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Bioengineering

Síntesis de nanotubos de carbono multipared modificados con nanopartículas de plata y la evaluación de sus actividades antibacterianas y propiedades citotóxicas

Published: May 10, 2018 doi: 10.3791/57384
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 3, 2
1Center for Biomaterials, Biomedical Research Institute, Korea Institute of Science and Technology, 2School of Integrative Engineering, Chung-Ang University, 3Division of Synthetic Biology and Regenerative Medicine, Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University
* These authors contributed equally

Summary

En este estudio, nanomateriales antimicrobianos fueron sintetizados por oxidación ácida de nanotubos de carbono pirólisis y posterior deposición reductiva de nanopartículas de plata. Se realizaron pruebas de actividad y la citotoxicidad antimicrobianas con los nanomateriales como preparado.

Abstract

En este estudio, los nanotubos de carbono multipared (ello) fueron tratados con una solución acuosa de ácido sulfúrico para formar un grupo funcional a base de oxígeno. Ello plata fueron preparado por la deposición reductiva de plata de una solución acuosa de AgNO3 en ello oxidado. Dado el color único de los CNTs, no era posible aplicar a la concentración mínima inhibitoria o ensayos de toxicidad mitocondrial para evaluar las características de toxicidad y antibacteriana, ya que pueden interferir con los ensayos. La zona de inhibición y la concentración bactericida mínima para la Ag-ello se midieron y análisis de azul de tripano y vivos/muertos se utilizaron para medir las características de toxicidad y antibacteriano sin interferir en el color de los CNTs.

Introduction

El objetivo de este estudio es hacer medio ambiente nanomateriales antibacteriano que pueden inhibir el crecimiento de bacterias forma biofilms. Estos nanomateriales antibacterianos tienen el potencial para superar los problemas de resistencia de toxicidad y antibiótico de antibióticos compuestos químicos o de productos químicos comúnmente usados. Un biofilm es una sustancia polimérica extracelular hidratada (EPS) que se compone de polisacáridos, proteínas, ácidos nucleicos y lípidos1,2. Biopelículas protegen la entrada de sustancias extrañas y ayudan a las bacterias a crecer vigorosamente3,4. Biofilms provocan olor y enfermedades infecciosas crónicas5,6. Methylobacterium spp., por ejemplo, crece adhiriéndose a lugares donde el agua está siempre presente o donde es difícil garantizar la Erradicación bacteriana en una base continua, como intercambiadores de calor de aire acondicionado, duchas y sanitarios. Estos tipos de biofilms provocan olor y enfermedades infecciosas crónicas5,6.

Normalmente, se utilizan productos químicos o compuestos químicos antibióticos para inhibir el crecimiento de bacterias que forman biopelículas. La aparición de bacterias resistentes a los antibióticos y las preocupaciones sobre seguridad en vivo de los productos químicos están impulsando la necesidad de desarrollar nuevos materiales para prevenir la formación de biofilms y para inhibir el crecimiento de bacterias.

En este estudio, se sintetizan nanomateriales antimicrobianos que están libres de toxicidad y resistencia a los antibióticos. La plata es una sustancia antimicrobiana conocida, y los acontecimientos recientes en la Nanociencia y la nanotecnología han llevado a investigación sobre los efectos antimicrobianos de nanopartículas de metal7,8. Estudios recientes han informado que el pequeño tamaño y alta relación superficie a volumen de las nanopartículas como resultado aumento de la actividad antibacteriana9,10,11.

Los nanomateriales presentados combinan nanopartículas de plata con nanotubos de carbono con un alto cociente de aspecto, lo que aumenta el área superficial por unidad de volumen y aumento de propiedades antimicrobianas. El compuesto de plata fabricado en carbono nanopartículas nanotubos presenta importantes propiedades antimicrobianas y mínima toxicidad para las células humanas y animales. Los procesos sintéticos en estudios anteriores utilizan peligrosos agentes reductores como el NaBH4, formamida, dimetilformamida e hidracina. El proceso es complicado, peligroso y desperdiciador de tiempo. El proceso sintético registrado aquí utiliza etanol como agente reductor significativamente menos peligroso.

Se midieron la zona de inhibición y la concentración bactericida mínima (CBM) para el Ag-ello; Vivo/muerto y ensayos de azul de tripano fueron utilizados para medir la toxicidad y propiedades antibacterianas. Concentración mínima inhibitoria (CMI) y ensayos de toxicidad mitocondrial (MTT), no se realizaron debido al color inusual de los nanotubos de carbono que habría interferido con los ensayos. Finalmente, se determinó la concentración mínima para prevenir el crecimiento de Methylobacterium spp sin afectar a células de mamíferos.

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Protocol

1. MWCNT oxidación

  1. Miden 30-50 mg de MWCNT en un frasco de 50 mL. Agregar lentamente 8 mL de H2hasta4: solución HNO3 (concentración inicial de 90%, 3:1 vol/vol) con una pipeta con puntas de pipeta de 1 mL.
    PRECAUCIÓN: Esta preparación debe realizarse en una campana de humos químicos.
    1. Deje 30 minutos para la reacción exotérmica completar.
  2. Someter a ultrasonidos la solución a 60-80 ° C y 160 W durante 1 hora hasta MWCNT se instala en la parte inferior del frasco.
    PRECAUCIÓN: El nivel del agua en el sonicador debería ser inferior a la parte superior del frasco para que no se le introduce agua en el frasco.
  3. Transferir la solución a un tubo de centrífuga.
    1. Con una micropipeta, agregar 30 mL de agua destilada gota a gota a la solución de MWCNT-COOH.
      PRECAUCIÓN: Una fuerte reacción exotérmica ocurre durante la adición de agua destilada. Agregar agua destilada poco a poco y dar tiempo para el enfriamiento.
  4. Centrifugue la solución MWCNT-COOH a 12.000 x g y temperatura ambiente durante 15 minutos.
    PRECAUCIÓN: Al utilizar una centrífuga, garantizar la centrifugadora equilibrada mediante la colocación de un tubo con el mismo peso frente al tubo de muestra.
  5. Quite el sobrenadante con una pipeta y pipeta de 1 mL. Añadir 5 mL de etanol con una pipeta y pipeta de 1 mL. Enjuague las paredes del frasco con etanol pipeteado adicional. Centrifugue la solución a 12.000 x g y temperatura ambiente durante 15 minutos.
    1. Determinar el pH del sobrenadante con papel pH. Repita el lavado y centrifugar hasta que el sobrenadante pH es neutro.
  6. Retire el sobrenadante de todos. Añadir 1 mL de agua destilada para precipitar y MWCNT-COOH se dispersan uniformemente en la solución. Congelación en solución a-60 ° C en vacío hasta que se seque.

2. deposición de nanopartículas plata en ello

  1. 10 mg de MWCNT-COOH en un tubo cónico de 50 mL y diluir con 30 mL de agua destilada. Someter a ultrasonidos solución a 60 ° C y 160 W durante 1 hora.
  2. Coloque 6 mL de 0.1 N de AgNO3 en un tubo cónico de 50 mL y diluir con 18 mL de agua destilada. Someter a ultrasonidos solución a 60 ° C y 160 W durante 1 hora.
    Atención: Añadir AgNO3 en proporción a la masa total de ello tal que la masa total de Ag no exceda del 20%.
  3. Añadir gota a gota la solución de AgNO3 a la solución de ello con una pipeta y pipeta de 1 mL mientras sonicando la mezcla a 60 ° C y 160 w. continuar sonicando durante 1 h después de añadir el de AgNO3.
  4. Centrifugue la solución a 12.000 x g y temperatura ambiente durante 15 minutos y eliminar el sobrenadante. Centrifugar la solución y eliminar el sobrenadante dos veces más.
  5. Añadir 1 mL de agua destilada a la mezcla de Ag-ello y dispersar el precipitado en la solución. Añadir 5 mL de etanol y permitir la reacción proceder a temperatura ambiente durante 1 h.
  6. Centrifugue la solución a 12.000 x g y temperatura ambiente durante 15 minutos y eliminar el sobrenadante.
  7. Determinar el pH del sobrenadante con papel pH. Repita el lavado y centrifugar hasta que el sobrenadante pH es neutro.
  8. Añadir 1 mL de agua destilada a Ag-ello y dispersar uniformemente en la solución. Congelación de la solución a-70 ° C en vacío durante 24 horas.

3. zona de inhibición de la prueba

  1. Mezclar 18,12 g de agar R2A y 1 L de agua destilada en un matraz. Esterilizar la mezcla en un autoclave a 121 ° C durante 15 minutos.
  2. Permita que el gel se enfríe a temperatura ambiente. Colocar 10 mL de gel en placas de Petri antes de endurecer para preparar el medio sólido.
  3. Coloque 100 μl de las bacterias en medio sólido. Trasmitir las bacterias en el medio sólido, utilizando un esparcidor.
    PRECAUCIÓN: Este procedimiento debe realizarse en una campana de vapores químicos, iluminada con una lámpara de alcohol.
  4. Incubar las placas a 30 ° C por 48 h.
  5. Mezcla de 3,12 g de R2A caldo con 1 L de agua destilada en un matraz. Esterilizar la mezcla en un autoclave a 121 ° C durante 15 minutos.
  6. Transferir las colonias crecidas en un medio líquido mediante un bucle y aguja e incubar en una incubadora a 180 rpm y 30 ° C.
  7. Registre el valor de OD (densidad óptica) por espectrofotometría UV a 600 nm en una base por hora para medir el crecimiento bacteriano.
    Nota: Se utilizó agar R2A en esta prueba, en lugar de agar Mueller-Hinton estándar, porque R2A es el recomendado: agar para crecimiento de Methylobacterium spp.
  8. Lugar 10 mL de agar de R2A preparado en una caja Petri para preparar un agar de fondo.
    1. Mezcla de 3,12 g de caldo de R2A y 8 g de agar con 1 L de agua destilada. Esterilizar la mezcla en un autoclave a 121 ° C durante 15 min lugar 10 mL de este gel en el agar de la parte inferior.
  9. Carga de 50 μl de solución de Ag-ello sobre disco de papel estéril con una micropipeta.
    1. Secar y esterilizar ello Ag muestra en una cámara de vacío bajo UV luz durante 30 minutos.
  10. Lugar Ag-ello muestra en el agar.
  11. Incubar la placa de agar a 30 ° C durante 48 h.
  12. Zona de medida de inhibición12.
    Nota: Se incluyen instrucciones para el software utilizado en las referencias.

4. prueba antibacteriano

  1. Repita los pasos 3.1 a 3.7 para preparar cultivo bacteriano.
  2. En OD máximo, inocular 100 μl de las bacterias en 3 mL de medio líquido fresco con una punta de pipeta micro pipeta y 100 μl.
  3. Preparar cinco 50 muestras μl de la solución de control en tubos cónicos de 15 mL. Agregue lo siguiente a cada tubo: 1) metanol; 2) 1000 μg/mL MWCNT-COOH; 3) 50 μg/mL Ag-ello; 4) 40 μg/mL Ag-MWMWCNTs; 5) 30 μg/mL Ag-ello.
  4. Incubar a 30 ° C y 180 rpm hasta que el control es máximo activo determinado por espectrofotometría UV como se describió anteriormente.
  5. Medir el valor de OD de cada muestra y calcular la concentración de MIC. El valor de OD está directamente relacionada con el número de células bacterianas en el caldo de la muestra.
  6. Trasmitir las bacterias cultivadas en un medio sólido con un esparcidor.
  7. Incubar la placa a 30 ° C por 48 h.
  8. Recuento de colonias bacterianas y los valores de UFC de medida para determinar la actividad antibacteriana12.
    Nota: Se incluyen instrucciones para el software utilizado en las referencias.

5. Análisis de viabilidad de

  1. Después de quitar las células de cultivo de la incubadora, el medio de la succión y lavar tres veces con un lavado gota a gota 5 ml de PBS.
  2. Añadir 1 mL de tripsina-EDTA en PBS a la célula de lavado y succión después de 1 minuto.
    1. Toque en la placa para eliminar las células pegadas.
  3. Añadir 5 mL de DMEM (medio modificado Eagle de Dulbecco) y luego retire las células. Centrifugar las muestras a 200 x g durante 3 minutos y retirar el sobrenadante.
    1. Añadir 1 mL de DPBS y mezclar.
    2. Contar las células en 10 μl de la solución con una máquina automatizada de conteo de células.
      Nota: Se incluyen instrucciones para la máquina de conteo celular utilizado en las referencias13.
  4. Lugar 1 × 105 de AML12 células por pocillo en una placa de seis pozos que contengan solución DMEM. El medio contiene 10% (v/v) de suero fetal bovino y antibiótico estéril 1%.
  5. Incubar la placa de 8-12 h a 37 ° C en un ambiente de aire 95% 5% CO2.
  6. El sobrenadante de los pozos con un aspirador de succión.
    1. Agregar cada muestra conformada de 30-40 μg/mL Ag MWCNT a 1 mL de DMEM, NMS-DMSO (dimetil sulfóxido) y control.
    2. Incubar a 37 ° C en un ambiente de aire 95% 5% CO2para 8 h.
  7. Eliminar el sobrenadante y lavar las muestras con 5 mL de PBS.
  8. Añadir 1 mL de preparado kit live/dead (20 μl de 2 mM EthD-1 con 5 μl de 4 mM calceína AM en DMSO en 10 mL de PBS) gota a gota a la celda.
  9. Incubar a colocados durante 30-45 min o 37 ° C durante 10 minutos la fluorescencia medida con microscopía de fluorescencia estándar en 100 X o 300 X.

6. ensayo de azul de tripán

  1. Preparar las muestras según pasos 5.1 a través de 5.6.2 arriba.
  2. Eliminar el sobrenadante.
  3. Lave la placa con 1 mL de 1 x DPBS y decantar.
  4. Añadir 1 mL de tripsina de la placa e incubar durante 3 min separar las células de cultura. Utilizar medio de cultivo celular que lave la placa y recoger las células. Colocar células colectadas en un tubo de 15 mL.
  5. Centrifugar el tubo a 200 x g y 4 ° C por 3 minutos.
  6. Deseche el sobrenadante. Añadir 1 mL de medio fresco a pellets celulares y volver a dispersar las células.
  7. Añadir 10 μl de azul tripán con 10 μl de células dispersas y contar las células con una máquina automatizada de conteo de células.
    Nota: Se incluyen instrucciones para la máquina de conteo celular utilizado en las referencias.

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Representative Results

Imágenes de microscopía electrónica (TEM) de transmisión confirman la formación de Ag-ello (figura 1A y 1B). Su síntesis exitosa fue confirmada por el cambio en la carga de superficie. Se calculó el tamaño de las partículas de Ag en el ello (figura 1). El tamaño de partícula promedio fue aproximadamente 3.83 nm. El patrón de DRX de la Ag-ello sintetizado como se muestra en la figura 1. El pico a 20-30° corresponde a MWCNT; los picos restantes corresponden a Ag. Datos de la actividad antimicrobiana se muestran en la figura 2. Las poblaciones de Colonia bacteriana fueron confirmadas por Methylobacterium control (figura 2A); adición de metanol redujo la población 103 veces (figura 2B), y adición de MWCNT-COOH redujo la población 108 veces (figura 2). Colonias no se podrían identificar en los 50 μg/mL de Ag-MWCNT (Figura 2D) y 40 muestras de Ag-MWCNT (Figura 2E) μg/mL. En la muestra de 20 μg/mL Ag MWCNT la población disminuyó 10 veces5 (figura 2F). En la zona de la prueba de inhibición contra Methylobacterium (figura 3), se identificó la zona de inhibición cuando se agregó 10 μg/mL. No se observó una zona de inhibición a una concentración de 1 μg/mL. En la prueba de citotoxicidad, el ensayo del Live/Dead (figura 4) confirmó la ausencia de citotoxicidad en el control negativo (Figura 4A) y la presencia de citotoxicidad en el control positivo (Figura 4B) cuando se utilizó metanol. La adición de 40 μg/mL Ag-ello (figura 4) reveló algunos citotoxicidad, sin embargo la adición de 30 μg/mL (Ffigura 4 D) Ag-ello no reveló una cantidad significativa de citotoxicidad. Un ensayo de azul de tripano fue realizada (figura5) para el control (figura 5A), metanol (figura 5B), Ag-ello (figura 5) de 40 μg/mL y 30 muestras de Ag-ello (figura 5) μg/mL. Los resultados confirmaron que hubo muy poca citotoxicidad en 30 μg/mL Ag-ello.

Figure 1
Figura 1: caracterización fisicoquímica de Ag ello. (A) y (B) imágenes TEM de Ag-ello; (C) distribución de tamaño de Ag-ello evaluada mediante TEM (n = 100); (D) patrón de DRX de Ag-ello. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Evaluación antibacteriana de Ag-ello en relación con Methylobacterium spp. (A) de control, (B) metanol, (C) MWCNT-COOH, (D) 50 μg/mL de Ag-ello, (E) 40 μg/mL de Ag-ello y (F) 30 μg/mL de Ag-ello. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Zona de la prueba de inhibición de Ag-ello.

Figure 4
Figura 4: Análisis de viabilidad de la célula para Ag-ello. fotomicrografías de AML12 fluorescencia están etiquetados para los muertos (rojo) y células (verde) en vivo. (A) control, (B) metanol, (C) 40 μg/mL de Ag-ello y (D) 30 μg/mL de Ag-ello. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: ensayos de azul de tripano para 30 y 40μg/mL Ag ello. (A) control, (B) metanol, (C) 40 μg/mL de Ag-ello, y (D) 30 μg/mL de Ag-ello. (rojo: células muertas; azul: viva de las células) haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aquí, Divulgamos un método simple para la preparación de ello con nanopartículas de Ag depositadas. Este nanomaterial con plata demuestra actividad antibacteriana substancial y mínimo potencial de absorción incontrolada de nanopartículas de plata en el cuerpo. Demostramos que 30 μg/mL de Ag sintetizado-ello es un nivel eficaz de actividad antibacteriana contra Methylobacterium spp con la insignificante citotoxicidad a hepatocitos de mamífero. Aunque mejoras adicionales y evaluaciones de bioseguridad para Ag-ello están necesario antes de la expansión en el sector comercial, usando etanol como agente reductor podría ayudar a producir Ag-ello ecológico y barato.

Se demuestran los siguientes puntos. Es posible destruir diferentes tipos de bacterias con los nanomateriales desarrollados. Es posible diseñar múltiples sitios sobre una superficie de nanotubos que se pueden depositar las nanopartículas de plata. Propiedades antibacterianas también pueden ser adaptados por controlar el tamaño y el número de nanopartículas de plata que se depositan en la superficie. Los nanomateriales desarrollados son tóxicos para las células bacterianas pero no tóxicos para las células humanas y animales en concentraciones adecuadas.

Se propone el siguiente mecanismo para la actividad antibacteriana. Las nanoestructuras de Ag-MWCNT directamente en contacto con la superficie de la célula bacteriana dañan la pared celular y causan oxidación secundaria de especies reactivas de oxígeno; estos procesos resultan en estrés oxidativo. AG-MWCNT nanoestructuras han sido confirmados para liberar iones de plata que impiden la detección de quórum de Methylobacterium spp., inhibiendo la expresión de los genes que rigen la formación de biofilms.

Las limitaciones del actual protocolo incluye la máxima cantidad indeterminada de nanopartículas de plata y Ag-ello permitido en humanos. En este protocolo, la cantidad de nanopartículas de plata incluidas en la muestra de 30 μg/mL de Ag-ello se estimó como 0,4 μg/mL, en promedio. Esta concentración se considera biocompatible con las células de mamíferas, como se informó en anteriores estudios6,7,8,9. Mientras que el mecanismo de citotoxicidad en la concentración de 40 μg/mL de Ag-ello es indeterminado, se propone que la no fijación de la parte inferior de las placas de cultivo de las células sanguíneas puede aumentar la probabilidad de contacto de Ag-MWCNT en cultura. En el futuro, pueden realizarse estudios de toda toxicidad de nanopartículas de plata con una gran variedad de tipos de la célula bajo condiciones de cultivo diferentes. Estos estudios pueden proporcionar información adicional sobre el mecanismo de la interacción Ag-MWCNT con las células.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por becas de investigación de la Universidad Chung-Ang (2016) y por el programa de desarrollo de la tecnología de Nano Material a través de la Fundación de investigación nacional de Korea(NRF) financiado por el Ministerio de ciencia y las TIC (Nº 2017M3A7B8061942).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 N silver nitrate SIGMA-ALDRICH 1090811000
Carbon nanotube, multi-walled Tokyo Chemical Industry Co., LTD 308068-56-6
R2A agar MBcell MB-R1129
R2A broth MBcell MB-R2230
Methylobacterium spp. KCTC 12618 from Korea Collection for Type Cultures Daejeon Korea 12618, Daejon, Korea
LIVE/DEAD Cell imaging Kit ThermoFisher SCIENTIFIC R37601
AML12 from Chungnam University, Dajeon, Korea
human PBMC ATCC PCS-800-011
TEM JEOL JEM-2100F
XRD Rigaku D/MAX 2500 Cu K photon source (40kV, 100mA)
JuLI Br NanoEnTek JULI-BRSC 

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References

  1. Löndahl, J. Physical and Biological Properties of Bioaerosols. Bioaerosol Detection Technologies. , Springer. 33-48 (2014).
  2. Jennings, S., Moran, A., Carroll, C. Bioaerosols and biofilms. Biofilms in medicine, industry and environmental biotechnology. , IWA, London. 160-178 (2003).
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Seo, Y., Park, C., Son, J., Lee, K., Hwang, J., Jo, Y., Lee, D., Khan, M. S., Chavan, S. G., Choi, Y., Kim, D., Gilad, A. A., Choi, J. Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties. J. Vis. Exp. (135), e57384, doi:10.3791/57384 (2018).

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