Summary
이 연구에서는 항균 나노 multiwalled 탄소 나노튜브의 산 성 산화 및은 나노 입자의 연속적인 감소 증 착에 의해 합성 되었다. 항균 성 활동 및 세포 독성 테스트 준비로 나노 수행 했다.
Abstract
본이 연구에서는 다중 벽 탄소 나노튜브 (MWCNTs) 산소 기반 기능 그룹을 형성 하는 수성 황산 솔루션으로 치료 했다. 실버 MWCNTs 실버 AgNO3 산화 MWCNTs의 수성 해결책에서의 감소 증 착에 의해 준비 되었다. CNTs의 독특한 색깔을 감안할 때, 그것은 최소 억제 농도 또는 때문에 그들은 방해는 분석 실험 독성 및 항균 속성을 평가 하는 미토 콘 드리 아 독성 분석 실험에 적용 가능 하지 않았다. 저해 영역과 Ag-MWCNTs에 대 한 최소 살 균 농도 측정 하 고 라이브/죽은 Trypan 블루 분석은 CNTs의 색을 방해 하지 않고 독성 및 항균 속성을 측정 하는 데 사용.
Introduction
이 연구의 궁극적인 목표는 그 양식을 biofilms 박테리아의 성장을 억제할 수 있는 친환경 항균 나노 재료를 만드는 것입니다. 이러한 항균 나노 일반적으로 사용 된 화학 제품 또는 항생제 화합물의 독성 및 항생제 저항 문제를 극복할 가능성이 있다. biofilm 수 화 된 세포 외 고분자 물질 (EPS) 다 당 류, 단백질, 핵 산, 지질1,2의 구성 이다. Biofilms는 이물질의 침입을 방지 하 고3,4적극적으로 성장 하는 박테리아를 도움이 됩니다. Biofilms 발생할 냄새 및 만성 전염병5,6. Methylobacterium spp., 예를 들어 물 있으면 항상 또는 에어컨 열교환기, 샤워 룸, 의료 기기 등 지속적으로 세균 박멸을 보장 하기 어려운 장소에 준수에 의해 성장. 이러한 유형의 biofilms 발생할 냄새 및 만성 전염병5,6.
일반적으로, 화학 제품 또는 항생제 화합물 biofilms를 형성 하는 박테리아의 성장을 억제 하는 데 사용 됩니다. Vivo에서 화학 물질의 안전에 대 한 우려 및 항생제 내성 박테리아의 출현 biofilms의 대형을 방지 하 고 박테리아의 성장을 억제 하는 새로운 재료를 개발 하는 필요를 몰고 있다.
이 연구에서는 항균 나노 항 생 저항 및 독성에서 무료로 합성 됩니다. 유명한 항균 물질 이며 nanoscience 및 나노기술의 최근 개발 활성 연구 금속 나노 입자7,8의 항균 효과로 이어졌다. 최근 연구는 작은 크기와 높은 표면 볼륨 비율은 나노 입자의 항균 활동 증가9,,1011에 결과 보고 있다.
여기에 소개 하는 나노 증가 항균 특성 및 높은 종횡비, 단위 부피 당 표면적을 증가 탄소 나노튜브 실버 나노 입자를 결합 합니다. 조작된 실버 나노 탄소 나노튜브 합성 상당한 항균 특성 및 인간과 동물 세포에 최소한의 독성을 전시 한다. 이전 연구에서 합성 프로세스 등 NaBH4, formamide, dimethylformamide, 히드라 진 위험 감소 시키는 대리인을 사용합니다. 과정은, 위험, 복잡 하 고 시간이 많이 걸리는. 합성 과정 보고 여기 훨씬 덜 위험 감소 시키는 대리인으로 에탄올을 사용 하 여.
금지 영역 및 Ag-MWCNTs에 대 한 최소 살 균 농도 (MBC) 측정 되었다; 라이브/죽은 고 Trypan 블루 분석 실험 독성 및 항균 특성을 측정 하기 위해 사용 되었다. 최소 억제 농도 (MIC)와 미토 콘 드리 아 독성 (MTT) 분석 실험 이었다는 분석 방해는 것는 탄소 나노튜브의 특이 한 색상 때문에 수행 되지 않습니다. 마지막으로, 포유류 세포를 영향을 주지 않고 Methylobacterium 종 의 성장을 방지 하기 위해 최소 농도 결정 했다.
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Protocol
1. MWCNT 산화
- 50 mL 유리병으로 MWCNT의 30-50 밀리 그램을 측정 합니다. 천천히 그래서 H2의 8 mL을 추가4: 피 펫 1 mL 피 펫 팁으로 HNO3 솔루션 (90% 초기 농도, 3:1 vol/vol).
주의: 화학 증기 두건이이 준비를 실시 해야 합니다.- 발열 반응 완료에 대 일 분을 허용 합니다.
- MWCNT 유리병의 바닥에 침전 될 때까지 60-80 ° C와 160 W 1 h에서 솔루션을 sonicate.
주의: 수 위는 sonicator 해야 유리병의 상단 보다 낮은 그래서 물을 유리병에 도입 되지 것입니다. - 원심 분리기 튜브에 솔루션을 전송.
- micropipette 추가할 증류수의 30 mL dropwise MWCNT-COOH 솔루션.
주의: 강한 발열 반응 증류수의 추가 발생합니다. 증류수를 천천히 추가 하 고 냉각을 위한 시간을 허용 합니다.
- micropipette 추가할 증류수의 30 mL dropwise MWCNT-COOH 솔루션.
- 12000 x g와 15 분 동안 실 온에서 MWCNT-COOH 솔루션 원심
주의: 원심 분리기를 작동 하는 경우는 원심 분리기 샘플 튜브 반대 같은 무게로 튜브를 배치 하 여 균형 유지 확인 하십시오. - 상쾌한 피 펫 및 1 mL 피 펫 팁을 제거 합니다. 피 펫 및 1 mL 피 펫 팁 에탄올 5 mL를 추가 합니다. 추가적인 pipetted 에탄올과 유리병의 벽을 씻어. 12000 x g와 15 분 동안 실내 온도에 솔루션 원심
- PH 종이 상쾌한의 pH를 결정 합니다. 세척 및 centrifuging 표면에 뜨는 pH 중립 될 때까지 반복 합니다.
- 모든 상쾌한을 제거 합니다. 침전 하 고 솔루션에서 MWCNT-COOH를 균등 하 게 분산을 증류수 1 mL를 추가 합니다. 건조까지 진공에서-60 ° C에서 솔루션을 freeze-dry.
2. 실버 나노 입자 증 착 MWCNTs에
- 50 mL 원뿔 튜브에서 MWCNT-COOH의 10 mg을 놓고 30 mL의 증류수로 희석 합니다. 60 ° C와 160 W 1 h 솔루션 sonicate
- 0.1 N AgNO3 의 6 mL 50 mL 원뿔 튜브에 배치 하 고 18 mL의 증류수로 희석. 60 ° C와 160 W 1 h 솔루션 sonicate
주의: Ag의 총 질량은 20%를 초과 하지 않는 그런 MWCNTs의 총 질량에 비례하여 AgNO3 를 추가 합니다. - 어 그 노3 솔루션 dropwise를 추가 피 펫 및 1 mL 피 펫 팁 MWCNTs 솔루션 sonicating 60 ° C와 160 AgNO3을 추가한 후 1 시간에 대 한 계속 sonicating W.에 혼합 하는 동안 합니다.
- 12000 x g와 15 분 동안 실내 온도에서 용액을 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. 원심 솔루션 및 제거는 상쾌한 두 추가 시간.
- Ag-MWCNTs 혼합물을 1 mL의 증류수를 추가 하 고 솔루션에 균등 하 게 침전을 분산. 에탄올의 5 mL을 추가 하 고 허용 1 시간 실 온에서 진행 하는 반응.
- 12000 x g와 15 분 동안 실내 온도에서 용액을 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.
- PH 종이 상쾌한의 pH를 결정 합니다. 세척 및 centrifuging 표면에 뜨는 pH 중립 될 때까지 반복 합니다.
- Ag-MWCNTs를 1 mL의 증류수를 추가 하 고 솔루션에서 균등 하 게 분산. 24 h에 대 한 진공에서-70 ° C에서 솔루션 freeze-dry
3. 존의 저해 시험
- 18.12 g R2A 한 천 1 L 플라스 크에 증류수의 믹스. 15 분 동안 121 ° C에 압력솥에 혼합 소독.
- 실내 온도에 냉각 젤을 허용 합니다. 단단한 매체를 준비 하는 경화 전에 접시에 젤의 10 mL를 배치 합니다.
- 단단한 매체에 박테리아의 장소 100 µ L. 스프레더를 사용 하 여 단단한 매체에 박테리아를 확산.
주의:이 절차는 알코올 램프로 조명 화학 증기 두건에서 실시 해야 합니다. - 48 h 30 ° C에서 요리를 품 어.
- 3.12 g R2A 국물의 1 L 플라스 크에 증류수의 믹스. 15 분 동안 121 ° C에 압력솥에 혼합 소독.
- 루프와 바늘을 사용 하 여 액체 매체에 성장된 식민지를 전송 하 고 180 rpm와 30 ° C에 인큐베이터에서 품 어
- 600에서 UV 분 광 광도 법에 의해 OD (광학 밀도) 값을 기록 세균성 성장을 측정을 시간 단위로 nm.
참고: R2A 한 천 R2A Methylobacterium 종 의 성장 위한 선호 한 때문에 표준 뮬러-힌 튼 천 보다는이 테스트에 사용 된 - 하단 agar를 준비 하는 페 트리 접시에 준비 된 R2A 한 천의 장소 10 mL.
- 3.12 g R2A 국물과 한 천의 8 g 1 L 증류수의 믹스. 하단 agar에이 젤의 15 분 장소 10 ml 121 ° C에서 압력솥에 혼합 소독.
- 50 µ L는 micropipette 살 균 종이 디스크에 Ag MWCNTs 솔루션의 로드.
- 건조 하 고 30 분 동안 자외선에서 진공 챔버에 Ag MWCNTs 샘플을 소독.
- Agar에 장소 Ag-MWCNTs 샘플입니다.
- 48 h 30 ° C에서 한 천 배지를 품 어.
- 저해12의 측정 영역입니다.
참고: 사용 하는 소프트웨어에 대 한 지침 참조에 포함 되어 있습니다.
4. 항균 테스트
- 반복 단계 3.1을 3.7 세균성 문화를 준비 합니다.
- 최대 OD에서 피 펫과 100 µ L 마이크로 피 펫 팁 신선한 액체 매체의 3 mL에 박테리아의 100 µ L를 접종.
- 5 준비 15 mL 원뿔 튜브에 제어 솔루션의 50 µ L 샘플. 각 관을 다음을 추가: 1) 메탄올; 2) 1000 µ g/mL MWCNT-COOH; MWCNTs-3) 50 µ g/mL Ag; MWMWCNTs-4) 40 µ g/mL Ag; MWCNTs-5) 30 µ g/mL Ag.
- 컨트롤은 위에서 설명한 대로 UV 분 광 광도 법에 따라 극대로 활성화 될 때까지 180 rpm와 30 ° C에서 품 어.
- 각 샘플의 OD 값을 측정 하 고 마이크 농도 계산. OD 값은 샘플 국물에 세균성 세포의 수와 직접적인 관련이 있습니다.
- 스프레더와 고체 매체에 교양된 박테리아 확산.
- 48 h 30 ° C에서 접시를 품 어.
- 세균성 식민지 및 측정 CFU 값 항균 활동12을 계산 합니다.
참고: 사용 하는 소프트웨어에 대 한 지침 참조에 포함 되어 있습니다.
5. 생존 분석 결과
- 인큐베이터에서 배양 세포를 제거한 후 매체를 흡입 하 고 PBS의 5 mL의 dropwise 워시로 세 번 세척.
- 1 분 후 씻어 셀 및 흡입에 PBS에 트립 신-EDTA의 1 mL 추가 합니다.
- 붙어 세포를 제거 하 고 접시를 누릅니다.
- DMEM (Dulbecco의 수정이 글의 중간)의 5 mL을 추가 하 고 셀을 제거 합니다. 3 분 x 200g에 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.
- DPBS와 섞어 1 mL를 추가 합니다.
- 자동 셀 카운팅 기계 솔루션의 10 µ L에서 세포를 계산.
참고: 셀 계산 기계 사용에 대 한 지침 참조13에 포함 됩니다.
- 장소 1 × 105 DMEM 솔루션을 포함 하는 6-잘 접시에 잘 당 AML12 세포의. 매체에는 10% (v/v) 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 살 균 항생제 포함 되어 있습니다.
- 5% CO2/95% 공기 환경에서 37 ° C에서 8 ~ 12 h에 대해 품 어.
- 흡입 한 흡 인기와 우물에서 상쾌한.
- 제어, NMS DMSO (디 메 틸 sulfoxide) 및 30-40 µ g/mL Ag MWCNT DMEM 1 mL의 구성 하는 각 샘플을 추가 합니다.
- 8 h 5% CO2/95% 공기 환경에서 37 ° C에서 품 어.
- 5 mL의 PBS로 세척 하 고 표면에 뜨는 샘플을 제거 합니다.
- 셀에 dropwise 준비 라이브/죽은 키트 (µ 2 mM EthD-1 20 L의 PBS의 10 mL에 DMSO에 4 m m calcein 오전 5 µ L)의 1 mL를 추가 합니다.
- 100 X 300 X에서 표준 형광 현미경으로 room temperature 30-45 분 또는 10 분 측정 형광에 대 한 37 ° C에서 품 어.
6. Trypan 블루 분석 결과
- 5.6.2 위의 통해 5.1 단계에 따라 샘플을 준비 합니다.
- 상쾌한을 제거 합니다.
- 1 x DPBS의 1 mL 접시 세척 하 고 가만히 따르다.
- 접시 및 문화에서 셀 분리에 3 분 동안 품 어 trypsin의 1 mL를 추가 합니다. 세포 배양 매체를 사용 하 여 접시를 세척 하 고 세포를 수집. 15 mL 튜브에 수집 된 셀 놓습니다.
- 튜브 200 g x 3 분 동안 4 ° C에서 원심
- 상쾌한을 삭제 합니다. 1 mL 신선한 매체의 셀 펠 릿을 추가 하 고 셀을 다시 해산.
- 분산 된 세포의 10 µ L trypan 블루의 10 µ L을 추가 하 고 자동 셀 카운팅 기계 셀을 카운트.
참고: 셀 계산 기계 사용에 대 한 지침 참조에 포함 되어 있습니다.
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Representative Results
전송 전자 현미경 (TEM) 이미지 Ag-MWCNTs (그림 1A 및 1B)의 형성을 확인합니다. 그들의 성공적인 합성 표면에 변화에 의해 확인 되었다. MWCNTs에 Ag 입자의 크기 계산 (그림 1C). 평균 입자 크기는 약 3.83 nm. Ag-MWCNTs로 합성의 XRD 패턴 그림 1D에 표시 됩니다. MWCNT;에 해당 하는 피크에 20-30 ° 나머지 봉우리 Ag에 해당합니다. 항균 성 활동 데이터는 그림 2에 표시 됩니다. 세균성 식민지 인구 Methylobacterium 컨트롤 (그림 2A);에 의해 확인 되었다 메탄올의 추가 감소 인구 103 번 (그림 2B), 그리고 MWCNT-COOH의 추가 감소 인구 108 (그림 2C) 시간. 식민지 수 없습니다 50 µ g/mL Ag MWCNT (그림 2D) 및 40 µ g/mL Ag MWCNT (그림 2E) 샘플에서 확인할 수 있습니다. 20 µ g/mL Ag MWCNT 샘플에서 인구 105 배 감소 되었다 (그림 2F). Methylobacterium (그림 3)에 대 한 억제 테스트 영역에서 억제의 영역 10 µ g/mL는 추가 될 때 확인 되었다. 억제의 존 하지 1 µ g/mL의 농도에서 관찰 되었다. 세포 독성 테스트에서 라이브/죽은 분석 결과 (그림 4) 메탄올 사용 되었다 때 부정적인 컨트롤 (그림 4A)에서 세포 독성의 부재와 긍정적인 컨트롤 (그림 4B)에서 세포 독성의 존재 확인. 그러나 (그림 4C) 40 µ g/mL Ag-MWCNTs의 추가 30 µ g/mL Ag-MWCNTs (Figure 4 D)의 세포 독성의 상당한 금액을 공개 하지 않았다 일부 세포 독성을 공개 했다. Trypan 블루 시험 수행된 (그림5) 컨트롤 (그림 5A), 메탄올 (그림 5B), 40 µ g/mL Ag-MWCNTs (그림 5C)과 30 µ g/mL Ag-MWCNTs (그림 5D) 샘플에 대 한 했다. 결과 30 µ g/mL Ag-MWCNTs에서 아주 작은 세포 독성은 확인 했다.
그림 1: Ag-MWCNTs의 물리 화학적 특성. Ag-MWCNTs;의 TEM 이미지 (A)와 (B) Ag-MWCNTs 가장을 통해 평가의 (C) 크기 분포 (n = 100); (D) Ag의 XRD 패턴-MWCNTs. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: Ag-MWCNTs Methylobacterium spp상대적인 항균 평가. (A) 제어, (B) 메탄올, (C) MWCNT-COOH, (D) 50 μ g/mL의 Ag-MWCNTs, (E) 40 μ g/mL의 Ag-MWCNTs, 그리고 (F) 30 μ g/mL Ag의-MWCNTs. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Ag-MWCNTs의 억제 시험의 영역.
그림 4: Ag에 대 한 생존 분석 셀-MWCNTs. Photomicrographs의 AML12 붙일 죽은 (빨간색)에 대 한 분류를 라이브 (녹색) 셀. (A) , (B) 메탄올, (C) 40 μ g/mL의 Ag-MWCNTs, 및 (D) 30 μ g/mL의 Ag-MWCNTs. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 30, 40μg/mL Ag-MWCNTs에 대 한 분석 실험 Trypan 블루. (A) , (B) 메탄올, (C) 40 μ g/mL의 Ag-MWCNTs, 및 (D) Ag의 30 μ g/mL-MWCNTs. (빨강: 죽은 세포; 블루: 라이브 셀) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기, 우리는 예금 된 Ag 나노 입자와 MWCNTs의 준비에 대 한 간단한 방법을 보고합니다. 이 포함 하는 실버 접한 상당한 항균 활동 및 본문에은 나노 입자의 통제 흡수에 대 한 최소한의 가능성을 보여 줍니다. 우리는 입증 합성된 Ag-MWCNTs의 30 µ g/mL는 포유류 간 세포를 무시할 수 세포 독성 Methylobacterium 종 에 대 한 항균 활동의 효과적인 수준. 상업 분야에 확장 하기 전에 추가 개선 및 biosafety 평가 Ag-MWCNTs에 대 한 요구는 환경 친화적이 고 저렴 한 Ag-MWCNTs를 생산 도울 수를 환 원제로 서 에탄올을 사용 하 여.
다음 포인트는 설명 했다. 다양 한 유형의 개발된 나노 재료와 박테리아를 파괴 하는 것이 가능 하다. 나노 입자 예금 될 수 있는 나노튜브 표면에 여러 사이트를 가능 하다. 항균 속성 크기와 표면에 예금 된은 나노 입자의 수를 제어 하 여 맞출 수 있습니다. 개발 된 나노 세균 세포에 독성이 있지만 적절 한 농도에서 인간과 동물 세포에 독성.
다음 메커니즘은 항균 활동에 대 한 제안. Ag MWCNT nanostructures 직접 문의 세균성 세포 표면, 세포 벽 손상 원인과 보조 산화 반응 산소 종의; 이러한 프로세스는 산화 스트레스에 결과. Ag MWCNT nanostructures Methylobacterium 종, 그로 인하여 biofilms의 대형을 제어 하는 유전자의 표현을 억제의 쿼럼 센 싱을 억제 하는 이온 출시 확인 되었습니다 했다.
현재 프로토콜의 한계 실버 나노 입자 Ag-MWCNTs 인체 실험에서 허용의 불확 실한 최대 금액 포함 됩니다. 이 프로토콜에서 Ag-MWCNTs의 30 µ g/mL 샘플에 포함 된은 나노 입자의 양을 추정 되었다 0.4 µ g/mL로 평균. 이 농도 이전 연구6,7,,89에서 보고 된 포유류 세포와 생체로 간주 됩니다. Ag-MWCNTs의 40 µ g/mL의 농도에서 세포 독성에 대 한 메커니즘을 결정 한 동안 혈 문화 접시의 하단에 첨부 파일 문화 중 Ag MWCNT 접촉의 가능성을 증가 수는 제안 합니다. 미래에 다른 문화 조건 하에서 세포 유형의 다양 한은 나노 입자의 상세한 독성 연구를 수행할 수 있습니다. 이러한 연구는 세포와 Ag MWCNT의 상호 작용의 메커니즘에 추가 정보를 제공할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 연구 재단의 Korea(NRF) 과학기술처와 ICT (No. 2017M3A7B8061942)를 통해 나노 소재 기술 개발 프로그램와 중앙 대학교 연구 보조금 (2016)에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 N silver nitrate | SIGMA-ALDRICH | 1090811000 | |
| Carbon nanotube, multi-walled | Tokyo Chemical Industry Co., LTD | 308068-56-6 | |
| R2A agar | MBcell | MB-R1129 | |
| R2A broth | MBcell | MB-R2230 | |
| Methylobacterium spp. | KCTC | 12618 | from Korea Collection for Type Cultures Daejeon Korea 12618, Daejon, Korea |
| LIVE/DEAD Cell imaging Kit | ThermoFisher SCIENTIFIC | R37601 | |
| AML12 | from Chungnam University, Dajeon, Korea | ||
| human PBMC | ATCC | PCS-800-011 | |
| TEM | JEOL | JEM-2100F | |
| XRD | Rigaku | D/MAX 2500 | Cu K photon source (40kV, 100mA) |
| JuLI Br | NanoEnTek | JULI-BRSC |
References
- Löndahl, J. Physical and Biological Properties of Bioaerosols. Bioaerosol Detection Technologies. , Springer. 33-48 (2014).
- Jennings, S., Moran, A., Carroll, C. Bioaerosols and biofilms. Biofilms in medicine, industry and environmental biotechnology. , IWA, London. 160-178 (2003).
- Flemming, H. -C., Wingender, J.
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrobial agents and chemotherapy. 45 (4), 999-1007 (2001).
- Doronina, N. V., et al. Methylobacterium suomiense sp. nov. and Methylobacterium lusitanum sp. nov., aerobic, pink-pigmented, facultatively methylotrophic bacteria. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 52 (3), 773-776 (2002).
- Seo, Y., et al. Antibacterial activity and cytotoxicity of multiwalled carbon nanotubes decorated with silver nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 9, 4621-4629 (2014).
- Chen, X., Schluesener, H. Nanosilver: a nanoproduct in medical application. Toxicologyletters. 176 (1), 1-12 (2008).
- Singh, M., et al. Nanotechnology in medicine and antibacterial effect of silver nanoparticles. Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures. 3 (3), 115-122 (2008).
- Morones, J. R., et al. The bactericidal effect of silver nanoparticles. Nanotechnology. 16 (10), 2346 (2005).
- Martinez-Castanon, G., et al. Synthesis and antibacterial activity of silver nanoparticles with different sizes. Journal of Nanoparticle Research. 10 (8), 1343-1348 (2008).
- Lok, C. -N., et al. Silver nanoparticles: partial oxidation and antibacterial activities. JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry. 12 (4), 527-534 (2007).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide Home Page. , Available from: http://imageJ.nih.gov/ij/docs/guide (2010).
- NanoEnTek Inc. Juli Br User Guide. , Hwaseong, Korea. Available from: http://www.nanoentek.com/upload/product/11/JuLI%20Br_User%20manual%20(V.1.6).pdf (2012).
