Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Ved hjælp af Terminal-Transferase-medieret dUTP Nick ende-mærkning (TUNEL) og Caspase 3/7-undersøgelser til foranstaltning Epidermal celledød i frøer med Chytridiomycosis

Published: May 16, 2018 doi: 10.3791/57345
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1One Health Research Group, College of Public Health, Medical and Veterinary Sciences, James Cook University, 2Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh

Summary

Vi kvantificere epidermal celledød i frøer med chytridiomycosis ved hjælp af to metoder. Først bruger vi terminal-transferase-medieret dUTP nick ende-mærkning (TUNEL) i situ histologi for at bestemme forskellene mellem klinisk inficeret og ikke-inficerede dyr. Andet, foretager vi en tids-serie analyse af apoptose over infektion ved hjælp af en caspase 3/7 proteinanalyse.

Abstract

Padder oplever et stort tab i biodiversiteten globalt og en af de vigtigste årsager er den smitsomme sygdom chytridiomycosis. Denne sygdom er forårsaget af de svampe patogen Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), som inficerer og forstyrrer frøen epidermis; men patologiske ændringer er ikke blevet udtrykkeligt karakteriseret. Apoptose (programmeret celledød) kan bruges af patogener til at skade værten væv, men kan også være en vært mekanisme af sygdomsresistens for patogenet fjernelse. I denne undersøgelse, vi kvantificere epidermal celledød af smittede og ikke-inficerede dyr ved hjælp af to forskellige assays: terminal-transferase-medieret dUTP nick ende-mærkning (TUNEL) og caspase 3/7. Bruger ventrale, rygfinne, og lår hudvæv i TUNEL assay, vi observerer celle død i epidermal celler i situ af klinisk inficerede dyr og sammenligne celledød med ikke-inficerede dyr ved hjælp af fluorescerende mikroskopi. For at afgøre, hvordan apoptose niveauer i epidermis ændrede løbet af infektion vi fjerne tå-tip prøver hver fjortende dag over en 8-ugers periode, og bruge en caspase 3/7 assay med udvundne proteiner til at kvantificere aktivitet inden for prøverne. Vi derefter korrelere caspase 3/7 aktivitet med infektion belastning. TUNEL assay er nyttig for lokalisering af celle død i situ, men er dyre og tid intensive pr. prøve. Caspase 3/7 assay er effektiv til store stikprøvestørrelser og tid kursus eksperimenter. Men fordi frøen tå tip biopsier er små der er begrænset ekstrakt tilgængelige for prøven standardisering via protein kvantificering metoder, såsom Bradford assay. Vi foreslår derfor, estimering hud overflade område gennem fotografiske analyse af tå biopsier at undgå indtagelse af ekstrakter under prøven standardisering.

Introduction

Padder i øjeblikket oplever en de største tab af globale biodiversitet af ethvert hvirveldyr taxa1. En væsentlig årsag til disse afvisninger er fatal hud sygdom chytridiomycosis, forårsaget af de svampe patogen Batrachochytrium dendrobatidis, Bd2. Patogenet inficerer overfladen epidermis, som kan føre til afbrydelse af hudens funktion resulterer i alvorlige elektrolyt tab, hjertestop og død3. Forskellige potentielle vært immun mekanismer mod Bd er i øjeblikket ved at blive undersøgt som antimikrobielle peptider4,5, kutane bakterieflora6, immun celle receptorer7,8, og lymfocyt aktivitet9,10. Men få undersøgelser udforske om epidermal apoptose og celle død er en immun mekanisme mod denne dødbringende patogen.

Celledød, enten gennem apoptose (programmeret celledød) eller nekrose (unprogrammed død), i epidermis kan være en patologi af Bd infektion. Tidligere forskning tyder på, at Bd infektion kan inducere apoptose, fordi afbrydelse af intracellulære knudepunkter er observeret, når huden explants er udsat for zoospore analysere in vitro-11. Derudover degenerative epidermal ændringer i Bd-inficerede frøer er observeret ved hjælp af elektronmikroskopi12,13. Transkriptom analyser viser, at apoptose veje er upregulated i inficeret hud14, og padde splenocytes gennemgå apoptose, når de udsættes for Bd analysere in vitro-15. Trods den stigende mængde af beviser tyder på, at Bd kan inducere celle apoptose og vært død i vitro, i vivo studier, udforske eller kvantificere apoptose mekanismer gennem progression af infektion mangler. Yderligere, det er ukendt, hvis værten bruger apoptose som en defensiv immunsystemet strategi til bekæmpelse af Bd infektion, eller hvis apoptose er en patologi af sygdom.

I denne undersøgelse, vi har til formål at påvise epidermal celledød og apoptose i inficerede dyr i vivo ved hjælp af to metoder: caspase 3/7 protein assay og terminal-transferase-medieret dUTP nick ende-mærkning (TUNEL) i situ assay. Som hvert assay registrerer forskellige aspekter af celle død16, sammen disse metoder giver en fuld forståelse af de mekanismer, der er involveret i celledød, og sikre en nøjagtig måling af effekten. Caspase 3/7 assay kvantificerer aktiviteten af effektor caspases 3 og 7, som giver mulighed for kvantificering af både den indre og ydre apoptose veje. Derimod registrerer TUNEL assay DNA opsplitning, som er forårsaget af celle død mekanismer, herunder apoptose og nekrose pyroptosis17. Vi bruger TUNEL analysen for at undersøge placeringen af celledød i epidermis af både klinisk inficeret og ikke-inficerede dyr ved hjælp af tre forskellige hud sektioner: dorsum, venter og lår af Pseudophryne corroboree. Denne metode identificerer den anatomiske site af celledød, samt skelne dens placering inden for specifikke epidermale lag. Derefter bruger vi caspase 3/7 analysen til at gennemføre en gang serie kvantificering af apoptose i hele en 8-ugers infektion i Litoria verreauxii alpina. Vi tager tå tip prøver hver fjortende dag fra de samme dyr og er i stand til at korrelere patogen infektion belastning med caspase 3/7 aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

James Cook University godkendt Dyreetik i programmer A1875 for P. corroboree og A1897 og A2171 for L. v. alpina.

1. husdyrhold og overvågning

  1. Hus dyr individuelt, i et miljø, der er relevante for arterne, med en passende vand, fodring og rengøring tidsplan. Kontrollere dyrene dagligt.
    1. Bruge voksne individer af den kritisk truede Pseudophryne corroboree (for TUNEL Assay, afsnit 4) og truede Litoria verreauxii alpina (for Caspase 3/7 analysen, afsnit 5), doneret fra fangenskab avl faciliteter. Vedligeholde dyr på 15-18 ° C, på en mos og grus substrat, tåge dem dagligt med omvendt osmosevand og foder 3 gange ugentligt med gut indlæst fårekyllinger.
  2. Indsamle data om hver enkelt gang ugentlig. Svaber enkeltpersoner til Bd , som beskrevet i trin 2.1. Veje hvert dyr neared 0,1 g ved hjælp af en skala, og måle deres snude for at lufte (SVL) længde til nærmeste 0,01 mm ved hjælp af dial skydelærer.
  3. Efter podning (som beskrevet i afsnit 3), kontrollere dyrene dagligt for kliniske tegn på infektion (uregelmæssig hud slough, inappetence, ben rødme, sløvhed eller forsinket oprettende refleks) i overensstemmelse med dyrenes etiske retningslinjer. Aflive dyr, hvis kliniske symptomer og sygelighed er til stede.
    1. Aflive med en overdosis af tricaine methanesulfonate (MS222) (0,1% w/v MS222 til pH 6-7 med natriumbikarbonat i alderen postevand). Holde dyr i MS222, 10 min efter alle motion ophører og de vise ingen respons på stimuli.

2. testning for Bd infektion

  1. Svaberprøven for Bd
    1. Svaber hvert dyr med en ny steril rayon vatpind (en vatpind pr. dyr). Brug følgende swabbing metode: fem gange på venter, fem gange på hvert lår, side og lemmer. Dette er i alt 45 slagtilfælde.
    2. Forsigtigt rotere svaber under og mellem streger til at sikre effektiv opsamling af DNA. Bryde vatpind tip off i 1,5 mL microcentrifuge rør og opbevares ved-20 ° C indtil udvinding.
  2. DNA-ekstraktion og qPCR assay
    1. Uddrag genomisk DNA fra podninger ved at tilføje 50 µL af en kommercielt tilgængelig DNA udvinding reagens med 30-40 mg af 0,5 mm silica perler. Perle slog prøverne i en perle tæppebanker celle Disrupters ved maksimal hastighed for 2 min. Efter trinnet perle tæppebanker centrifugeres prøver på 2.000 x g i 1 minut.
    2. Inkuber prøver ved 100 ° C i 10 min og afkøles. Centrifugeres prøver på 5.000 x g i 3 min, og derefter overføre supernatanten til individuelle 1.5 mL micro centrifugeglas og opbevares ved-20 ° C indtil qPCR.
    3. Bruge kvantitativ PCR (qPCR) efter Boyle et al. 200418 til at analysere infektion belastningen. Brug følgende ændringer:
      1. Fortynd DNA udvinding prøver 6:100 med dobbelt ionbyttet vand. Tilføje 0,7 µL af bovint serumalbumin (BSA) til hver brønd for at forhindre PCR hæmning. Kør hver prøve i singlicate. På hver plade bruge en negativ (ingen skabelon) kontrol og en positiv kontrol med en række fortynding standarder til at estimere zoospore (infektion) belastning.

3. podning

  1. Kultur Bd
    1. Forbered kultur bouillon ved at tilføje 16 g trypton, 2 g af gelatine hydrolysat og 4 g laktose (TGHL) til 1 L med deioniseret vand. Autoklave (121 ° C i 40 min.) og lad suppen køle af.
    2. Podes Bd isolat (i dette tilfælde, isoleret fra New South Wales isoleres, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, Passage nummer 11) i en TGHL bouillon og vokse for 7 d ved 23 ° C og derefter overføre bouillon kultur til TGHL agar plader.
    3. For at lave plader, tilføje 16 g trypton, 2 g af gelatine hydrolysat, 4 g laktose (TGHL) og 10 g af bakteriologiske agar til 1 L med deioniseret vand og autoklave (121 ° C i 40 min). Når blandingen er cool nok til at røre, men før det størkner, hældes TGHL agar 92 mm diameter kultur plader så de er fuldt ud 1/4 til 1/3, i en klasse II biologiske sikkerhed kabinet.
    4. Da agaren er størknet og afkøles helt, podes hver plade med 0,5 mL af Bd fra den flydende bouillon og jævnt fordelt. Tillad Bd bouillon blandingen til tørre på pladen i ca 1 time og derefter forsegle plader med plast paraffin film. Inkuber plader agar side ned ved 23 ° C i 5-7 d.
  2. Oversvømmelse plader til zoospore podning løsning
    1. Check zoospore motilitet under en inverteret lysmikroskop at sikre levedygtighed dagligt før podning. Når zoospore udgivelse er høj, med mange ppm svømme udenfor sporangia, er kulturen klar til podning.
    2. Oversvømme hver plade med 3 mL af alderen postevand eller kunstige Dam vand, hælde vandet i pladen og inkubere ved stuetemperatur i 10 min at tillade ppm at slippe i vandet. Efter inkubationstid, dekanteres zoospore suspension i en ny steril beholder.
    3. Skøn zoospore koncentration efter fabrikantens anvisninger ved hjælp af en hæmocytometer. Når koncentrationen af zoospore suspension er kendt, fortyndes suspension til en koncentration af 1 x 106 ppm / 3 mL med alderen postevand.
  3. Podes dyr
    1. Podes hvert dyr ved at hælde 3 mL af inokulum blandingen over sin venter19 i individuelle 50 mL beholdere. Tillade overskydende inokulum at samle ind i bunden af podning container. Hvert dyr i individuelle podning beholder til 24 timer at sikre infektion, og efter podning 24 h vender tilbage hver enkelt til en desinficeret terrarium.
      1. Desinficere terraria ved hjælp af en 13% volumen/bind (v/v) kommerciel blegemiddel løsning20, skyl mindst to gange med vand, så gør det muligt for at tørre i mindst 24 timer.
    2. For Bd-negativ kontrol, falsk podes dyrene efter de samme metoder som i 3.2-3.3, men oversvømmelser Bd-gratis agar plader med 5 mL af alderen postevand i stedet for Bd podes agar plader.

4. TUNEL Assay

  1. Aflive dyr, der viser kliniske tegn på chytridiomycosis, som beskrevet i trin 1.3.1, og et tilsvarende antal Bd-negativ kontroldyr.
  2. Dissekere hud (dorsale, ventrale og lår) prøver fra hvert dyr. Løse hud prøver for 2 h i 4% v/v fosfatbufferet formaldehyd. Den korte og konsekvente fastsaettelse tidspunkt tillader væv skal fastsættes fuldt ud, men også giver mulighed for effektiv og præcis Immunhistokemi farvning. Derefter overføre til 80% ethanol indtil indlejring for skæring.
  3. Integrere hud i paraffin voks for histologiske præparat efter standardmetoder21. Kort, protokol er som følger:
    1. Dehydrere væv i en gradueret serie af ethanol, og klare ethanol med xylen. Integrere vævet i paraffin voks, og Placer alle tre hud prøver for den enkelte i en paraffin blok.
  4. Afsnit huden ved hjælp af en mikrotom efter histologiske standardpraeparat21. Afsnit væv seriefremstillede på 5 µm og derefter anbringe på hydrofile glas dias. Anbring fire serielle histosections pr. hudtype pr. slide. Gøre tre dias pr. person med seriel hud sektioner, Husk at hver slide har fire sektioner af hver væv anbragt.
  5. Pletten dias i følgende rækkefølge:
    1. Pletten det første dias med hæmatoxylin efterfulgt af eosin counterstaining (H & E). Dette dias er at visualisere placeringen af Bd sporangia inden for huden.
    2. Pletten det andet dias efter et kommercielt tilgængelige TUNEL assay for histologiske præparat og Følg fabrikantens anvisninger, som er beskrevet nedenfor.
      1. Første, deparaffinize væv sektioner i en coplin jar ved at vaske diasene med tre ændringer af xylen i 5 min pr. vask, og følg med to ændringer af 100% ethanol i 5 min hver vask. Følg med en vask af 95% ethanol i 3 min og derefter 70% ethanol i 3 min. Finish med en vask af PBS i 5 min.
      2. Forbehandle vævet med frisk fortyndet protein fordøje enzym (proteinase K i en koncentration på 20 μg/mL fortyndet i PBS), og tilføje direkte til diaset. Tillad for at udruge i 15 min. Skyl med to ændringer af PBS i en coplin krukke i 2 min.
      3. Tryk på off den overskydende væske og dæmpning i 3.0% hydrogenperoxid i PBS i en coplin krukke for 2 min. ved stue temp. Skylles to gange med PBS, for fem minutter hver vask.
      4. Tryk på off den overskydende væske, derefter anvende 75 µL/5 cm2 af ligevægt bufferen direkte på vævet på diaset. Der inkuberes i 10 s. Tryk off den overskydende væske omkring sektionen og anvende 55 µL/5 cm2 arbejde terminal deoxynucleotidyl tranferase (TdT) enzymet. Inkuber i et befugtet kammer i 1 timer ved 37 ° C.
      5. Efter TdT inkubation, sætte diaset i en coplin krukke med arbejdende styrke stop/wash buffer, agitere for 15 s og inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur. Vask diaset med tre ændringer af PBS for 1 min pr. vask. Tryk på off den overskydende væske.
      6. Anvende anti-digoxigenin konjugat (rodamin) der har været opvarmet til stuetemperatur på væv, 65 µL/5 cm2. Inkuber i et befugtet kammer for 30 min. ved stue temp og undgå udsættelse for lys. Vaske med fire ændringer af PBS for 2 min pr. vask. Tryk på off den overskydende væske.
      7. Finish af tilføjer 15 µL af 0,5 - 1 µg/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) i diaset montering medium til det dias, der fungerer som en counter pletten. Derefter dække med et cover slip og forsegle med neglelak eller gummi cement. Tillad dias til tørre i mørke, som analysen er lysfølsomt.
    3. Pletten tredje dias farves ved hjælp af TUNEL assay og DAPI kontrastfarve, men bruger som en positiv og negativ kontrol for hver prøve.
      Bemærk: Af de 4 histosections på kontrol dias, de første 2 er positiv kontrol replikater og de sidste 2 er negativ kontrol replikater.
      1. For den positive kontrol, i stedet for trin 4.5.2.2, pre behandle væv med DN buffer (30mM trizma base, pH 7,2, 4mM MgCl2, 0.1 mM DDT) og lad inkuberes ved stuetemperatur i 5 minutter. Derefter opløses Dnase I DN buffer til en endelig koncentration på 0.1ug / mL, og anvende det direkte til diaset. Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur.  Derefter vask diaset med 5 vask af dH2O til 3 minutter hver vask. DUP off den overskydende væske. Derefter genoptage TUNEL assay som anvist i afsnittet 4.5.2.3.
      2. For den negative kontrol, Tilføj ikke terminal deoxynucleotidyl tranferase (TdT) enzym til disse prøver (som beskrevet i afsnit 4.5.2.4).
  6. Observere TUNEL dias umiddelbart efter afslutningen af analysen.
    1. Tag fotos tilfældigt mellemrum langs hver hud sektion på 200 X ved hjælp af en fluorescerende mikroskop, ved hjælp af filtre til begge rodamin pletten, som afslører de apoptotiske celler og fremstår rød og DAPI, som afslører alle kerner og vises med blåt, så en overlejring af celler kan genereres. Sikre, at mindst 100 celler er fotograferet pr. hud sektion pr. prøve. Gemme diasene i et mørkt mikroskop boks ved-20 ° C.
    2. Tælle celler (blå DAPI farves) pr. billede. Sikre, at mindst 100 celler tælles pr. hud sektion. For at nå 100 celler, tælle alle cellerne i billedet. Hvis mindre end 100 celler findes i ét billede, Tæl et andet billede indtil mindst 100 celler er nået pr. hud sektion pr. dyr.
    3. Næste, tælle antallet af TUNEL positive celler i de samme billeder (rød rodamin farves). TUNEL positive celler, som angiver apoptose og ikke nekrose eller baggrund, er enkelt celler med klare celle kanter (membraner er intakt med ingen lysis). Nogle gange skrumpe cellerne form apoptotiske organer.
    4. Find de områder, der er optalt i TUNEL analysen og analysere de tilsvarende regioner på H & E farves histosections. Bekræfte, at H & E farves afsnit svarer til websteder af Bd infektion, som sikrer Bd-inficerede websteder bruges ved optælling apoptotiske celler i TUNEL assay.

5. Caspase 3/7 Assay

  1. Indsamle tå tips fra hvert dyr (både Bd- udsat og Bd- negative) én gang ugentligt gennem uge 3 indlæg podning, og hver fjortende dag i slutningen af forsøget, op til 8 tæer pr. person.
    1. Skæres tå tip på den anden phalange med flamme-steriliseret saks, og læg i en 1,5 mL microtube og fryse straks ved-80 ° C.
  2. Uddrag proteiner fra frosne tå prøve.
    1. Placer prøver i 100 µL af prøvebuffer (25 mM HEPES pH 7, 5 mM MgCl2) med to rustfri perler (3,2 mm) i en 1,5 mL skruelåg microtube. Lyse prøver af 4 cyklusser af 1 min perle slå ved maksimal hastighed (i den samme perle tæppebanker som bruges i trin 1.2.1) efterfulgt af 3 min på is. Efter lysis, centrifugeres prøver på 12.000 x g og 4 ° C i 5 min. indsamle supernatanten til brug i analysen.
  3. Kvantificere proteinkoncentration pr. prøve ved hjælp af Bradford assay.
    1. Bland 10 µL af protein ekstrakt med 10 µL af Bradford reagens i en 384 godt plade, og inkuberes i 2 min. ved stuetemperatur. Udføre hver prøve i to eksemplarer, samt med en serie af 5 fold BSA fortynding standarder. Læse absorbans ved 595 nm på en absorbans pladelæseren.
  4. Alternativt, hvis tå tip prøver er for lille (proteinkoncentration er nær den laveste standard som bestemmes fra Bradford assay taktfast 4.3.1, eller hvis de frøer, der er udtaget prøver af under 3 g samlede vægt), standardisere prøver ved forkalkulation af hudens overflade området ved hjælp af fotografier, i stedet for Bradford assay.
    1. Før udvinding fotografere proteiner fra prøve til caspase assay, hver tå på 40 X forstørrelse ved hjælp af en omvendt lysmikroskop.
    2. Analysere tå prøven ved hjælp af en computer imaging software, ved forkalkulation område af tåen. Gøre dette ved at tegne en streg rundt om kanten af tå klip, og har imaging software skøn området inde i figuren. Multiplicerer dette område med pi (3,14), som vil tilnærme overfladearealet af 3-dimensionelle hudprøve (som længde x tværsnitsareal (pi x diameteren) giver den ydre areal af et rør).
  5. Udføre caspase 3/7 assay.
    1. I en 384 godt luminescence plade, tilsæt 10 µL af kommercielt tilgængelige caspase 3/7 reagens og 10 µL af protein ekstrakt. Kør hver prøve i tre eksemplarer.
    2. Bland reagenserne ved omrystning pladen langsomt for 15 s. Incubate plade fra lys i 30 min. ved stuetemperatur. Foranstaltning luminescence ved hjælp af et selvlysende pladelæseren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TUNEL Assay

Der var flere TUNEL positive celler i de angrebne dyr end i de ikke-inficerede kontroldyr. I situ -placeringen af TUNEL positive celler afveg i inficeret og kontrollere dyr. I kontroldyr var der en jævn fordeling af TUNEL positive celler i hele den dermal og epidermal hud lag på et lavt niveau (Se figur 1A), men i de angrebne dyr, TUNEL positive celler blev mere hyppige i epidermis (figur 1b). steder, hvor infektion (som observeret på H & E farves dias) blev observeret som klumpet Bd sporangia spredt gennem låret og ventrale hud sektioner med ingen i afsnittene dorsum. Mens TUNEL positive celler blev mere koncentreret på og direkte støder op til steder af inficerede celler (figur 1 c), der var også mere udbredt TUNEL positive celler over epidermis og i epidermale lag, der var dybere end hvor Bd hovedbopæl. I Bd smittet dyr der var flere TUNEL positive celler i alle tre hudtyper analyseret, men et særligt højt i låret og venter huden (12.01 gange højere (95% CI: 4.92-26.30) i låret hud og 22.31 gange højere (95% CI 5,25-94.82) i den venter hud) (figur 2).

Caspase 3/7 Assay

I løbet af infektion var der en forskel i caspase aktivitet. I Bd smittet dyr, var infektion intensitet positivt korreleret med caspase 3/7 aktivitet (figur 3). Der var også en forskel mellem smittede og ikke-inficerede dyr gennem tiden, post podning. Caspase 3/7 aktivitet faldt inden for de første par uger efter podning (med 48.36% mindre aktivitet i inficerede dyr), og derefter steg mod slutningen af uge 7 (figur 4) i Bd smittet dyr, men forblev konstant i ikke-inficerede enkeltpersoner.

Figure 1
Figur 1: Terminal-transferase-medieret dUTP nick ende-mærkning (TUNEL) i situ assay af inficeret og inficerede dyr. En) Bd- kontrol låret hud sektion af Pseudophryne corroboree, og B) Bd+ lår hud sektion af P. corroboree plettet af i situ TUNEL assay. Blå er DAPI farvning angivelse kerner af cellerne, og røde er rodamin pletten, som angiver DNA fragmentering karakteristisk forårsaget af apoptose. Den gule pil angiver placeringen af Bd klyngen set i panelet C. C) P. corroboree del af låret hud plettet med H & E. Afsnittet H & E er seriel til panelet B. Der er en klynge af tom Bd sporangia (pil) og et par mørke umodne sporangia nær hudoverfladen. For alle tre paneler er overhuden øverst i billedet. Sammenligne paneler B og C viser, rodamin farves epidermale celler er koncentreret omkring og under klyngen af Bd og hvor hudskader er synlige, såsom mikro-vesikel dannelsen mellem basale epidermale celler. 400 X Forstørrelse og skalalinjen angiver 0,03 mm. Adapted fra figur 2 i Brannelly et al. 2017 Peer Jørgensen22. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: andel af TUNEL positive (TUNEL +) celler pr. hudtype. Andelen af TUNEL positive apoptotiske celler pr. hudtype i P. corroboree, med inficerede dyr med angivelse af dyr, der bukkede under for sygdom (n = 9) og ikke-inficerede kontroldyr (n = 10). Fejllinjer angive 95%-konfidensintervallerne for et andel og * viser en betydelig stigning i TUNEL + celle proportioner. I den dorsale huden, de inficerede dyr havde 14.38 (95% CI 3,32-62.24) gange mere TUNEL positive celler end kontroldyr (Odds Ratio: Z = 3,57, p < 0,01). I låret hud, inficerede dyr havde 12,01 (95% CI: 4.92-26.30; Odds Ratio: Z = 5.46, p < 0,01) gange mere TUNEL positive celler end kontroldyr (Pearson's Chi kvadreret: χ21 = 44.30, p < 0,01). I venter hud, inficerede dyr havde 22,31 (95% CI 5,25-94.82) gange mere TUNEL positive celler end kontroldyr (Odds Ratio: Z = 4,21, p < 0,01). Tilpasset fra figur 3 i Brannelly et al. 2017 Peer Jørgensen22. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Sammenhæng mellem infektion intensitet, Log10(zoospore ækvivalenter) og caspase 3/7, Log10(Caspase) af podes Litoria verreauxii alpina i løbet af eksperimentet. Sammenhængen mellem infektion intensitet og caspase aktivitet er 0.463, og tendenslinje har en ligning af y = (0.229) x + 0.939. Tilpasset fra figur 4 i Brannelly mfl. 2017 peer Jørgensen22. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Caspase 3/7 aktivitet gennem uge 7 for hver gruppe af Litoria verreauxii alpina: Bd-inficerede dyr, der bukkede under for sygdom (n = 4) og inficerede objekter (n = 8). Caspase aktivitet er defineret som luminescence læsning kontrolleres af proteinkoncentration pr. sample og derefter logge base 10 omdannet. Caspase aktivitet (Log10 omdannet) for hver gruppe pr. uge. Fejllinjer angive standard fejl. * Angiver at de smittede dyr afveg fra de ikke-inficerede objekter i denne uge. (Lineære blandede effekter model: uge, F4 = 11.974, p < 0,01; uge * status, F8 = 2.139, p = 0.037; Uge 3 ANOVA, F2,18 = 5.512, p = 0.014), tilpasset fra figur 5 i Brannelly et al. 2017 Peer Jørgensen22. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi udforskede epidermal apoptose og celledød som en potentiel mekanisme af patologi af dødbringende sygdom chytridiomycosis eller en mekanisme for sygdomsresistens i Bd modtagelige arter. Vi brugte to metoder til vurdering af celledød i epidermis, TUNEL assay for i situ epidermal celle død analyse og caspase 3/7 analysen til overvågning af epidermale celledød i hele forløbet af infektionen. Vi fandt, at celledød og apoptose er korreleret med infektion belastning og celledød er betydeligt højere på infektionsstedet. I tidlig infektion, der er et fald i apoptose i overhuden, men apoptose stiger som patogen byrde stigninger inden for den inficeret væv.

Apoptose i celler kan testes ved hjælp af mange forskellige tilgange, hver med fordele og begrænsninger. Det er vigtigt at studere apoptose og celle død ved hjælp af flere assays for at bekræfte resultaterne. I denne undersøgelse, vi har undersøgt to forskellige assays for at undersøge epidermal celledød og apoptose i frøer med chytridiomycosis. Første, vi afprøvet TUNEL assay for at vurdere celle død in situ. Denne test er tidskrævende og dyre pr. sample, og dias skal læses straks som den fluorescerende signal hurtigt falmer. På trods af disse begrænsninger er resultaterne af denne i situ -forsøget vigtige for yderligere at forstå mekanismerne af vært-patogen interaktioner. Oplysninger om lokalisering kan bestemmes ved hjælp af denne metode, og i vores undersøgelse apoptose var til stede i høje niveauer i stedet for svampeinfektion og mere diffust på andre websteder. Desuden skal det bemærkes, at TUNEL assay måler DNA-skader, som kan være forårsaget af en række forskellige celle død mekanismer herunder apoptose og nekrose pyroptosis17. Mens der er signaturer af apoptose-associerede celledød (såsom enkelt celler med membraner stadig intakt, se protokollen line 4.6.3, klassificering bygger på fortolkning af forskeren. Fordi mekanismen af celledød ikke bestemmes af TUNEL assay, er det muligt, at en anden ikke-apoptose celle død pathway kan have forårsaget stigningen i TUNEL positive celler på sygelighed af inficerede dyr. Forskellen i hvilke hvert assay foranstaltninger kan forklare mønster forskelle i to undersøgelser vedrørende afprøvet her.

Caspase 3/7 analysen kan bruges til at kvantificere effekten af infektion gennem tiden. Men som frøen tå prøver er små, der er begrænset stikprøve for analyse og standardisering. En fælles metode for prøven standardisering er at bestemme den samlede proteinkoncentration af hver udskrift. Da Bradford protein kvantificering assay bruger prøve, er det ikke en effektiv metode til små uddrag. Desuden fandt vi, at pigmenter i frøen hudpleje udelukker analyse af nano UV-Vis massespektrometri. Lille udsnit størrelser også forhindret standardisering af tørvægt. Vi foreslår, at anslå hud areal af det evaluerede system, ved hjælp af fotografi, som tå tip prøver (disse frøer var mindre end 3 g i kropsstørrelse) var for små til at tillade assays til både proteinkoncentration og caspase koncentration. Vi fandt, at fotografere tæerne og ved hjælp af en hud areal skøn er så effektive som traditionelle protein koncentration analyser.

I denne undersøgelse, vi brugte to standardteknikker for kvantificering celledød og apoptose, men tilpasset metoder til padder og små vævsprøver. For TUNEL assay aflivet vi dyr for at sikre nok væv var til rådighed for analysen, og tilladt til sammenligning af forskellige hud steder. Det er muligt at tilpasse denne metode til mindre vævsprøver, såsom en tå webbing biopsi, som ikke kræver aktiv dødshjælp af dyret. Afhængigt af størrelsen på dyret, biopsier kan give mulighed for en gang serie test svarer til vores tilgang til caspase 3/7 assay.

I fremtidige undersøgelser, vi foreslå brugen af yderligere assays for at udforske celledød og apoptose i løbet af chytridiomycosis infektion, fordi der er stadig meget at lære af de kausale mekanismer chytridiomycosis patogenese. Disse resultater tyder på, at apoptose og epidermal celledød kan være vigtigt i patogenesen af Bd; men mere forskning er nødvendig for at bestemme apoptose indflydelse på sygdommen resultater, især i værter, der ikke bukke under for infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke følgende personer, der har bistået med dyrehold og dataindsamling: D. Tegtmeier, C. De Jong, J. Hawkes, K. Fossen, S. Percival, M. McWilliams, L. Bertoia, M. Stewart, N. Harney og T. Knavel; og M. Merces for bistand med dissektioner. Vi vil også gerne takke M. McFadden, P. Harlow og Taronga Zoo for at hæve L. v. alpinaog G. Marantelli til at hæve P. corroboree. Vi takker F. Pasmans, A. Martel for rådgivning om apoptose assays, C. Constantine, A. Kladnik og R. Webb for bistand med TUNEL assay, og T. Emeto og W. Weßels for hjælp med protokollen og kit til caspase 3/7 assay. Dette manuskript og protokollen er tilpasset fra Brannelly mfl 2017 Peer Jørgensen22.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
POLARstar Omega BMG Labtech Luminescent plate reader
384 well flat clear bottom plate Corning 3707
384 well low flange white flat bottom plate Corning 3570
Agar Bacteriological (Oxoid) Fisher OXLP0011B
Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin Fisher 6764254
Lactose Broth (Oxoid) Fisher OXCM0137B
Sodium Bicarbonate Fisher BP328-500
Tricane-S (MS-222) Fisher NC0872873
Tryptone Fisher BP1421-500
Bovine Serum Albumin Invitrogen 15561020
Sterile rayon swab Medical Wire & Equipment MW-113
ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit Merck Millipore S7165
Coomassie Bradford reagent Pierce 23200
Caspase Glo  3/7 Promega G8090
HEPES buffer Sigma Aldrich H0887-20ML
Magnesium chloride Sigma Aldrich 1374248-1G
Gelatin hydrolysate Enzymatic Sigma-Aldrich G0262
PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X) Thermo/Life 20-012-043
Prepman Thermo/Life 4318930
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher 4444556
Parafilm Bemis PM996
Clorox bleach Clorox
Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade Fisher BP2818500
ZEISS Axio Scan florescent miscroscope Carl Zeiss Florescent microscope
3.2mm stainless steel beads BioSpec 11079132SS
Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGAT
ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′)		 Taqman Individual design for primers and probe
Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTT
CTCTAGGCAACAGTTT-3′)		 Taqman Individual design for primers and probe
Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) Taqman Individual design for primers and probe
Rotor-Gene qPCR Instruments Qiagen qPCR machine
Microcentrifuge tubes 1.5ml Fisher 02-681-372
Cell culture petri plates Nunc 263991
Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm BioSpec 11079105Z

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
  2. Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
  3. Voyles, J., et al. Pathogenesis of chytridiomycosis, a cause of catastrophic amphibian declines. Science. 326 (5952), 582-585 (2009).
  4. Woodhams, D. C., et al. Population trends associated with skin peptide defenses against chytridiomycosis in Australian frogs. Oecologia. 146 (4), 531-540 (2006).
  5. Woodhams, D. C., Voyles, J., Lips, K. R., Carey, C., Rollins-Smith, L. A. Predicted disease susceptibility in a Panamanian amphibian assemblage based on skin peptide defenses. Journal of Wildlife Diseases. 42 (2), 207-218 (2006).
  6. Woodhams, D. C., Rollins-Smith, L. A., Alford, R. A., Simon, M. A., Harris, R. N. Innate immune defenses of amphibian skin: antimicrobial peptides and more. Animal Conservation. 10, 425-428 (2007).
  7. Savage, A. E., Zamudio, K. R. MHC genotypes associate with resistance to a frog-killing fungus. PNAS. 108 (40), 16705-16710 (2011).
  8. Bataille, A., et al. Susceptibility of amphibians to chytridiomycosis is associated with MHC class II conformation. Proceeding of the Royal Society B. 282, 20143127 (2015).
  9. Fites, J. S., Reinert, L. K., Chappell, T. M., Rollins-Smith, L. A. Inhibition of local immune responses by the frog-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Infection and Immunity. 82 (11), 4698-4706 (2014).
  10. Brannelly, L. A., Webb, R. J., Skerratt, L. F., Berger, L. Effects of chytridiomycosis on hematopoietic tissue in the spleen, kidney and bone marrow in three diverse amphibian species. Pathogens and Disease. 74 (7), ftw069 (2016).
  11. Brutyn, M., et al. Batrachochytrium dendrobatidis zoospore secretions rapidly disturb intercellular junctions in frog skin. Fungal Genetics and Biology. 49 (10), 830-837 (2012).
  12. Berger, L., Hyatt, A. D., Speare, R., Longcore, J. E. Life cycle stages of the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 68 (1), 51-63 (2005).
  13. Pasmans, F., et al. Chytridiomycosis related mortality in a midwife toad (Alytes obstetricans) in Belgium. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 79 (6), 460-462 (2010).
  14. Ellison, A. R., et al. More than skin deep: Functional genomic basis for resistance to amphibian chytridiomycosis. Genome Biology and Evolution. 7 (1), 286-298 (2014).
  15. Fites, J. S., et al. The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses. Science. 342 (6156), 366-369 (2013).
  16. Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
  17. Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. A novel method to determine specificity and sensitivity of the TUNEL reaction in the quantitation of apoptosis. American Journal of Cell Physiology. 284 (5), C1309-C1318 (2003).
  18. Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Diseases of Aquatic Organisms. 60 (2), 141-148 (2004).
  19. Brannelly, L. A., Webb, R., Skerratt, L. F., Berger, L. Amphibians with infectious disease increase their reproductive effort: evidence for the terminal investment hypothesis. Open Biology. 6 (6), 1-24 (2016).
  20. Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).
  21. Woods, A., Ellis, R. Laboratory Histopathology: A Complete Reference. , Churchill Livingstone: Edinburgh. (1994).
  22. Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis. PeerJ. 5, e2925 (2017).

Tags

Immunologi og infektion udstede 135 apoptose Caspase histologi patologi TUNEL Wildlife sygdom
Ved hjælp af Terminal-Transferase-medieret dUTP Nick ende-mærkning (TUNEL) og Caspase 3/7-undersøgelser til foranstaltning Epidermal celledød i frøer med Chytridiomycosis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brannelly, L. A., Roberts, A. A.,… More

Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis. J. Vis. Exp. (135), e57345, doi:10.3791/57345 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter