा की सतह क्षेत्र का आकलन नमूना मानकीकरण के दौरान अर्क लेने से बचने के लिए ।

Introduction

उभयचर वर्तमान में किसी भी हड्डीवाला taxa1के वैश्विक जैव विविधता का सबसे बड़ा नुकसान का सामना कर रहे हैं । इन गिरावट का एक प्रमुख कारण घातक त्वचा रोग chytridiomycosis, कवक रोगज़नक़ Batrachochytrium dendrobatidis, Bd2की वजह से है । रोगज़नक़ सतही एपिडर्मिस, जो गंभीर इलेक्ट्रोलाइट हानि, हृदय की गिरफ्तारी, और मौत3में जिसके परिणामस्वरूप त्वचा समारोह के विघटन के लिए नेतृत्व कर सकते है संक्रमित । विभिंन संभावित मेजबान Bd के खिलाफ प्रतिरक्षा तंत्र वर्तमान में ऐसे रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स के रूप में अध्ययन किया जा रहा है,4,5, त्वचा के जीवाणु वनस्पति6, प्रतिरक्षा सेल रिसेप्टर्स7,8, और लिम्फोसाइट गतिविधि9,10. हालांकि, कुछ अध्ययनों से पता लगाने कि क्या एपिडर्मल apoptosis और कोशिका मृत्यु इस घातक रोगज़नक़ के खिलाफ एक प्रतिरक्षा तंत्र है ।

कोशिका मृत्यु, या तो apoptosis (क्रमादेशित सेल मौत) या परिगलन (unprogrammed मौत) के माध्यम से, एपिडर्मिस में Bd संक्रमण की विकृति हो सकती है । पिछले शोध से पता चलता है कि Bd संक्रमण apoptosis प्रेरित हो सकता है क्योंकि intracellular जंक्शनों के विघटन मनाया जाता है जब त्वचा explants इन विट्रो11में zoospore supernatants के संपर्क में हैं। इसके अतिरिक्त, Bd-संक्रमित मेंढक में अपक्षयी एपिडर्मल परिवर्तन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी12,13का उपयोग कर मनाया जाता है । Transcriptomic विश्लेषण संकेत मिलता है कि apoptosis रास्ते संक्रमित त्वचा14में विनियमित रहे हैं, और amphibian splenocytes से गुजरना apoptosis जब वे Bd supernatants करने के लिए इन विट्रो15में उजागर कर रहे हैं । सुझाव है कि Bd apoptosis और मेजबान सेल मौत इन विट्रोमें प्रेरित कर सकते हैं सबूत की बढ़ती मात्रा के बावजूद, vivo अध्ययन है कि पता लगाने या संक्रमण की प्रगति के माध्यम से apoptosis तंत्र को बढ़ाता है में कमी है । इसके अलावा, यह अज्ञात है अगर मेजबान एक रक्षात्मक प्रतिरक्षा रणनीति के रूप में apoptosis का उपयोग करता है Bd संक्रमण का मुकाबला, या यदि apoptosis रोग की एक विकृति है ।

इस अध्ययन में, हम एपिडर्मल कोशिका मौत का पता लगाने के उद्देश्य से और vivo में संक्रमित पशुओं में apoptosis दो तरीकों का उपयोग कर: caspase 3/7 प्रोटीन परख, और टर्मिनल ट्रांस्फ़्रेज़-मध्यस्थता dUTP निक अंत-लेबलिंग (TUNEL) में सीटू परख. के रूप में प्रत्येक परख सेल मौत के विभिंन पहलुओं16का पता लगाता है, एक साथ इन तरीकों कोशिका मृत्यु में शामिल तंत्र की एक पूरी समझ प्रदान करते हैं, और प्रभाव का एक सटीक उपाय सुनिश्चित करते हैं । caspase 3/7 परख quantifies caspases 3 और 7 है, जो आंतरिक और बाह्य apoptosis मार्ग दोनों के ठहराव सक्षम बनाता है की गतिविधि । इसके विपरीत, TUNEL परख डीएनए विखंडन है, जो apoptosis, परिगलन और pyroptosis17सहित कोशिका मृत्यु तंत्र के कारण होता है का पता लगाता है । हम TUNEL परख का उपयोग दोनों नैदानिक संक्रमित और संक्रमित तीन अलग त्वचा वर्गों का उपयोग पशुओं के एपिडर्मिस के भीतर कोशिका मृत्यु के स्थान की जांच: dorsum, वेंटर और Pseudophryne corroboreeकी जांघ । इस विधि कोशिका मृत्यु के संरचनात्मक साइट, साथ ही विशिष्ट एपिडर्मल परतों के भीतर अपने स्थान को पहचानने की पहचान करता है । हम तो caspase 3/7 परख का उपयोग एक समय श्रृंखला एक 8 में apoptosis के ठहराव सप्ताह के संचालन के लिए लिटौरिया verreauxii alpinaमें संक्रमण । हम एक ही जानवर से पैर की अंगुली टिप नमूने ले और caspase 3/7 गतिविधि के साथ रोगज़नक़ संक्रमण लोड सहसंबंधी करने में सक्षम हैं ।

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Protocol

जेम्स कुक विश्वविद्यालय ने एल. वी. alpinaके लिए पी. corroboree और A1897 तथा A2171 के लिए A1875 अनुप्रयोगों में पशु नैतिकता को मंजूरी दी ।

1. पशुपालन और निगरानी

  1. एक उपयुक्त पानी, खिला और सफाई अनुसूची के साथ प्रजातियों के लिए उपयुक्त एक वातावरण में, व्यक्तिगत रूप से घर जानवरों । जानवरों की रोजाना जांच करें ।
    1. गंभीर रूप से लुप्तप्राय Pseudophryne corroboree के वयस्क व्यक्तियों का उपयोग करें (TUNEL परख, धारा 4 के लिए) और धमकी दी लिटौरिया verreauxii alpina (के लिए Caspase 3/7 परख, धारा 5), कैप्टिव प्रजनन सुविधाओं से दान । 15-18 डिग्री सेल्सियस पर पशुओं को बनाए रखने, एक काई और बजरी सब्सट्रेट पर, उन्हें रिवर्स असमस पानी के साथ दैनिक धुंध, और फ़ीड 3 बार पेट भरी हुई क्रिकेट के साथ साप्ताहिक ।
  2. प्रत्येक व्यक्ति पर एक बार साप्ताहिक डेटा इकट्ठा । Bd के लिए व्यक्तियों झाड़ू के रूप में चरण २.१ में वर्णित है । एक पैमाने का उपयोग कर करीब ०.१ जी करने के लिए प्रत्येक जानवर तौलना, और डायल callipers का उपयोग कर निकटतम ०.०१ मिमी करने के लिए (SVL) लंबाई वेंट करने के लिए उनके थूथन को मापने.
  3. टीका के बाद (के रूप में खंड 3 में वर्णित), पशु नैतिकता दिशानिर्देश के अनुपालन में संक्रमण (अनियमित त्वचा केंचुली, inappetence, पैर की लालिमा, सुस्ती, या देरी लेकन पलटा) के नैदानिक लक्षणों के लिए प्रतिदिन पशुओं की जांच करें । Euthanize पशु नैदानिक लक्षण और रुग्णता मौजूद हैं ।
    1. tricaine methanesulfonate (MS222) (०.१% डब्ल्यू/वी MS222 की ओवरडोज के साथ Euthanize में सोडियम बिकारबोनिट के साथ पीएच 6-7 के लिए नल का पानी) । सभी गति के बाद 10 मिनट के लिए MS222 में पशुओं रखें रहता है और वे उत्तेजनाओं के लिए कोई प्रतिक्रिया प्रदर्शित करते हैं ।

2. Bd संक्रमण के लिए परीक्षण

  1. Bd के लिए Swabbing
    1. एक नया बाँझ रेयान झाड़ू (प्रति पशु एक झाड़ू) के साथ प्रत्येक जानवर झाड़ू । निंनलिखित swabbing विधि का प्रयोग करें: वेंटर पर पांच बार, प्रत्येक जांघ, पक्ष, और अंग पर पांच बार । यह कुल ४५ स्ट्रोक्स का है ।
    2. धीरे के दौरान और स्ट्रोक के बीच झाड़ू घुमाने के लिए डीएनए के प्रभावी कब्जा सुनिश्चित करते हैं । १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों और स्टोर में बंद झाड़ू टिप तोड़-20 ° c निष्कर्षण तक ।
  2. डीएनए निष्कर्षण और qPCR परख
    1. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए निष्कर्षण एजेंट के ५० µ एल जोड़कर झाड़ू से जीनोमिक डीएनए निकालें ०.५ mm सिलिका मोतियों की 30-40 मिलीग्राम के साथ । मनका 2 मिनट के लिए अधिकतम गति से एक मनका डिब्बा सेल विघटनकारी में नमूनों को हरा । मनका डिब्बा कदम के बाद, 1 मिनट के लिए २,००० x g पर नमूने केंद्रापसारक ।
    2. 10 मिनट के लिए १०० डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की मशीन, और शांत करने के लिए अनुमति देते हैं । 3 मिनट के लिए ५,००० x g पर नमूने केंद्रापसारक, और फिर व्यक्तिगत १.५ मिलीलीटर माइक्रो केंद्रापसारक ट्यूबों और दुकान पर supernatant हस्तांतरण-20 ° c जब तक qPCR ।
    3. परिमाणात्मक पीसीआर (qPCR) का प्रयोग करें निंनलिखित बॉयल एट अल । २००४18 संक्रमण भार का विश्लेषण करने के लिए । निम्न संशोधनों का उपयोग करें:
      1. दोहरा पानी के साथ डीएनए निष्कर्षण नमूने 6:100 पतला । एक अच्छी तरह से ०.७ µ एल गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) जोड़ें पीसीआर अवरोध को रोकने में मदद करने के लिए । प्रत्येक नमूना singlicate में चलाएँ । प्रत्येक प्लेट पर एक नकारात्मक (नहीं टेंपलेट) नियंत्रण और कमजोर पड़ने मानकों की एक श्रृंखला के साथ एक सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग zoospore (संक्रमण) लोड का अनुमान है ।

3. टीका

  1. संस्कृति Bd
    1. tryptone के 16 जी, जिलेटिन hydrolysate के 2 जी, और लैक्टोज के 4 जी (TGHL) के 1 L को जोड़कर संस्कृति शोरबा तैयार करें । आटोक्लेव (१२१ ° c ४० मिनट के लिए) और शोरबा शांत करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    2. Inoculate Bd अलग (इस मामले में, न्यू साउथ वेल्स अलग से पृथक, AbercrombieR-L. booroologensis-२००९-LB1, गद्यांश संख्या 11) एक TGHL शोरबा में और 23 डिग्री सेल्सियस पर 7 डी के लिए विकसित, तो शोरबा संस्कृति को हस्तांतरण TGHL के लिए प्लेटों आगर ।
    3. प्लेट बनाने के लिए, tryptone के 16 जी, जिलेटिन hydrolysate के 2 जी, लैक्टोज के 4 ग्राम (TGHL), और जीवाणु आगर के 10 ग्राम के 1 एल के लिए जोड़ पानी और आटोक्लेव (१२१ ° c ४० मिनट के लिए) । एक बार मिश्रण को छूने के लिए काफी शांत है, लेकिन इससे पहले कि यह जम, ९२ mm व्यास संस्कृति प्लेटों में TGHL आगर डालना तो वे 1/4 1/3 पूर्ण करने के लिए कर रहे हैं, एक वर्ग द्वितीय जैविक सुरक्षा कैबिनेट में ।
    4. जब आगर जम गया है और पूरी तरह से ठंडा, तरल शोरबा से Bd के ०.५ मिलीलीटर के साथ प्रत्येक थाली inoculate, और समान रूप से फैल गया । Bd शोरबा मिश्रण को प्लेट पर सूखने के लिए लगभग 1 घंटे की अनुमति दें और फिर प्लास्टिक आयल फिल्म के साथ प्लेटें सील करें । मशीन प्लेटें 5-7 डी के लिए 23 डिग्री सेल्सियस पर नीचे की ओर आगर
  2. zoospore टीका समाधान के लिए फ्लड प्लेट्स
    1. एक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत zoospore गतिशीलता की जांच करने के लिए व्यवहार्यता दैनिक टीका से पहले सुनिश्चित करें । जब zoospore रिलीज अधिक है, sporangia के बाहर कई zoospores तैराकी के साथ, संस्कृति टीका के लिए तैयार है ।
    2. बाढ़ आयु वर्ग के नल के पानी या कृत्रिम तालाब पानी के 3 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक थाली, प्लेट में पानी डालने और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीनिंग के लिए zoospores पानी में रिलीज करने की अनुमति । मशीन अवधि के बाद, एक नया बाँझ कंटेनर में zoospore निलंबन नहीं कर सकते ।
    3. एक haemocytometer का उपयोग कर निर्माता के निर्देशों के बाद zoospore एकाग्रता का अनुमान । एक बार zoospore निलंबन की एकाग्रता जाना जाता है, एक एकाग्रता के लिए निलंबन को पतला 1 x 106 zoospores प्रति 3 मिलीलीटर का नल के पानी के साथ ।
  3. Inoculate पशु
    1. Inoculate प्रत्येक जानवर ५० एमएल कंटेनरों में अपनी वेंटर19 से अधिक इनोक्युलम मिश्रण के 3 मिलीलीटर डालने के द्वारा । अतिरिक्त इनोक्युलम को टीका कंटेनर के आधार पर एकत्रित करने की अनुमति दें । संक्रमण को सुनिश्चित करने के लिए 24 घंटे के लिए व्यक्तिगत टीका कंटेनर में प्रत्येक जानवर को छोड़ दें, और 24 एच टीका के बाद, एक विसंक्रमित टेरारियम के लिए प्रत्येक व्यक्ति को वापस ।
      1. एक 13% मात्रा/वॉल्यूम (v/v) का उपयोग कर terraria को संक्रमित करें वाणिज्यिक ब्लीच समाधान20, कम से दो बार पानी के साथ कुल्ला, तो 24 घंटे से कम नहीं के लिए शुष्क करने के लिए अनुमति दें ।
    2. bd-नकारात्मक नियंत्रण के लिए, नकली ३.२-३.३ में के रूप में एक ही तरीके का उपयोग जानवरों inoculate, लेकिन bd inoculated आगार प्लेटों के बजाय वृद्ध नल के पानी की 5 मिलीलीटर के साथ बाढ़ Bd-मुक्त आगार प्लेटें ।

4. TUNEL परख

  1. Euthanize जानवरों कि chytridiomycosis के नैदानिक लक्षण दिखा रहे हैं, जैसा कि चरण 1.3.1 में वर्णित है, और Bd-नकारात्मक नियंत्रण जानवरों की एक समान संख्या ।
  2. काटना त्वचा (पृष्ठीय, ventral, और जांघ) प्रत्येक जानवर से नमूने । 4% v/v फॉस्फेट बफर formaldehyde में 2 एच के लिए त्वचा के नमूनों को ठीक करें । कम और लगातार फिक्सिंग समय ऊतकों को पूरी तरह से तय करने की अनुमति देता है, लेकिन यह भी प्रभावी और सटीक immunohistochemistry धुंधला के लिए अनुमति देता है । तब अनुभाग के लिए embedding तक ८०% इथेनॉल के लिए स्थानांतरण ।
  3. ऊतकवैज्ञानिक तैयारी के लिए आयल मोम में एंबेड त्वचा मानक तरीकों का पालन21। संक्षेप में, प्रोटोकॉल निंनानुसार है:
    1. इथेनॉल के एक वर्गीकृत श्रृंखला में निर्जलीकरण के ऊतकों, और xylene के साथ इथेनॉल स्पष्ट । आयल मोम में ऊतक एंबेड, और सभी तीन एक तेल ब्लॉक में प्रत्येक व्यक्ति के लिए त्वचा के नमूने जगह है ।
  4. धारा त्वचा का उपयोग कर एक microtome निंनलिखित मानक ऊतकवैज्ञानिक तैयारी21। अनुभाग 5 µm पर ऊतक प्रश्नपत्र और फिर हाइड्रोफिलिक ग्लास स्लाइड करने के लिए प्रत्यय । स्लाइड प्रति स्किन प्रकार के प्रति चार सीरियल histosections रखें । सीरियल त्वचा वर्गों के साथ प्रति व्यक्ति तीन स्लाइड बनाओ, प्रत्येक स्लाइड एक चिपका ऊतक के चार वर्गों है कि याद रखें.
  5. निं नलिखित क्रम में स् लाइड को दाग करें:
    1. eosin counterstaining (एच एंड ई) द्वारा पीछा hematoxylin के साथ पहली स्लाइड दाग । इस स्लाइड के लिए त्वचा के भीतर Bd sporangia के स्थान की कल्पना है ।
    2. ऊतकवैज्ञानिक तैयारी के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध TUNEL परख के बाद दूसरी स्लाइड दाग और निर्माता के निर्देशों का पालन करें, जो नीचे वर्णित हैं ।
      1. सबसे पहले, एक coplin जार में ऊतक वर्गों deparaffinize धोने के लिए 5 मिनट के लिए xylene के तीन परिवर्तन के साथ स्लाइड धोने द्वारा, और 5 मिनट प्रत्येक धोने के लिए १००% इथेनॉल के दो परिवर्तन के साथ पालन करें । 3 मिनट के लिए ९५% इथेनॉल के एक धोने के साथ पालन करें और फिर 5 मिनट के लिए पंजाब के एक धोने के साथ 3 min. Finish के लिए ७०% इथेनॉल ।
      2. हौसले से पतला प्रोटीन पचाने एंजाइम के साथ ऊतक का इलाज (proteinase कश्मीर 20 μg/एमएल के एक एकाग्रता में पंजाब में पतला), और सीधे स्लाइड में जोड़ें । 2 मिनट प्रत्येक के लिए एक coplin जार में पंजाब के दो परिवर्तन के साथ 15 min. धोने के लिए मशीन की अनुमति दें ।
      3. बंद नल अतिरिक्त तरल और ३.०% में बुझाने में एक coplin जार में पंजाब में हाइड्रोजन पेरोक्साइड 2 मिनट के लिए अस्थाई कमरे में । पांच मिनट प्रत्येक धोने के लिए, पंजाबियों के साथ दो बार कुल्ला ।
      4. बंद अतिरिक्त तरल नल, तो लागू ७५ µ एल/5 cm संतुलन बफर के2 सीधे स्लाइड पर ऊतक पर । 10 एस के लिए मशीन अनुभाग के आसपास अतिरिक्त तरल बंद नल और काम टर्मिनल deoxynucleotidyl tranferase (TdT) एंजाइम के ५५ µ l/5 सेमी2 लागू होते हैं । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए एक humidified चैंबर में मशीन ।
      5. TdT मशीन के बाद, शक्ति को रोकने के काम के एक coplin जार में स्लाइड डाल/धो बफर, 15 एस के लिए आंदोलन और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए गर्मी । 1 मिनट प्रति वाश के लिए पंजाब के तीन बदलावों के साथ स्लाइड को धोएं । अतिरिक्त तरल बंद नल ।
      6. लागू एंटी digoxigenin संयुग्मी (rhodamine) है कि ऊतक को कमरे के तापमान को गर्म किया गया है, ६५ µ एल/ कमरे में अस्थायी 30 मिनट के लिए एक humidified चैंबर में मशीन और प्रकाश के लिए जोखिम से बचें । 2 मिनट प्रति वाश के लिए पंजाब के चार बदलावों से धोएं । अतिरिक्त तरल बंद नल ।
      7. स्लाइड में ०.५-1 µ g/mL DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) के 15 µ l को जोड़कर समाप्त करें, जो कि एक काउंटर के दाग के रूप में कार्य करता है । फिर एक कवर स्लिप के साथ कवर और नेल पॉलिश या रबर सीमेंट के साथ सील । स्लाइड को अंधेरे में शुष्क करने की अनुमति दें क्योंकि परख हल्के संवेदनशील है ।
    3. दाग तीसरी स्लाइड TUNEL परख और DAPI counterstain का उपयोग दाग है, लेकिन प्रत्येक नमूने के लिए एक सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करें ।
      नोट: नियंत्रण स्लाइड्स पर 4 histosections में से, पहले 2 धनात्मक नियंत्रण प्रतिकृति हैं, और अंतिम 2 नकारात्मक नियंत्रण प्रतिकृति हैं ।
      1. सकारात्मक नियंत्रण के लिए, बजाय कदम 4.5.2.2 के, पूर्व डीएन बफर (30mM trizma बेस, पीएच ७.२, 4mM MgCl2, 0.1 mm डीडीटी) के साथ ऊतक का इलाज और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन चलो । फिर भंग Dnase मैं DN बफ़र में 0.1 यूजी/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए, और इसे सीधे स्लाइड पर लागू होते हैं । कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए मशीन ।  फिर, 3 मिनट के लिए डीएच के 5 वॉश के साथ स्लाइड को धो लें । अतिरिक्त तरल बंद दाग । फिर शुरू TUNEL परख के रूप में धारा 4.5.2.3 में निर्देश दिया ।
      2. नकारात्मक नियंत्रण के लिए, टर्मिनल deoxynucleotidyl tranferase (TdT) एंजाइम उन नमूनों के लिए नहीं जोड़ (के रूप में खंड 4.5.2.4 में वर्णित) ।
  6. निरीक्षण TUNEL स्लाइड परख के पूरा होने पर तुरंत ।
    1. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर 200X पर प्रत्येक त्वचा अनुभाग के साथ यादृच्छिक अंतराल पर तस्वीरें ले लो, दोनों rhodamine दाग है, जो अपोप्तोटिक कोशिकाओं का पता चलता है और लाल प्रकट होता है के लिए फिल्टर का उपयोग कर, और DAPI जो सभी नाभिक पता चलता है और नीला दिखाई देता है, ताकि के एक ओवरले कोशिकाओं को तैयार किया जा सकता है । सुनिश्चित करें कि प्रति नमूना त्वचा अनुभाग में कम से १०० कोशिकाओं के फोटो हैं । -20 डिग्री सेल्सियस पर एक अंधेरे सूक्ष्मदर्शी बॉक्स में स्लाइड स्टोर ।
    2. गणना कोशिकाओं (नीले DAPI दाग) छवि प्रति । सुनिश्चित करें कि प्रति स्किन अनुभाग में कम से १०० कक्षों की गणना की जाए । १०० कक्षों तक पहुँचने के लिए, छवि के भीतर सभी कक्षों की गणना करें. यदि कम तो १०० कोशिकाओं को एक छवि में मौजूद हैं, एक और छवि गिनती जब तक कम से १०० कोशिकाओं प्रति पशु प्रति त्वचा अनुभाग तक पहुंच रहे हैं ।
    3. अगले, एक ही चित्र (red rhodamine सना हुआ) में TUNEL सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या गिनती । TUNEL सकारात्मक कोशिकाओं है, जो apoptosis और नहीं परिगलन या पृष्ठभूमि संकेत मिलता है, स्पष्ट कोशिका किनारों के साथ एकल कोशिकाओं रहे हैं (झिल्ली कोई lysis के साथ बरकरार हैं). कई बार कोशिकाओं अपोप्तोटिक निकायों फार्म के लिए सिकुड़ते हैं ।
    4. TUNEL परख में गिना क्षेत्रों का पता लगाने और एच और ई सना हुआ histosections पर इसी क्षेत्र का विश्लेषण । पुष्टि करें कि H & E सना हुआ अनुभाग bd संक्रमण की साइटों के अनुरूप है, जो यह सुनिश्चित करता है कि Bd-संक्रमित साइटों का उपयोग तब किया जाता है जब TUNEL परख में अपोप्तोटिक कक्षों की गिनती की जाती है ।

5. Caspase 3/7 परख

  1. प्रत्येक जानवर से पैर की अंगुली युक्तियाँ ले लीजिए (दोनों Bd-उजागर और bd-नकारात्मक) सप्ताह के माध्यम से एक बार साप्ताहिक 3 पोस्ट टीका, और पाक्षिक प्रयोग के अंत के माध्यम से, अप करने के लिए 8 पैर की उंगलियों प्रति व्यक्ति.
    1. लौ निष्फल कैंची के साथ दूसरी phalange पर पैर की अंगुली टिप में कटौती, और एक १.५ मिलीलीटर microtube में जगह और तुरंत फ्रीज-८० डिग्री सेल्सियस पर ।
  2. जमे हुए पैर की अंगुली के नमूने से प्रोटीन निकालें ।
    1. नमूना बफर के १०० µ एल में नमूने प्लेस (25 मिमी HEPES पीएच 7, 5 मिमी MgCl2) एक १.५ मिलीलीटर पेंच टोपी microtube में दो स्टेनलेस स्टील मोतियों (३.२ मिमी) के साथ). 1 मिन मनका धड़कन के 4 चक्र से लाइसे नमूने अधिकतम गति से (एक ही मनका डिब्बा में के रूप में कदम 1.2.1 में इस्तेमाल किया) बर्फ पर 3 मिनट के बाद । lysis के बाद, 5 मिनट के लिए १२,००० x g और 4 ° c पर नमूने के केंद्रापसारक । supernatant लीजिए परख में उपयोग करें ।
  3. नमूना प्रति प्रोटीन एकाग्रता यों तो ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग ।
    1. एक ३८४ अच्छी तरह से थाली में, मिश्रण 10 µ एल प्रोटीन निकालने के 10 µ एल के ब्रैडफोर्ड रिएजेंट के साथ, और कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए मशीन । डुप्लिकेट में प्रत्येक नमूना प्रदर्शन, 5 गुना BSA कमजोर पड़ने मानकों की एक श्रृंखला के साथ साथ । एक अवशोषक प्लेट रीडर पर ५९५ एनएम में अवशोषक पढ़ें ।
  4. वैकल्पिक रूप से, अगर पैर की अंगुली टिप नमूने बहुत छोटे है (प्रोटीन एकाग्रता के रूप में कदम 4.3.1 में ब्रैडफोर्ड परख से निर्धारित सबसे कम मानक के पास है, या अगर नमूने है कि मेंढ़कों 3 जी कुल वजन के तहत कर रहे हैं), त्वचा की सतह का आकलन द्वारा मानकीकृत नमूनों ब्रैडफोर्ड परख के बजाय तस्वीरों का उपयोग कर क्षेत्र ।
    1. caspase परख के लिए नमूने से प्रोटीन निकालने से पहले, फोटोग्राफ 40X आवर्धन पर प्रत्येक पैर की अंगुली एक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर ।
    2. पैर की अंगुली के क्षेत्र का आकलन करके, एक कंप्यूटर इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग पाँव नमूना विश्लेषण. पैर की अंगुली क्लिप के किनारे के आसपास एक लाइन ड्राइंग द्वारा यह मत करो, और आकार के भीतर इमेजिंग सॉफ्टवेयर अनुमान क्षेत्र है । फिर pi (३.१४), जो 3-डायमेंशनल त्वचा के नमूने की सतह क्षेत्र लगभग होगा द्वारा उस क्षेत्र गुणा (के रूप में लंबाई एक्स पार-अनुभागीय क्षेत्र (pi x व्यास) एक ट्यूब के बाहरी सतह क्षेत्र देता है) ।
  5. प्रदर्शन caspase 3/7 परख ।
    1. एक ३८४ अच्छी तरह से luminescence प्लेट में, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध caspase 3/7 रिएजेंट और प्रोटीन निकालने के 10 µ एल के 10 µ एल जोड़ें । प्रत्येक नमूना तपसिल में चलाएँ ।
    2. 15 एस के लिए प्लेट धीरे से मिलाते हुए रिएजेंट्स को मिक्स कर लें । कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए प्रकाश से दूर मशीन । एक luminescent प्लेट रीडर का उपयोग luminescence उपाय ।

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Representative Results

TUNEL परख

संक्रमित पशुओं की तुलना में संक्रमित जानवरों में अधिक TUNEL सकारात्मक कोशिकाएं थीं । TUNEL सकारात्मक कोशिकाओं के सीटू में स्थान संक्रमित और नियंत्रण जानवरों में मतभेद । नियंत्रण पशुओं में, वहां चमड़े के TUNEL सकारात्मक कोशिकाओं का एक भी वितरण था और कम स्तर पर एपिडर्मल त्वचा परतों ( चित्र 1aदेखें), लेकिन संक्रमित पशुओं में, TUNEL सकारात्मक कोशिकाओं एपिडर्मिस में अधिक बार थे (आंकड़ा 1b). संक्रमण की साइटों (के रूप में एच और ई सना हुआ स्लाइड पर मनाया) के रूप में देखा गया था झुरमुट Bd sporangia जांघ और ventral dorsum वर्गों में कोई नहीं के साथ त्वचा वर्गों के माध्यम से बिखरे हुए । जबकि TUNEL सकारात्मक कोशिकाओं पर और अधिक ध्यान केंद्रित किया गया और सीधे संक्रमित कोशिकाओं की साइटों के लिए आसंन (चित्रा 1C), वहां भी था और अधिक व्यापक TUNEL एपिडर्मिस पर सकारात्मक कोशिकाओं और एपिडर्मल परतों है कि जहां Bd से गहरे थे में रहते। Bd संक्रमित पशुओं में और अधिक TUNEL सभी तीन प्रकार की त्वचा में सकारात्मक कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया, लेकिन जांघ और वेंटर त्वचा में एक विशेष रूप से उच्च स्तर (१२.०१ गुना अधिक (९५% ci: ४.९२-२६.३०) जांघ त्वचा में और २२.३१ गुना अधिक (९५% ci ५.२५-९४.८२) वेंटर skin) (figure 2).

Caspase 3/7 परख

संक्रमण के दौरान caspase गतिविधि में अंतर था । बीडी संक्रमित पशुओं में, संक्रमण की तीव्रता caspase 3/7 गतिविधि (चित्रा 3) के साथ सकारात्मक रूप से संबंधित थी । समय के माध्यम से संक्रमित और संक्रमित पशुओं के बीच एक अंतर भी था, पोस्ट टीका । Caspase 3/7 गतिविधि टीका के बाद पहले कुछ हफ्तों के भीतर कमी आई (४८.३६% संक्रमित पशुओं में कम गतिविधि के साथ), और फिर Bd संक्रमित पशुओं में 7 सप्ताह (चित्रा 4) के अंत की ओर बढ़ गई है, लेकिन लगातार संक्रमित में बने रहे व्यक्तियों.

Figure 1
चित्रा 1: टर्मिनल ट्रांस्फ़्रेज़-मध्यस्थता dUTP निक अंत-लेबलिंग (TUNEL) में संक्रमित और संक्रमित पशुओं की सीटू परख. ए) bd -नियंत्रण जांघ की त्वचा Pseudophryne corroboree, और ख) के बी + जांघ की त्वचा अनुभाग पी. corroboree की सीटू TUNEL परख में दाग । नीले DAPI कोशिकाओं के नाभिक संकेत धुंधला है, और लाल rhodamine दाग है, जो डीएनए विखंडन विशेषता apoptosis की वजह से इंगित करता है । पीले तीर पैनल सी में देखा Bd क्लस्टर की स्थिति इंगित करता है c. c) जांघ त्वचा के corroboree अनुभाग एच और ई के साथ सना हुआ. एच एंड ई सेक्शन पैनल बी को सीरियल है । वहां खाली Bd sporangia (तीर) और त्वचा की सतह के पास कुछ अंधेरे अपरिपक्व sporangia के एक क्लस्टर है । सभी तीन पैनलों के लिए एपिडर्मिस फोटो के शीर्ष पर है । पैनलों बी और सी की तुलना से पता चलता है कि rhodamine सना हुआ एपिडर्मल कोशिकाओं के चारों ओर ध्यान केंद्रित कर रहे है और Bd के क्लस्टर के नीचे और जहां त्वचा को नुकसान, इस तरह के बेसल एपिडर्मल कोशिकाओं के बीच सूक्ष्म पुटिका गठन के रूप में दिखाई है । 400X आवर्धन और स्केल बार इंगित करता है ०.०३ mm. चित्रा 2 से Brannelly एट अल. २०१७ सहकर्मी जंमू22में अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: प्रति स्किन प्रकार TUNEL धनात्मक (TUNEL +) कक्षों का अनुपात. पी. corroboreeमें त्वचा के प्रकार के प्रति TUNEL सकारात्मक अपोप्तोटिक कोशिकाओं के अनुपात, संक्रमित जानवरों है कि रोग (एन = 9) और संक्रमित नियंत्रण जानवरों (n = 10) के लिए शिकार का संकेत के साथ। त्रुटि पट्टियां किसी अनुपात के ९५% विश्वास अंतरालों का संकेत देती है और * TUNEL + कक्ष अनुपात में उल्लेखनीय वृद्धि को इंगित करती है । पृष्ठीय त्वचा में, संक्रमित पशुओं १४.३८ (९५% CI ३.३२-६२.२४) बार अधिक TUNEL नियंत्रण पशुओं से सकारात्मक कोशिकाओं (बाधाओं अनुपात: Z = ३.५७, पी < 0.01) था । जांघ की त्वचा में, संक्रमित पशुओं १२.०१ था (९५% CI: ४.९२-२६.३०; अंतर अनुपात: Z = ५.४६, p < 0.01) बार अधिक TUNEL नियंत्रण पशुओं की तुलना में धनात्मक कक्ष (पियरसन की ची चुकता: χ21 = ४४.३०, p < 0.01) । वेंटर त्वचा में, संक्रमित पशुओं २२.३१ (९५% CI ५.२५-९४.८२) बार अधिक TUNEL नियंत्रण पशुओं से सकारात्मक कोशिकाओं (बाधाओं अनुपात: Z = ४.२१, पी < 0.01) था । Brannelly एट अल. २०१७ सहकर्मी जे22में चित्रा 3 से अनुकूलित। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: संक्रमण की तीव्रता के बीच सहसंबंध, लॉग10(zoospore समकक्ष), और caspase 3/7, लॉग10(caspase) inoculated लिटौरिया verreauxii alpina के पाठ्यक्रम पर प्रयोग । संक्रमण तीव्रता और caspase गतिविधि के बीच सहसंबंध ०.४६३ है, और प्रवृत्ति रेखा y = (0.229) x + ०.९३९ का एक समीकरण है । Brannelly एट अलमें चित्रा 4 से अनुकूलित । २०१७ पीयर जे22। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: Caspase 3/7 गतिविधि 7 सप्ताह के माध्यम से लिटौरिया verreauxii alpinaके प्रत्येक समूह के लिए: Bd-संक्रमित जानवरों है कि रोग (n = 4) और संक्रमित नियंत्रण (n = 8) के लिए शिकार । Caspase गतिविधि luminescence प्रति नमूना प्रोटीन एकाग्रता के द्वारा के लिए नियंत्रित पढ़ने के रूप में परिभाषित किया गया है और फिर आधार 10 बदल लॉग । caspase गतिविधि (लॉग10 रूपांतरित) प्रति सप्ताह प्रत्येक समूह के लिए । त्रुटि पट्टियां मानक त्रुटि इंगित करती हैं । * संक्रमित जानवरों उस सप्ताह में संक्रमित नियंत्रण से अलग है कि इंगित करता है । (रैखिक मिश्रित प्रभाव मॉडल: सप्ताह, f4 = ११.९७४, p < 0.01; सप्ताह * स्थिति, f8 = २.१३९, p = ०.०३७; सप्ताह 3 ANOVA, एफ2, 18 = ५.५१२, पी = ०.०१४), Brannelly एट अल. २०१७ सहकर्मी जे22में चित्रा 5 से अनुकूलित। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

हम घातक रोग chytridiomycosis की विकृति के एक संभावित तंत्र या Bd अतिसंवेदनशील प्रजातियों में रोग प्रतिरोध की एक प्रणाली के रूप में एपिडर्मल apoptosis और कोशिका मृत्यु का पता लगाया । हम एपिडर्मिस में सेल मौत का आकलन करने के दो तरीकों का इस्तेमाल किया, सीटू एपिडर्मल सेल मौत विश्लेषण में के लिए TUNEL परख, और संक्रमण की प्रगति के दौरान एपिडर्मल सेल मौत की निगरानी के लिए caspase 3/7 परख । हमने पाया है कि कोशिका मृत्यु और apoptosis संक्रमण लोड और कोशिका मृत्यु के साथ संबद्ध है संक्रमण के स्थल पर काफी अधिक है । प्रारंभिक संक्रमण में, एपिडर्मिस में apoptosis में कमी है, लेकिन apoptosis बढ़ जाती है के रूप में रोगजनक बोझ संक्रमित ऊतक के भीतर बढ़ जाती है ।

कोशिकाओं में Apoptosis कई अलग दृष्टिकोण, लाभ और सीमाओं के साथ प्रत्येक का उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता है । यह apoptosis और कोशिका मौत का अध्ययन करने के लिए कई परख का उपयोग महत्वपूर्ण है ताकि निष्कर्षों की पुष्टि के लिए । इस अध्ययन में, हम दो अलग परख का पता लगाया एपिडर्मल कोशिका मौत और chytridiomycosis के साथ मेंढक में apoptosis की जांच । सबसे पहले हम सीटू मेंसेल की मौत का आकलन TUNEL परख trialled । इस परीक्षण का समय लगता है, और प्रति नमूना महंगा है, और स्लाइड तुरंत फ्लोरोसेंट संकेत के रूप में जल्दी से हो पढ़ा जाना चाहिए । इन सीमाओं के बावजूद, सीटू प्रयोग में इस के परिणाम आगे मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं । स्थानीयकरण के बारे में जानकारी इस विधि का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है, और हमारे अध्ययन में apoptosis अन्य साइटों पर फंगल संक्रमण और अधिक diffusely की साइट पर उच्च स्तर में मौजूद था. इसके अतिरिक्त यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि TUNEL परख डीएनए क्षति का उपाय है, जो apoptosis, परिगलन और pyroptosis17सहित विभिंन कोशिका मृत्यु तंत्र की संख्या के कारण हो सकता है । जबकि वहां apoptosis के हस्ताक्षर-जुड़े कोशिका मृत्यु (जैसे झिल्ली के साथ एकल कोशिकाओं अभी भी बरकरार है, देख प्रोटोकॉल लाइन 4.6.3, वर्गीकरण शोधकर्ता की व्याख्या पर निर्भर करता है । क्योंकि कोशिका मृत्यु के तंत्र TUNEL परख द्वारा निर्धारित नहीं है, यह संभव है कि एक और गैर apoptosis कोशिका मृत्यु मार्ग संक्रमित पशुओं की रुग्णता पर TUNEL सकारात्मक कोशिकाओं में वृद्धि का कारण हो सकता है । क्या प्रत्येक परख उपायों में अंतर दो परख trialled यहां में पैटर्न मतभेद समझा सकता है ।

caspase 3/7 परख समय के माध्यम से संक्रमण के प्रभाव को यों तो इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, के रूप में मेंढक पैर की अंगुली नमूने छोटे हैं, विश्लेषण और मानकीकरण के लिए सीमित नमूना है । नमूना मानकीकरण के लिए एक आम तरीका प्रत्येक निकालने के कुल प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए है । के रूप में ब्रैडफोर्ड प्रोटीन ठहराव परख नमूने का उपभोग करता है, यह छोटे निष्कर्षों के लिए एक प्रभावी तरीका नहीं है । इसके अलावा, हम नैनो यूवी विज़ स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मेंढक त्वचा precluded विश्लेषण के भीतर कि pigments पाया । छोटे नमूना आकार भी शुष्क वजन द्वारा मानकीकरण रोका । हम सुझाव फोटोग्राफी का उपयोग पैर की अंगुली टिप के नमूनों के रूप में त्वचा की सतह क्षेत्र का आकलन, (इन मेंढ़कों शरीर के आकार में कम 3 ग्राम थे) भी दोनों प्रोटीन एकाग्रता और caspase एकाग्रता के लिए परख की अनुमति छोटे थे । हमने पाया है कि पैर की उंगलियों और एक त्वचा की सतह क्षेत्र का अनुमान का उपयोग कर के रूप में पारंपरिक प्रोटीन एकाग्रता के विश्लेषण के रूप में प्रभावी है ।

इस अध्ययन में, हम कोशिका मृत्यु और apoptosis को बढ़ाता है, लेकिन उभयचर और छोटे ऊतक नमूनों के लिए तरीकों अनुकूलित के लिए दो मानक तकनीक का इस्तेमाल किया । TUNEL परख के लिए, हम पर्याप्त ऊतक सुनिश्चित करने के लिए पशु euthanized परख के लिए उपलब्ध था, और विभिंन त्वचा स्थानों की तुलना के लिए अनुमति दी । यह इस तरह के एक पाँव बद्धी बायोप्सी, जो जानवर की इच्छामृत्यु की आवश्यकता नहीं होगी के रूप में छोटे ऊतक नमूनों के लिए इस पद्धति को अनुकूलित करने के लिए संभव है । जानवर के आकार पर निर्भर करता है, बायोप्सी एक समय श्रृंखला परीक्षण caspase 3/7 परख के लिए हमारे दृष्टिकोण के समान के लिए अनुमति सकता है ।

भविष्य के अध्ययनों में, हम सेल मौत और chytridiomycosis संक्रमण के पाठ्यक्रम पर apoptosis की खोज के लिए अतिरिक्त परख के उपयोग का सुझाव है क्योंकि वहां अभी भी chytridiomycosis रोगजनन के कारण तंत्र के बहुत जानने के लिए है । ये परिणाम सुझाते हैं कि apoptosis और एपिडर्मल कोशिका मृत्यु Bdके रोगजनन में महत्वपूर्ण हो सकती है; हालांकि, और अधिक शोध के लिए रोग के परिणामों पर apoptosis के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए, विशेष रूप से मेजबान है कि संक्रमण का शिकार नहीं है में की जरूरत है।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

Acknowledgments

हम निंनलिखित लोग हैं, जो पशुपालन और डेटा संग्रह के साथ सहायता का धंयवाद: Tegtmeier, सी. डी जोंग, जे हॉकरों, के. Fossen, एस. Percival, एम. McWilliams, एल. Bertola, एम. स्टीवर्ट, एन Harney, और टी. Knavel; और विच्छेदों के साथ सहायता के लिए एम. Merces. हम यह भी एल. वी. alpinaस्थापना के लिए एम. McFadden, पी Harlow और Taronga चिड़ियाघर शुक्रिया अदा करना चाहूंगा पी. Marantelliस्थापना के लिए और जी. corroboree । हम Kladnik परख के साथ सहायता के लिए apoptosis परख, सी. Constantine, ए. TUNEL और आर. वेब पर सलाह के लिए एफ Pasmans, ए Martel धंयवाद, और Emeto 3/7 परख के लिए प्रोटोकॉल और किट के साथ मदद के लिए Weßels और डब्ल्यू caspase । यह पांडुलिपि और प्रोटोकॉल Brannelly एट अल २०१७ पीयर जे22से अनुकूलित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
POLARstar Omega BMG Labtech Luminescent plate reader
384 well flat clear bottom plate Corning 3707
384 well low flange white flat bottom plate Corning 3570
Agar Bacteriological (Oxoid) Fisher OXLP0011B
Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin Fisher 6764254
Lactose Broth (Oxoid) Fisher OXCM0137B
Sodium Bicarbonate Fisher BP328-500
Tricane-S (MS-222) Fisher NC0872873
Tryptone Fisher BP1421-500
Bovine Serum Albumin Invitrogen 15561020
Sterile rayon swab Medical Wire & Equipment MW-113
ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit Merck Millipore S7165
Coomassie Bradford reagent Pierce 23200
Caspase Glo  3/7 Promega G8090
HEPES buffer Sigma Aldrich H0887-20ML
Magnesium chloride Sigma Aldrich 1374248-1G
Gelatin hydrolysate Enzymatic Sigma-Aldrich G0262
PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X) Thermo/Life 20-012-043
Prepman Thermo/Life 4318930
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher 4444556
Parafilm Bemis PM996
Clorox bleach Clorox
Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade Fisher BP2818500
ZEISS Axio Scan florescent miscroscope Carl Zeiss Florescent microscope
3.2mm stainless steel beads BioSpec 11079132SS
Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGAT
ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′)		 Taqman Individual design for primers and probe
Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTT
CTCTAGGCAACAGTTT-3′)		 Taqman Individual design for primers and probe
Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) Taqman Individual design for primers and probe
Rotor-Gene qPCR Instruments Qiagen qPCR machine
Microcentrifuge tubes 1.5ml Fisher 02-681-372
Cell culture petri plates Nunc 263991
Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm BioSpec 11079105Z

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References

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इम्यूनोलॉजी व संक्रमण अंक १३५ Apoptosis Caspase प्रोटोकॉल पैथोलॉजी TUNEL वन्यजीव रोग
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