Summary
В этом исследовании были синтезированы антимикробной наноматериалов кислотного окисления многостенными углеродными нанотрубками и последующих редуктивной осаждения наночастиц серебра. Антимикробной активности и цитотоксичность тесты были выполнены с наноматериалы как подготовлено.
Abstract
В этом исследовании многостенные углеродные нанотрубки (MWCNTs) относились с водного раствора серной кислоты решение сформировать на основе кислорода функциональной группы. Серебряный MWCNTs были подготовлены редуктивной осаждения серебра из водного раствора AgNO3 на окисленных MWCNTs. Учитывая уникальный цвет CNTs, невозможно применить их к минимальной концентрации тормозящий или анализов митохондриальной токсичности для оценки токсичности и антибактериальные свойства, поскольку они будут мешать анализов. Ингибирование зоны и минимальная бактерицидная концентрация для Ag-MWCNTs были измерены и Live/мертвые и Трипановый синий анализов были использованы для оценки токсичности и антибактериальные свойства без мешать с цветом нанотрубок.
Introduction
Конечной целью данного исследования является сделать экологически антибактериальные наноматериалов, который может подавлять рост бактерий, что форма биопленки. Эти антибактериальные наноматериалов имеют потенциал, чтобы преодолеть проблемы токсичности и антибиотикам сопротивление широко используемых химических веществ или антибактериальной химических соединений. Биопленки – гидратированных внеклеточного полимерных вещество (EPS), которое состоит из полисахаридов, белков, нуклеиновых кислот и липидов1,2. Биоплёнки предотвращения проникновения посторонних веществ и помогают бактерии растут энергично3,4. Биоплёнки вызывают запах и хронические инфекционные заболевания5,6. Methylobacterium spp., например, растет, придерживаясь места, где вода всегда присутствует или где трудно обеспечить бактериальных искоренения на постоянной основе, например теплообменников кондиционеров воздуха, душевые и медицинские приборы. Эти типы биоплёнки вызывают запах и хронические инфекционные заболевания5,6.
Как правило химические вещества или антибактериальной химических соединений используются для подавляют рост бактерий, которые формируют биопленки. Появление устойчивых к антибиотикам бактерий и озабоченности по поводу безопасности в естественных условиях химических веществ являются движущей необходимость разработки новых материалов для предотвращения образования биопленки и подавляют рост бактерий.
В этом исследовании противомикробные наноматериалов синтезируются которые свободны от антибиотикорезистентности и токсичности. Серебро является известным антимикробное вещество, и недавние события в нанонауки и нанотехнологии привели к активные исследования в антимикробным эффекты металлических наночастиц7,8. Недавние исследования сообщили, что небольшой размер и высокое отношение поверхности к объему наночастиц приводят к увеличению антибактериальную активность9,10,11.
Наноматериалы, представленные здесь сочетают наночастиц серебра с повышенной противомикробными свойствами и углеродных нанотрубок с высоким соотношением сторон, тем самым увеличивая площадь поверхности на единицу объема. Сфабрикованные серебряных наночастиц-нанотрубок Углекомпозит экспонатов значительный антимикробные свойства и минимальная токсичность для человека и животных клеток. Синтетических процессов в предыдущих исследованиях используют опасные восстановителями как NaBH4, формамид, диметилформамид и гидразина. Этот процесс является сложным, опасные и трудоемким. Синтетический процесс сообщили здесь использует этанол как восстанавливающего агента в значительно менее опасные.
Ингибирование зоны и минимальная бактерицидная концентрация (МБК) для Ag-MWCNTs были измерены; Live/мертвые и Трипановый синий анализов были использованы для оценки токсичности и антибактериальными свойствами. Минимальная концентрация тормозной (MIC) и анализов Митохондриальная токсичность (МТТ) не были выполнены из-за необычного цвета углеродных нанотрубок, которые бы помешали анализов. Наконец было определено минимальная концентрация для предотвращения роста Methylobacterium spp. не затрагивая mammalian клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Мунт окисления
- Измерьте 30-50 мг Мунт в 50-мл флаконе. Постепенно добавить 8 мл H2так4: HNO решение3 (90% начальной концентрации, vol/vol 3:1), Пипетка с 1 мл наконечники.
Предупреждение: Этот препарат должны проводиться в химической зонта.- Разрешить 30 мин для экзотермической реакции для завершения.
- Sonicate решение на 60-80 ° C и 160 W за 1 ч до тех пор, пока Мунт оседает в нижней части флакона.
ВНИМАНИЕ: Уровень воды в sonicator должны быть ниже, чем в верхней части флакона, таким образом, чтобы вода не будет вводиться в пробирку. - Передача решения в пластиковых пробирок.
- С микропипеткой добавьте 30 мл дистиллированной воды каплям Мунт-COOH решение.
Предупреждение: Сильной экзотермической реакции происходит во время добавления дистиллированной воды. Добавьте дистиллированную воду медленно и дать время для охлаждения.
- С микропипеткой добавьте 30 мл дистиллированной воды каплям Мунт-COOH решение.
- Центрифуга Мунт-COOH решение в 12000 x g и комнатной температуре в течение 15 мин.
Предупреждение: При эксплуатации центрифуги, убедитесь, что центрифуги остается сбалансированным, поставив трубку с такой же вес, напротив метро образцов. - Удалите супернатант с пипеткой и кончик Пипетка 1 мл. Добавьте 5 мл этанола с пипеткой и кончик Пипетка 1 мл. Промойте стены флакона этанолом дополнительные накапаны. Центрифуга для решения в 12000 x g и комнатной температуре в течение 15 мин.
- Определите pH супернатант рН бумагой. Повторите мойки и центрифугирования до тех пор, пока супернатанта рН нейтральным.
- Удалите все супернатант. Добавьте 1 мл дистиллированной воды, чтобы осадить и разгонять Мунт-COOH равномерно в растворе. Freeze-Dry решения-60 ° c в вакууме до полного высыхания.
2. Серебряные наночастицы осаждения на MWCNTs
- 10 мг Мунт-COOH в 50-мл Конические трубки и разбавить 30 мл дистиллированной воды. Sonicate раствор при 60 ° C и 160 Вт на 1 ч.
- 6 мл 0,1 N AgNO3 в 50-мл Конические трубки и разбавляют 18 мл дистиллированной воды. Sonicate раствор при 60 ° C и 160 Вт на 1 ч.
Предупреждение: Добавьте3 AgNO пропорционально общей массы MWCNTs таким образом, чтобы общая масса Ag не превышает 20%. - Добавьте решение3 AgNO каплям MWCNTs решение с пипеткой и кончик Пипетка 1 мл при sonicating смеси на 60 ° C и 160 W. продолжить sonicating за 1 ч после добавления AgNO3.
- Центрифуга для решения в 12000 x g и комнатной температуре в течение 15 мин и удалить супернатант. Центрифуга для решения и удалить супернатант еще два раза.
- Добавить 1 мл дистиллированной воды в смеси Ag-MWCNTs и разгонять осадок равномерно в решении. Добавьте 5 мл этанола и позволяют реакции приступить при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Центрифуга для решения в 12000 x g и комнатной температуре в течение 15 мин и удалить супернатант.
- Определите pH супернатант рН бумагой. Повторите мойки и центрифугирования до супернатанта рН нейтральным.
- Добавить 1 мл дистиллированной воды в Ag-MWCNTs и равномерно расходятся в растворе. Freeze-Dry раствор-70 ° c в вакууме за 24 ч.
3. зона ингибирование тест
- Mix 18.12 g агар R2A и 1 Л дистиллированной воды в колбу. Стерилизуйте смесь в автоклаве при температуре 121 ° C 15 мин.
- Разрешить гель остыть при комнатной температуре. Место 10 мл геля в чашках Петри до затвердения подготовить сплошной среды.
- Место 100 мкл бактерий на твердом носителе. Распространение бактерий на твердой питательной, с помощью спредера.
Предупреждение: Данная процедура должна проводиться в химической Зонта, освещенный с лампой алкоголя. - Инкубируйте блюда при 30 ° C в течение 48 часов.
- 3.12 g R2A отвара смешайте с 1 Л дистиллированной воды в колбу. Стерилизуйте смесь в автоклаве при температуре 121 ° C 15 мин.
- Передача выросли колоний в жидкой среде с помощью цикла и иглы и инкубировать в инкубаторе на 180 об/мин и 30 ° C.
- Запишите значение ОД (оптическая плотность) методом УФ-спектрофотометрии на 600 Нм на почасовой основе для измерения роста бактерий.
Примечание: R2A агар используется в этот тест, а не стандартный агар Мюллер Хинтон, потому что R2A является предпочтительным агар для роста Methylobacterium spp. - Место 10 мл подготовленных R2A агар в чашке Петри подготовить агар снизу.
- 3.12 g R2A бульона и 8 g агар смешайте с 1 Л дистиллированной воды. Стерилизуйте смесь в автоклаве при температуре 121 ° C для 15 минут место 10 мл этого геля на нижней агар.
- Загрузите 50 мкл раствора Ag-MWCNTs на диске стерильные бумаги с микропипеткой.
- Сухие и стерилизовать Ag-MWCNTs образца в вакуумной камере под УФ на 30 мин.
- Место Ag-MWCNTs образца на агаре.
- Инкубируйте плита агара при 30 ° C в течение 48 часов.
- Мера зона ингибирование12.
Примечание: Инструкции для используемого программного обеспечения включены в ссылки.
4. антибактериальная тест
- Повторите шаги 3.1 до 3,7 подготовить бактериальной культуры.
- На максимальной ОД прививать 100 мкл бактерий в 3 мл свежие жидкие среды с микро дозаторов кончиком пипетки и 100 мкл.
- Подготовка пяти 50 мкл образцы решения управления в 15 мл конические трубы. Добавьте следующее к каждой трубы: 1) метанола; 2) 1000 мкг/мл Мунт COOH; 3) Ag 50 мкг/мл MWCNTs; 4) Ag 40 мкг/мл MWMWCNTs; 5) Ag 30 мкг/мл MWCNTs.
- Инкубируйте на 180 об/мин и 30 ° C до тех пор, пока элемент управления является максимально активным, как определено методом УФ-спектрофотометрии, как описано выше.
- Измерить ОД значение каждого образца и рассчитать концентрацию MIC. OD значение непосредственно связано с количество бактериальных клеток в образце бульон.
- Распространения культивируемых бактерий на твердом носителе с распространитель.
- Инкубируйте блюдо на 30 ° C в течение 48 часов.
- Граф бактериальных колоний и значения CFU мера для определения антибактериальной активности12.
Примечание: Инструкции для используемого программного обеспечения включены в ссылки.
5. жизнеспособность Assay
- После удаления культуры клеток из инкубатора, всасывания среднего и мыть три раза с прикапывают мыть 5 мл ФСБ.
- Добавьте 1 mL трипсина-ЭДТА в PBS промывают клеток и всасывания через 1 мин.
- Нажмите пластину для удаления застрявшего клеток.
- Добавьте 5 мл DMEM (средний Дульбекко изменение орел) и затем удалить ячейки. Центрифугуйте образцы на 200 g x 3 мин и удалить супернатант.
- Добавьте 1 mL DPBS и перемешать.
- Подсчитать ячейки в 10 мкл раствора с автоматической системы подсчета клеток.
Примечание: Инструкции для подсчета клеток машины включены в ссылки на13.
- Место 1 × 105 AML12 клеток на хорошо в шести ну плите содержащая DMEM решение. Средство содержит плода бычьим сывороточным 10% (v/v) и 1% стерильных антибиотиков.
- Инкубируйте пластина для 8-12 ч при 37 ° C в среде воздуха /95% 5% CO2.
- Всасывания супернатант из скважин с аспиратором.
- Добавьте каждый образец состоит из контроля, NMS-ДМСО (диметилсульфоксид) и 30-40 мкг/мл Ag-Мунт по 1 мл DMEM.
- Инкубируйте при 37 ° C в среде воздуха /95% 5% CO2на 8 ч.
- Удалите супернатант и стирать образцы с 5 мл ФСБ.
- Добавьте 1 mL комплекта готовы жить/мертвых (20 мкл 2 мм EthD-1 с 5 мкл Флуорексон AM 4 мм в ДМСО в 10 мл PBS) каплям к ячейке.
- Инкубируйте на технические для 30-45 мин или 37 ° C на 10 мин измерения флуоресценции со стандартным флуоресцентной микроскопии на 100 X или 300 X.
6. Трипановый синий Assay
- Подготовка проб согласно шаги 5.1 через 5.6.2 выше.
- Удалите супернатант.
- Вымойте тарелка с 1 мл раствора 1 x DPBS и сцеживаться.
- Добавьте 1 mL трипсина пластины и Инкубируйте 3 мин для отсоединения клетки от культуры. Использование ячейки культуры среднего мыть тарелку и собрать клетки. Место сбора клеток в 15 мл.
- Центрифуга трубки в 200 x g и 4 ° C на 3 мин.
- Выбросите супернатант. Добавьте 1 mL свежих средних клеток Пелле и повторно дисперсных клетки.
- 10 мкл Трипановый синий с 10 мкл рассеянных клеток и подсчитать количество ячеек с автоматической системы подсчета клеток.
Примечание: Инструкции для подсчета клеток машины включены в ссылки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Передача электронной микроскопии (ТЕА) изображения подтверждают формирование Ag-MWCNTs (рис. 1A и 1B). Их успешный синтез был подтвержден изменения поверхности заряда. Был рассчитан размер частиц Ag, хранение на MWCNTs (рис. 1 c). Средний размер частиц был приблизительно 3.83 Нм. XRD шаблон как синтезированные Ag-MWCNTs показан на рис. 1 d. Пик на 20-30° соответствует Мунт; остальные вершины соответствуют Ag. Антимикробная активность данных показано на рисунке 2. Бактериальные колонии населения были подтверждены Methylobacterium управления (рисунок 2A); Добавление метанола сокращение населения 103 раза (рис. 2B), и добавление Мунт-COOH сокращение населения 108 раз (рис. 2 c). Колонии не может определяться в 50 мкг/мл Ag-Мунт (Рисунок 2D) и 40 мкг/мл Ag-Мунт (Рисунок 2E) образцов. В образце 20 мкг/мл Ag-Мунт населения было сокращено 105 раз (Рисунок 2F). В зоне теста ингибирования против Methylobacterium (рис. 3) определены зоны ингибирования при добавлении 10 мкг/мл. В зону торможения не наблюдалось в концентрации 1 мкг/мл. В тесте, цитотоксичность Live/мертвые пробирного (рис. 4) подтвердил отсутствие цитотоксичность в отрицательный контроль (рис. 4A) и присутствие цитотоксичность в позитивного управления (рис. 4B) при использовании метанола. Добавление 40 мкг/мл Ag-MWCNTs (рис. 4 c) выявили некоторые цитотоксичность, однако добавление 30 мкг/мл Ag-MWCNTs (igure 4 DF) не выявило значительное количество цитотоксичности. Трипановый синий пробирного был выполненных (рис.5) для элемента управления (Рисунок 5A), метанол (Рисунок 5B), Ag-MWCNTs (рис. 5 c) 40 мкг/мл и 30 мкг/мл образцов Ag-MWCNTs (рис. 5 d). Результаты подтвердили, что существует очень мало цитотоксичность на 30 мкг/мл Ag-MWCNTs.
Рисунок 1: физико-химическая характеристика Ag-MWCNTs. (A) и (B) ТЕА образы Ag-MWCNTs; (C) размер распределение Ag-MWCNTs оцененной через ТЕА (n = 100); (D) XRD шаблон АГ-MWCNTs. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Антибактериальные Оценка Ag-MWCNTs относительно Methylobacterium СПП. (A) управления, метанол (B) , (C) Мунт-COOH, (D) 50 мкг/мл Ag-MWCNTs, (E) 40 мкг/мл Ag-MWCNTs и (F) 30 мкг/мл АГ-MWCNTs. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Зона теста ингибирования Ag-MWCNTs.
Рисунок 4: сотовый жизнеспособности анализов для Ag-MWCNTs. микрофотографиями из AML12, дневно помечены для мертвых (красный) и живой клетки (зелёный). (A) управления, метанол (B) , (C) 40 мкг/мл Ag-MWCNTs, и (D) 30 мкг/мл АГ-MWCNTs. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Трипановый синий assays для 30 и 40μg/мл Ag-MWCNTs. (A) управления, метанол (B) , (C) 40 мкг/мл Ag-MWCNTs, и (D) 30 мкг/мл АГ-MWCNTs. (красный: мертвые клетки; синий: живой клетки) пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы приводим простой метод для подготовки MWCNTs с хранение Ag наночастиц. Это Наноматериал Серебросодержащие демонстрирует значительный антимикробной активностью и минимальный потенциал для неконтролируемое поглощение наночастиц серебра в организме. Мы демонстрируем, что синтезированные Ag-MWCNTs по 30 мкг/мл-это эффективный уровень антибактериальной активности против Methylobacterium spp. с незначительным цитотоксичность клеток печени млекопитающих. Хотя до расширения в коммерческом секторе требуются дополнительные улучшения и оценки биобезопасности для Ag-MWCNTs, использование этанола в качестве восстанавливающего агента могут помочь производить экологически чистых и недорогих Ag-MWCNTs.
Демонстрируются следующие моменты. Это позволяет уничтожить различные типы бактерий с развитыми наноматериалов. Это позволяет инженер несколько сайтов на поверхности нанотрубок, на которой могут быть зачислены наночастиц серебра. Антибактериальные свойства также могут быть приспособлены, управляя размер и количество наночастиц серебра, которые осаждаются на поверхности. Развитые наноматериалов токсичны для клеток бактерий, но нетоксична для человека и животных клеток в соответствующих концентрациях.
Для антибактериальной активности предлагается следующий механизм. Ag-Мунт наноструктур непосредственно связаться с поверхности бактериальной клетки, повреждение клеточной стенки и причиной вторичного окисления реактивнооксигенных видов; Эти процессы приводят в оксидативного стресса. AG-Мунт наноструктур были подтверждены выпустить ионы серебра, которые тормозят кворума Methylobacterium spp., тем самым препятствуя экспрессии генов, которые регулируют образование биопленки.
Ограничения текущего протокола будет включать неопределенный максимальное количество наночастиц серебра и Ag-MWCNTs допустимых в человеческих испытаний. В этом протоколе количество наночастиц серебра, включенных в выборку 30 мкг/мл Ag-MWCNTs оценивалась как 0.4 мкг/мл, в среднем. Эта концентрация рассматривается как биологически совместимого с mammalian клеток, как сообщалось в предыдущих исследований6,,78,9. В то время как механизм для цитотоксичность в концентрации 40 мкг/мл Ag-MWCNTs непредсказуемо, предлагается, что без вложения клеток крови в нижней части плиты культуры может увеличить вероятность контакта Ag-Мунт во время культуры. В будущем может быть выполнена подробные токсичность наночастиц серебра с различных типов клеток в условиях иной культуры. Эти исследования могут представить дополнительную информацию о механизме Ag-Мунт взаимодействия с клетками.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Чун-Ang университета научно-исследовательских грантов (2016) и программы развития технологии нано-материалов через Национальный исследовательский фонд Korea(NRF) финансируется министерством науки и ИКТ (№ 2017M3A7B8061942).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 N silver nitrate | SIGMA-ALDRICH | 1090811000 | |
| Carbon nanotube, multi-walled | Tokyo Chemical Industry Co., LTD | 308068-56-6 | |
| R2A agar | MBcell | MB-R1129 | |
| R2A broth | MBcell | MB-R2230 | |
| Methylobacterium spp. | KCTC | 12618 | from Korea Collection for Type Cultures Daejeon Korea 12618, Daejon, Korea |
| LIVE/DEAD Cell imaging Kit | ThermoFisher SCIENTIFIC | R37601 | |
| AML12 | from Chungnam University, Dajeon, Korea | ||
| human PBMC | ATCC | PCS-800-011 | |
| TEM | JEOL | JEM-2100F | |
| XRD | Rigaku | D/MAX 2500 | Cu K photon source (40kV, 100mA) |
| JuLI Br | NanoEnTek | JULI-BRSC |
References
- Löndahl, J. Physical and Biological Properties of Bioaerosols. Bioaerosol Detection Technologies. , Springer. 33-48 (2014).
- Jennings, S., Moran, A., Carroll, C. Bioaerosols and biofilms. Biofilms in medicine, industry and environmental biotechnology. , IWA, London. 160-178 (2003).
- Flemming, H. -C., Wingender, J.
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrobial agents and chemotherapy. 45 (4), 999-1007 (2001).
- Doronina, N. V., et al. Methylobacterium suomiense sp. nov. and Methylobacterium lusitanum sp. nov., aerobic, pink-pigmented, facultatively methylotrophic bacteria. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 52 (3), 773-776 (2002).
- Seo, Y., et al. Antibacterial activity and cytotoxicity of multiwalled carbon nanotubes decorated with silver nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 9, 4621-4629 (2014).
- Chen, X., Schluesener, H. Nanosilver: a nanoproduct in medical application. Toxicologyletters. 176 (1), 1-12 (2008).
- Singh, M., et al. Nanotechnology in medicine and antibacterial effect of silver nanoparticles. Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures. 3 (3), 115-122 (2008).
- Morones, J. R., et al. The bactericidal effect of silver nanoparticles. Nanotechnology. 16 (10), 2346 (2005).
- Martinez-Castanon, G., et al. Synthesis and antibacterial activity of silver nanoparticles with different sizes. Journal of Nanoparticle Research. 10 (8), 1343-1348 (2008).
- Lok, C. -N., et al. Silver nanoparticles: partial oxidation and antibacterial activities. JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry. 12 (4), 527-534 (2007).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide Home Page. , Available from: http://imageJ.nih.gov/ij/docs/guide (2010).
- NanoEnTek Inc. Juli Br User Guide. , Hwaseong, Korea. Available from: http://www.nanoentek.com/upload/product/11/JuLI%20Br_User%20manual%20(V.1.6).pdf (2012).
