Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Syntesen av Multi-walled kolnanorör modifierad med Silver nanopartiklar och utvärdering av sina antibakteriella aktiviteter och cytotoxiska egenskaper

Published: May 10, 2018 doi: 10.3791/57384
* These authors contributed equally

Summary

I denna studie var antimikrobiella nanomaterial syntetiseras av sura oxidation av multiwalled kolnanorör och efterföljande reduktiv nedfall av Silvernanopartiklar. Antimikrobiella aktivitet och cytotoxicitet tester utfördes med den som förberedda nanomaterialen.

Abstract

I denna studie behandlades multi-walled kolnanorör (MWCNTs) med en vattenlösning sulfuric syra lösning att bilda en syre-baserade funktionell grupp. Silver MWCNTs utarbetades av reduktiv nedfall av silver från en vattenlösning av AgNO3 på de oxiderade MWCNTs. Tanke CNTs unika färg, var det inte möjligt att tillämpa dem på den minsta hämmande koncentrationen eller mitokondriell toxicitet analyser att utvärdera toxicitet och antibakteriella egenskaper, eftersom de skulle störa analyserna. Den hämning zonen och minsta baktericida koncentrationen för de Ag-MWCNTs mättes och Live/Dead och Trypan blå analyser användes för att mäta den toxicity och antibakteriella egenskaper utan att störa CNTs färg.

Introduction

Det yttersta målet för denna studie är att göra miljövänliga antibakteriella nanomaterial som kan hämma tillväxten av bakterier som bildar biofilmer. Dessa antibakteriella nanomaterial har potential att övervinna de toxicitet och antibiotika problem motstånd vanliga kemikalier eller antibiotika kemiska föreningar. En biofilm är en hydrerad extracellulära polymera substans (EPS) som består av polysackarider, proteiner, nukleinsyror och lipider1,2. Biofilmer förhindra intrång av främmande ämnen och hjälpa bakterier växa kraftigt3,4. Biofilm orsaka lukt och kroniska infektionssjukdomar5,6. Methylobacterium spp., exempelvis växer genom att följa platser där vatten är alltid närvarande eller där det är svårt att säkerställa bakteriell utrotning på en kontinuerlig basis, såsom luftkonditioneringen värmeväxlare, duschrum och medicintekniska produkter. Dessa typer av biofilm orsaka lukt och kroniska infektionssjukdomar5,6.

Vanligtvis används kemikalier eller antibiotika kemiska föreningar att hämma tillväxten av bakterier som bildar biofilmer. Uppkomsten av antibiotikaresistenta bakterier och oron i vivo säkerhet av kemikalier driver behovet av att utveckla nya material för att förhindra bildandet av biofilmer och hämmar tillväxten av bakterier.

I denna studie syntetiseras antimikrobiell nanomaterial som är fria från antibiotikaresistens och toxicitet. Silver är en välkänd antimikrobiell substans, och senaste utvecklingen inom nanovetenskap och nanoteknik har lett till aktiv forskning om antimikrobiella effekterna av metall nanopartiklar7,8. Nyligen genomförda studier har rapporterat att den lilla storleken och hög yta till volym förhållande av nanopartiklar resultera i ökad antibakteriella aktivitet9,10,11.

De nanomaterial som presenteras häri kombinera Silvernanopartiklar med ökad antimikrobiella egenskaper och kolnanorör med hög bildförhållandet, därigenom öka ytan per volymenhet. Fabricerade silver nanopartiklar-carbon nanotube sammansatt uppvisar betydande antimikrobiella egenskaper och minimal toxicitet för människors och djurs celler. De syntetiska processerna i tidigare studier använda farliga reduktionsmedel såsom NaBH4, formamid, dimetylformamid och hydrazin. Processen är komplicerad, farliga och tidskrävande. Syntetiska processen rapporterade använder här etanol som betydligt mindre farliga reduktionsmedel.

Den hämning zonen och minsta baktericida koncentrationen (MBC) för de Ag-MWCNTs mättes; Live/Dead och Trypan blå analyser användes för att mäta toxicitet och antibakteriella egenskaper. Minsta hämmande koncentration (MIC) och mitokondriell toxicitet (MTT) analyser utfördes inte på grund av ovanliga färgen på den kolnanorör som skulle ha stört analyserna. Slutligen fastställdes den lägsta koncentrationen att förhindra tillväxt av Methylobacterium spp. utan att däggdjurs-celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. MWCNT Oxidation

  1. Mäta 30-50 mg av MWCNT en 50 mL injektionsflaska. Tillsätt långsamt 8 mL av en H24: HNO3 lösning (90% initial koncentration, 3:1 vol/vol) med pipett med 1 mL pipett tips.
    Varning: Detta preparat måste utföras i dragskåp kemiska.
    1. Låt 30 min för den exoterma reaktionen att slutföra.
  2. Sonikera lösningen vid 60-80 ° C och 160 W för 1 h tills MWCNT lägger sig på botten av injektionsflaskan.
    Varning: Vattennivån i den någon sonikator bör vara lägre än toppen av injektionsflaskan så att vatten inte kommer att införas i injektionsflaskan.
  3. Överför lösningen till ett centrifugrör.
    1. Med en mikropipett, tillsätt 30 mL destillerat vatten droppvis till lösning för MWCNT-COOH.
      Varning: En starkt exoterm reaktion inträffar under tillsats av destillerat vatten. Tillsätt destillerat vatten långsamt och ge tid för kylning.
  4. Centrifugera MWCNT-COOH lösningen på 12 000 x g och rumstemperatur 15 min.
    Varning: När du använder en centrifug, säkerställa centrifugen förblir balanserat genom att placera ett rör med samma vikt mittemot prov röret.
  5. Ta bort supernatanten med pipett och 1 mL pipettspetsen. Tillsätt 5 mL etanol med en pipett och 1 mL pipettspetsen. Skölj väggarna i injektionsflaskan med ytterligare för etanol. Centrifugera lösningen vid 12 000 x g och rumstemperatur 15 min.
    1. Bestämma pH i supernatanten med pH-papper. Upprepa tvätt och centrifugering tills supernatanten pH är neutralt.
  6. Ta bort alla supernatanten. Tillsätt 1 mL destillerat vatten till fällningen och sprida MWCNT-COOH jämnt i lösning. Kaseinbanden lösning vid-60 ° C under vakuum tills de är torra.

2. silver nanopartiklar nedfall på MWCNTs

  1. Placera 10 mg MWCNT-COOH i en 50 mL konisk slang och späd med 30 mL destillerat vatten. Sonikera lösning vid 60 ° C och 160 W för 1 h.
  2. Placera 6 mL 0,1 N AgNO3 i en 50 mL konisk slang och späd med 18 mL destillerat vatten. Sonikera lösning vid 60 ° C och 160 W för 1 h.
    FÖRSIKTIGHET: Lägga till AgNO3 i proportion till den sammanlagda massan av MWCNTs så att den totala massan av Ag inte överstiger 20%.
  3. Lägga till AgNO3 lösningen droppvis till MWCNTs lösningen med en pipett och 1 mL pipettspetsen medan sonicating blandningen vid 60 ° C och 160 W. Fortsätt sonicating för 1 h efter tillägger den AgNO3.
  4. Centrifugera lösningen vid 12 000 x g och rumstemperatur 15 min och ta bort supernatanten. Centrifugera lösningen och avlägsna supernatanten två ytterligare gånger.
  5. Tillsätt 1 mL destillerat vatten till Ag-MWCNTs blandningen och skingra fällningen jämnt i lösningen. Tillsätt 5 mL etanol och reaktionen att gå vidare i rumstemperatur i 1 h.
  6. Centrifugera lösningen vid 12 000 x g och rumstemperatur 15 min och ta bort supernatanten.
  7. Bestämma pH i supernatanten med pH-papper. Upprepa tvätt och centrifugering tills supernatanten pH är neutralt.
  8. Tillsätt 1 mL destillerat vatten till Ag-MWCNTs och sprida jämnt i lösning. Kaseinbanden lösningen vid-70 ° C under vakuum för 24 h.

3. zon av inhibitionstest

  1. Blanda 18.12 g R2A agar och 1 L destillerat vatten i en mätkolv. Sterilisera blandningen i autoklav vid 121 ° C i 15 min.
  2. Låt gelen svalna i rumstemperatur. Placera 10 mL gel i petriskålar före härdning att förbereda fast medium.
  3. Plats 100 µL av bakterier på solid medium. Sprida bakterier på solid medium med en spridare.
    Varning: Denna procedur skall utföras i kemiska dragskåp lit med alkohol lampa.
  4. Inkubera rätter vid 30 ° C för 48 h.
  5. Blanda 3,12 g R2A buljong med 1 L destillerat vatten i en mätkolv. Sterilisera blandningen i autoklav vid 121 ° C i 15 min.
  6. Överföra de odlade kolonierna till ett flytande medium med en ögla och nål och inkubera i en inkubator på 180 rpm och 30 ° C.
  7. Registrera OD (optisk densitet) värdet av UV spektrofotometri på 600 nm på timbasis att mäta bakterietillväxt.
    Obs: R2A agar användes i detta test, i stället för standard Mueller-Hinton ägarn, eftersom R2A är rekommenderad ägarn för tillväxt av Methylobacterium spp.
  8. Plats 10 mL beredd R2A agar i en petriskål att förbereda en botten agar.
    1. Blanda 3,12 g R2A buljong och 8 g agar med 1 L destillerat vatten. Sterilisera blandningen i autoklav vid 121 ° C i 15 min. Lägg 10 mL av denna gel på det botten-agar.
  9. Ladda 50 µL Ag-MWCNTs lösning på sterila papper skiva med en mikropipett.
    1. Torka och sterilisera Ag-MWCNTs prov i en vakuumkammare under UV-ljus för 30 min.
  10. Plats Ag-MWCNTs prov på agar.
  11. Inkubera agarplattan vid 30 ° C för 48 h.
  12. Åtgärd zon hämning12.
    Obs: Instruktioner för programvara som används finns i referenserna.

4. antibakteriella Test

  1. Upprepa steg 3.1 till 3,7 att förbereda bakterieodling.
  2. Vid maximal OD, Inokulera 100 µL av bakterier in i 3 mL färsk flytande medium med en pipett och 100-µL mikro pipettspetsen.
  3. Förbereda fem 50 µL prov kontroll lösning i 15 mL koniska rör. Lägg till följande varje tub: 1) metanol; (2) 1000 µg/mL MWCNT-COOH; (3) 50 µg/mL Ag-MWCNTs; (4) 40 µg/mL Ag-MWMWCNTs; (5) 30 µg/mL Ag-MWCNTs.
  4. Inkubera vid 180 rpm och 30 ° C tills kontrollen aktiveras maximally som bestäms av UV spektrofotometri som beskrivs ovan.
  5. Mät det OD-värdet av varje prov och beräkna MIC koncentrationen. OD värdet är direkt relaterad till antalet bakteriella celler i provet buljong.
  6. Sprida de odlade bakterierna på ett fast medium med en spridare.
  7. Inkubera skålen vid 30 ° C för 48 h.
  8. Antalet bakteriekolonier och CFU måttvärdena att bestämma antibakteriell aktivitet12.
    Obs: Instruktioner för programvara som används finns i referenserna.

5. bärkraft Assay

  1. Efter att kultur cellerna från inkubator, sug på medellång och tvätta tre gånger med en droppvis tvätta 5 ml PBS.
  2. Tillsätt 1 mL av trypsin-EDTA i PBS till tvättade cell- och sug efter 1 min.
    1. Knacka plattan för att ta bort fastnat celler.
  3. Tillsätt 5 mL DMEM (Dulbeccos modifierade örnens Medium) och sedan ta bort celler. Centrifugera proverna vid 200 x g i 3 min och avlägsna supernatanten.
    1. Tillsätt 1 mL av DPBS och blanda.
    2. Räkna celler i 10 µL av lösningen med en automatiserad cell-räknar maskin.
      Obs: Instruktioner för cell-räknar maskin som används finns i referenser13.
  4. Plats 1 × 105 av AML12 celler per brunn i en sex-well platta innehållande DMEM lösning. Mediet innehåller 10% (v/v) fetalt bovint serum och 1% steril antibiotikum.
  5. Inkubera plattan för 8-12 h vid 37 ° C i en 5% CO2/95% air-miljön.
  6. Sug supernatanten från brunnarna med en insugningsventil.
    1. Lägg till varje prov består av kontroll, NMS-DMSO (dimetyl sulfoxid) och 30-40 µg/mL Ag-MWCNT 1 ml DMEM.
    2. Inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2/95% luft miljö för 8 h.
  7. Ta bort supernatanten och tvätta prover med 5 mL PBS.
  8. Tillsätt 1 mL beredd live/dead kit (20 µL av 2 mM EthD-1 med 5 µL av 4 mM calcein AM i DMSO i 10 mL PBS) droppvis till cellen.
  9. Inkubera vid room temperature för 30-45 min eller 37 ° C i 10 min. mått fluorescens med standard fluorescensmikroskopi 100 X eller 300 X.

6. Trypan blå Assay

  1. Förbereda prover enligt steg 5.1 genom 5.6.2 ovan.
  2. Ta bort supernatanten.
  3. Tvätta plattan med 1 mL av 1 x DPBS och Dekantera.
  4. Tillsätt 1 mL av trypsin att plattan och inkubera i 3 min att lossa cellerna från kultur. Använd cellodlingsmedium att tvätta plattan och samla celler. Placera insamlade celler i en 15 mL tub.
  5. Centrifugera röret vid 200 x g- och 4 ° C för 3 min.
  6. Kassera supernatanten. Tillsätt 1 mL färsk medium till cellpelleten och åter sprida cellerna.
  7. Tillsätt 10 µL av trypan blå med 10 µL av spridda celler och räkna cellerna med en automatiserad cell-räknar maskin.
    Obs: Instruktioner för cell-räknar maskin som används finns i referenserna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Transmission Electron Microscopy (TEM) bilder bekräfta bildandet av Ag-MWCNTs (figur 1A och 1B). Deras lyckade syntes bekräftades av förändringen i ytladdning. Storleken på Ag partiklarna deponeras på MWCNTs beräknades (figur 1 c). Genomsnittlig partikelstorlek var cirka 3,83 nm. XRD mönstret av de som-syntetiserade Ag-MWCNTs visas i figur 1 d. Toppen på 20-30° motsvarar MWCNT; de återstående topparna motsvarar Ag. Antimikrobiella aktivitetsdata visas i figur 2. Bakteriella kolonin populationer bekräftades av Methylobacterium kontroll (figur 2A); tillägg av metanol minskade befolkningen 103 gånger (figur 2B), och tillägg av MWCNT-COOH minskade befolkningen 108 gånger (figur 2 c). Kolonierna kunde inte identifieras i de 50 µg/mL Ag-MWCNT (figur 2D) och 40 µg/mL Ag-MWCNT (figur 2E) prover. I 20 µg/mL Ag-MWCNT urvalet befolkningen reducerades 105 gånger (figur 2F). Zonplanera av hämning identifierades i zonen för inhibitionstest mot Methylobacterium (figur 3), när 10 µg/mL lades till. En zon av hämningen observerades inte vid en koncentration på 1 µg/mL. I cytotoxicitet test bekräftade Live/Dead analysen (figur 4) avsaknad av cytotoxicitet i den negativa kontrollen (figur 4A) och förekomsten av cytotoxicitet i den positiva kontrollen (figur 4B) när metanol användes. Tillägg av 40 µg/mL Ag-MWCNTs (figur 4 c) avslöjade några cytotoxicitet, men tillägg av 30 mikrog/mL Ag-MWCNTs (Figur 4 D) inte visade en betydande mängd cytotoxicitet. En trypan blå assay var utförda (figur5) för kontroll (figur 5A), metanol (figur 5B), 40 µg/mL Ag-MWCNTs (figur 5 c) och 30 µg/mL Ag-MWCNTs (figur 5 d) prover. Resultaten bekräftade att det fanns mycket lite cytotoxicitet 30 mikrog/mL Ag-MWCNTs.

Figure 1
Figur 1: fysikalisk-kemisk karakterisering av Ag-MWCNTs. (A) och (B) TEM bilder av Ag-MWCNTs; (C) storlek distribution av Ag-MWCNTs bedömt via TEM (n = 100); (D) XRD mönster av Ag-MWCNTs. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Antibakteriella utvärdering av Ag-MWCNTs i förhållande till Methylobacterium spp. (A) kontroll, (B) metanol, (C) MWCNT-COOH, (D) 50 μg/mL Ag-MWCNTs, (E) 40 μg/mL Ag-MWCNTs och (F) 30 μg/mL Ag-MWCNTs. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Zon av hämning test av Ag-MWCNTs.

Figure 4
Figur 4: Cell livskraft analyser för Ag-MWCNTs. mikrofotografier av AML12 som fluorescently är märkta för döda (röd) och lever (grön) celler. (A) kontroll, (B) metanol, (C) 40 μg/mL Ag-MWCNTs och (D) 30 μg/mL Ag-MWCNTs. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Trypan blå-analyser för 30 och 40μg/mL Ag-MWCNTs. (A) kontroll, (B) metanol, (C) 40 μg/mL Ag-MWCNTs, och (D) 30 μg/mL Ag-MWCNTs. (Red: döda celler; blå: levande celler) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi rapporterar här, en enkel metod för beredning av MWCNTs deponerade Ag nanopartiklar. Detta silver-innehåller nanomaterial visar betydande antibakteriell aktivitet och minimal risk för okontrollerad absorption av Silvernanopartiklar i kroppen. Vi visar att 30 mikrog/mL av syntetiserade Ag-MWCNTs är en effektiv nivå av antibakteriell aktivitet mot Methylobacterium spp. med försumbar cytotoxicitet till leverceller. Även om det krävs ytterligare förbättringar och biosäkerhet bedömningar för Ag-MWCNTs innan expansion inom den kommersiella sektorn, kunde med etanol som reduktionsmedel hjälpa till att producera miljövänliga och billiga Ag-MWCNTs.

Följande punkter demonstreras. Det är möjligt att förstöra olika typer av bakterier med den utvecklade nanomaterialen. Det är möjligt att konstruera flera platser på en nanotube yta som Silvernanopartiklar kan deponeras. Antibakteriella egenskaper kan också skräddarsys genom att kontrollera storlek och antal Silvernanopartiklar som deponeras på ytan. De utvecklade nanomaterial är giftigt för bakterieceller men är giftfritt till människors och djurs celler i lämpliga koncentrationer.

Den följande mekanismen föreslås för den antibakteriella aktiviteten. Ag-MWCNT nanostrukturerna direkt kontakta bakteriella cellens yta, skada cellväggen och orsaka sekundära oxidation av reaktiva syreradikaler; dessa processer leda till oxidativ stress. AG-MWCNT nanostrukturer har bekräftats för att släppa silverjoner som hämmar den quorum sensing Methylobacterium spp., och hämmar därigenom ett uttryck för de gener som styr bildningen av biofilmer.

Begränsningar av det nuvarande protokollet skulle omfatta ej fastställd maximal mängd silver nanopartiklar och Ag-MWCNTs tillåtna i mänskliga försök. I detta protokoll beräknades beloppet av Silvernanopartiklar ingår i 30 mikrog/mL urvalet av Ag-MWCNTs som 0,4 µg/mL, i genomsnitt. Denna koncentration anses vara biokompatibla med däggdjursceller som rapporterats i tidigare studier6,7,8,9. Mekanismen för cytotoxicitet på koncentrationen av 40 µg/mL Ag-MWCNTs är obestämd, föreslås det att de icke-attachment blodkroppar till botten av kultur plattor kan öka sannolikheten för Ag-MWCNT kontakt under kultur. I framtiden, kan detaljerade studier av Silvernanopartiklar med en mängd olika celltyper under olika odlingsbetingelser utföras. Dessa studier kan ge ytterligare information om Ag-MWCNT Interaktionsmekanismen med celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av Chung-Ang University forskningsanslag (2016) och Nano-Material teknik utvecklingsprogrammet genom den nationella forskning stiftelsen av Korea(NRF) finansieras av ministeriet för vetenskap och IKT (nr 2017M3A7B8061942).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 N silver nitrate SIGMA-ALDRICH 1090811000
Carbon nanotube, multi-walled Tokyo Chemical Industry Co., LTD 308068-56-6
R2A agar MBcell MB-R1129
R2A broth MBcell MB-R2230
Methylobacterium spp. KCTC 12618 from Korea Collection for Type Cultures Daejeon Korea 12618, Daejon, Korea
LIVE/DEAD Cell imaging Kit ThermoFisher SCIENTIFIC R37601
AML12 from Chungnam University, Dajeon, Korea
human PBMC ATCC PCS-800-011
TEM JEOL JEM-2100F
XRD Rigaku D/MAX 2500 Cu K photon source (40kV, 100mA)
JuLI Br NanoEnTek JULI-BRSC 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Löndahl, J. Physical and Biological Properties of Bioaerosols. Bioaerosol Detection Technologies. , Springer. 33-48 (2014).
  2. Jennings, S., Moran, A., Carroll, C. Bioaerosols and biofilms. Biofilms in medicine, industry and environmental biotechnology. , IWA, London. 160-178 (2003).
  3. Flemming, H. -C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 623-633 (2010).
  4. Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrobial agents and chemotherapy. 45 (4), 999-1007 (2001).
  5. Doronina, N. V., et al. Methylobacterium suomiense sp. nov. and Methylobacterium lusitanum sp. nov., aerobic, pink-pigmented, facultatively methylotrophic bacteria. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 52 (3), 773-776 (2002).
  6. Seo, Y., et al. Antibacterial activity and cytotoxicity of multiwalled carbon nanotubes decorated with silver nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 9, 4621-4629 (2014).
  7. Chen, X., Schluesener, H. Nanosilver: a nanoproduct in medical application. Toxicologyletters. 176 (1), 1-12 (2008).
  8. Singh, M., et al. Nanotechnology in medicine and antibacterial effect of silver nanoparticles. Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures. 3 (3), 115-122 (2008).
  9. Morones, J. R., et al. The bactericidal effect of silver nanoparticles. Nanotechnology. 16 (10), 2346 (2005).
  10. Martinez-Castanon, G., et al. Synthesis and antibacterial activity of silver nanoparticles with different sizes. Journal of Nanoparticle Research. 10 (8), 1343-1348 (2008).
  11. Lok, C. -N., et al. Silver nanoparticles: partial oxidation and antibacterial activities. JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry. 12 (4), 527-534 (2007).
  12. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide Home Page. , Available from: http://imageJ.nih.gov/ij/docs/guide (2010).
  13. NanoEnTek Inc. Juli Br User Guide. , Hwaseong, Korea. Available from: http://www.nanoentek.com/upload/product/11/JuLI%20Br_User%20manual%20(V.1.6).pdf (2012).

Tags

Bioteknik fråga 135 biofilm multi-walled carbon nanotube metall nanopartiklar antibakteriella egendom cytotoxicitet bakterier
Syntesen av Multi-walled kolnanorör modifierad med Silver nanopartiklar och utvärdering av sina antibakteriella aktiviteter och cytotoxiska egenskaper
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seo, Y., Park, C., Son, J., Lee, K., More

Seo, Y., Park, C., Son, J., Lee, K., Hwang, J., Jo, Y., Lee, D., Khan, M. S., Chavan, S. G., Choi, Y., Kim, D., Gilad, A. A., Choi, J. Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties. J. Vis. Exp. (135), e57384, doi:10.3791/57384 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter