Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Syntese av Multi vegger Karbonnanorør endret med Silver nanopartikler og evaluering av sine antibakterielle aktiviteter og cytotoksiske egenskaper

Published: May 10, 2018 doi: 10.3791/57384
* These authors contributed equally

Summary

I denne studien var antimikrobielle nanomaterialer syntetisert av Sure oksidasjon av multiwalled Karbonnanorør og påfølgende reductive deponering av silver nanopartikler. Antimikrobiell aktivitet og cytotoksisitet tester ble utført med som forberedt nanomaterialer.

Abstract

I denne studien ble multi vegger Karbonnanorør (MWCNTs) behandlet med en vandig svovelsyre løsning å danne en oksygen-baserte funksjonsgruppe. Sølv MWCNTs ble utarbeidet av reductive avsetning av sølv fra en vandig løsning av AgNO3 på oksidert MWCNTs. Gitt unike fargen på CNTs, var det ikke mulig å bruke dem på minimum inhibitoriske konsentrasjon eller mitokondrie toksisitet analyser vurdere toksisitet og antibakterielle egenskaper, siden de ville forstyrre analyser. Den hemming sonen og minimum bakteriedrepende konsentrasjon for Ag-MWCNTs ble målt og Live/døde og Trypan blå analyser ble brukt til å måle giftighet og antibakterielle egenskaper uten å forstyrre fargen på CNTs.

Introduction

Det endelige målet med denne studien er å gjøre miljøvennlig antibakterielle nanomaterialer som kan hemme veksten av bakterier som skjemaet biofilm. Disse antibakterielle nanomaterialer har potensial til å overvinne giftighet og antibiotika motstand problemene med vanlige kjemikalier eller antibiotika kjemiske forbindelser. En biofilm er et hydrert ekstracellulære polymere stoff (EPS) som består av polysakkarider, proteiner, atomer syren og lipider1,2. Biofilm forhindre inntrenging av fremmedstoffer og hjelpe bakterier vokse kraftig3,4. Biofilm føre lukt og kronisk infeksjonssykdommer5,6. Methylobacterium spp., for eksempel vokser ved å følge steder hvor vann er alltid tilstede eller der det er vanskelig å sikre bakteriell utrydding på en kontinuerlig basis, som klimaanlegg Varmevekslere, dusjrom og medisinsk utstyr. Disse typer biofilm føre lukt og kronisk infeksjonssykdommer5,6.

Kjemikalier eller antibiotika kjemiske forbindelser brukes vanligvis til å hemme veksten av bakterier som danner biofilm. Fremveksten av antibiotika resistente bakterier og bekymringer i vivo sikkerhet av kjemikalier kjører behovet for å utvikle nye materialer av biofilm og hemmer veksten av bakterier.

I denne studien er antimikrobielle nanomaterialer syntetisert uten antibiotikaresistens og toksisitet. Silver er et velkjent antimikrobielle stoff, og den siste utviklingen i nanovitenskap og nanoteknologi har ført til aktiv forskning på antimikrobielle virkningene av metall nanopartikler7,8. Nyere studier har rapportert at den lille størrelse og høy overflate-til-volum forholdet mellom nanopartikler resultere i økt antibakteriell aktivitet9,10,11.

Nanomaterialer presenteres her kombinere silver nanopartikler med økt antimikrobielle egenskaper og Karbonnanorør med høy størrelsesforhold, og dermed øke arealet per volum. Fabrikkert sølv hydrogenion-karbon nanorør kompositt utstillinger betydelige antimikrobielle egenskaper og minimal toksisitet for menneske-og dyreceller. Syntetisk prosessene i tidligere studier som bruker farlige reduksjonsmidler som NaBH4, formamide, vannistedenfor og hydrazine. Prosessen er innviklet, farlig og tidkrevende. Syntetisk prosessen rapporterte bruker her etanol som et betydelig mindre farlig reduksjonsmiddel.

Den hemming sonen og minimum bakteriedrepende konsentrasjon (MBC) for Ag-MWCNTs ble målt; Live/Dead og Trypan blå analyser ble brukt til å måle giftighet og antibakterielle egenskaper. Minimum inhibitoriske konsentrasjon (mikrofon) og mitokondrie giftighet (MTT) analyser ble ikke utført på grunn av uvanlig fargen på Karbonnanorør som ville ha forstyrret analyser. Til slutt, den laveste konsentrasjonen å hindre vekst av Methylobacterium spp. uten å påvirke pattedyrceller ble bestemt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. MWCNT oksidasjon

  1. Mål 30-50 mg MWCNT til en 50-mL flaske. Sakte legge 8 mL H24: HNO3 løsning (90% innledende konsentrasjon, 3:1 vol/vol) av pipette med 1 mL pipette-spisser.
    Advarsel: Dette preparatet må være gjennomført i kjemisk avtrekksvifte.
    1. Tillate 30 min for den eksoterm reaksjonen å fullføre.
  2. Sonicate løsningen ved 60-80 ° C og 160 M 1t før MWCNT slår seg på bunnen av ampullen.
    FORSIKTIG: Vannivået i sonicator bør være lavere enn toppen av ampullen slik at vann ikke vil bli introdusert i ampullen.
  3. Overføre løsningen slik sentrifuge.
    1. Brønnene, med legge 30 mL destillert vann dropwise til MWCNT-COOH løsningen.
      FORSIKTIG: En sterk eksoterm reaksjon oppstår under tillegg destillert vann. Legg destillert vann langsomt og gi tid for kjøling.
  4. Sentrifuge MWCNT-COOH løsningen på 12.000 x g og romtemperatur i 15 min.
    FORSIKTIG: Når en sentrifuge, sikre sentrifuge forblir balansert ved å plassere en tube med samme vekt overfor eksempel røret.
  5. Fjerne nedbryting med Pipetter og 1 mL pipette tips. Legge til 5 mL av etanol med Pipetter og 1 mL pipette tips. Skyll veggene av ampullen med ekstra pipetted etanol. Sentrifuge løsningen på 12.000 x g og romtemperatur i 15 min.
    1. Bestemme pH i nedbryting med pH papir. Gjenta vask og sentrifugering til supernatant pH nøytral.
  6. Fjern alle nedbryting. Legg 1 mL destillert vann å utløse og spre MWCNT-COOH jevnt i løsningen. Freeze-Dry løsning på 60 ° c. under vakuum til tørr.

2. sølv hydrogenion program på MWCNTs

  1. Plasser 10 mg av MWCNT-COOH i et 50-mL konisk rør og fortynn med 30 mL destillert vann. Sonicate løsning på 60 ° C og 160 M 1t.
  2. Sette 6 mL av 0,1 N AgNO3 i en 50-mL konisk rør og fortynn med 18 mL destillert vann. Sonicate løsning på 60 ° C og 160 M 1t.
    FORSIKTIG: Legge til AgNO3 i forhold til den totale massen MWCNTs slik at den totale massen Ag ikke overstiger 20%.
  3. Legge AgNO3 løsningen dropwise til MWCNTs løsningen med Pipetter og 1 mL pipette tips mens sonicating blandingen på 60 ° C og 160 W. Fortsett sonicating 1t etter AgNO3.
  4. Sentrifuge løsningen på 12.000 x g og romtemperatur i 15 min og fjerne nedbryting. Sentrifuge løsningen og fjerne nedbryting to ganger.
  5. Legge 1 mL destillert vann til Ag-MWCNTs blanding og spre bunnfall jevnt i løsningen. Legg til 5 mL av etanol og tillate reaksjonen fortsette ved romtemperatur 1t.
  6. Sentrifuge løsningen på 12.000 x g og romtemperatur i 15 min og fjerne nedbryting.
  7. Bestemme pH i nedbryting med pH papir. Gjenta vask og sentrifugering til supernatant pH nøytral.
  8. Legge 1 mL destillert vann til Ag-MWCNTs og spre jevnt i løsningen. Freeze-Dry løsningen på-70 ° C vakuum for 24 timer.

3. sone av hemming Test

  1. Bland 18.12 g R2A agar og 1 L destillert vann i en bolle. Sterilisere blandingen i en autoklav 121 ° c i 15 min.
  2. Tillate gel avkjøles til romtemperatur. Plass 10 mL av gel i Petri retter før herding å forberede solide medium.
  3. Sted 100 µL av bakterier på solid mediet. Spre bakterier på solid mediet bruker en sprederen.
    Advarsel: Denne fremgangsmåten må være gjennomført i kjemisk avtrekksvifte tent med en alkohol lampen.
  4. Inkuber retter på 30 ° C i 48 timer.
  5. Bland 3.12 g R2A buljong med 1 L destillert vann i en bolle. Sterilisere blandingen i en autoklav 121 ° c i 15 min.
  6. Overføre vokst koloniene til en flytende medium ved hjelp av en løkke og nål og ruge i en inkubator ved 180 rpm og 30 ° C.
  7. Registrere OD (optisk tetthet) av UV spectrophotometry på 600 nm på timebasis måle bakterievekst.
    Merk: R2A agar ble brukt i denne testen, i stedet for det standard Mueller-Hinton agar, fordi R2A er den foretrukne agar for vekst av Methylobacterium spp.
  8. Sted 10 mL forberedt R2A agar i en Petriskål å forberede en bunnen agar.
    1. Bland 3.12 g av R2A kjøttkraft og 8 g agar med 1 L destillert vann. Sterilisere blandingen i en autoklav ved 121 ° C i 15 min. sted 10 mL gel på bunnen agar.
  9. Laste 50 µL av Ag-MWCNTs løsning på sterilt papir plate med brønnene.
    1. Tørr og sterilisere Ag-MWCNTs utvalg i et vakuum kammer under UV-lys i 30 min.
  10. Sted Ag-MWCNTs eksempel på agar.
  11. Inkuber agar platen på 30 ° C i 48 timer.
  12. Mål sone hemming12.
    Merk: Instruksjonene for programvare brukt inngår i referansene.

4. antibakterielle Test

  1. Gjenta 3.1 til 3.7 å forberede bakteriell kultur.
  2. Ved maksimal OD, vaksinere 100 µL av bakterier i 3 mL frisk flytende medium med Pipetter og 100 µL mikro pipette tips.
  3. Forberede fem 50 µL prøver av kontroll løsningen i 15-mL konisk rør. Legge til følgende hver rør: 1) metanol; 2) 1000 µg/mL MWCNT-COOH; 3) 50 µg/mL Ag-MWCNTs; 4) 40 µg/mL Ag-MWMWCNTs; 5) 30 µg/mL Ag-MWCNTs.
  4. Ruge på 180 rpm og 30 ° C til kontrollen har maksimalt aktive som bestemmes av UV spectrophotometry som beskrevet ovenfor.
  5. Måle OD verdien av hvert utvalg og beregne MIC konsentrasjonen. OD verdien er direkte relatert til antall bakterieceller i prøven buljong.
  6. Spre kulturperler bakterier på et solid med en sprederen.
  7. Inkuber retten på 30 ° C i 48 timer.
  8. Telle bakteriell koloniene og CFU målverdier å bestemme antibakteriell aktivitet12.
    Merk: Instruksjonene for programvare brukt inngår i referansene.

5. levedyktighet analysen

  1. Fjerner kultur cellene fra inkubator, enkel sugeevnen mediet og vaskes tre ganger med en dropwise vask av 5 mL av PBS.
  2. Legge til 1 mL av trypsin-EDTA i PBS vasket celle- og sug etter 1 min.
    1. Trykk platen for å fjerne stakk celler.
  3. Legg til 5 mL av DMEM (Dulbeccos endret Eagle's Medium) og deretter fjerne celler. Sentrifuge prøvene 200 x g for 3 min og fjerne nedbryting.
    1. Legg 1 mL av DPBS og bland.
    2. Telle celler i 10 µL av løsningen med en automatisert celle-telling maskin.
      Merk: Instruksjonene for celle-telling maskin som brukes er inkludert i referanser13.
  4. Sted 1 × 105 av AML12 celler per brønn i en seks-vel plate inneholder DMEM løsning. Mediet inneholder 10% (v/v) fetal bovin serum og 1% sterilt antibiotika.
  5. Inkuber plate for 8-12 h på 37 ° C i en 5% CO2/95% air miljø.
  6. Enkel sugeevnen nedbryting fra brønner med en aspirator.
    1. Legge til hvert utvalg består av kontroll, NMS-DMSO (dimethyl sulfoxide) og 30-40 µg/mL Ag-MWCNT til 1 mL av DMEM.
    2. Ruge på 37 ° C i en 5% CO2/95% air miljø for 8 h.
  7. Fjern supernatant og vask prøver med 5 mL PBS.
  8. Legge til 1 mL av forberedt live/dead kit (20 µL av 2 mM EthD-1 med 5 µL av 4 mM calcein AM i DMSO i 10 mL PBS) dropwise i cellen.
  9. Ruge på room temperature i 30-45 minutter eller 37 ° C for 10 min. mål fluorescens med standard fluorescens mikroskopi på 100 X eller 300 X.

6. Trypan blå analysen

  1. Forberede prøver etter trinn 5.1 gjennom 5.6.2 ovenfor.
  2. Fjerne nedbryting.
  3. Vask plate med 1 mL 1 x DPBS og Dekanter.
  4. Legg 1 mL av trypsin plate og ruge for 3 min koble cellene fra kultur. Bruk celle kultur medium å vaske platen og samle celler. Plass avhentet celler i en 15-mL tube.
  5. Sentrifuge tube 200 x g og 4 ° C i 3 minutter.
  6. Kast nedbryting. Legge 1 mL av fersk medium til celle pellets og re spre cellene.
  7. Legg til 10 µL av trypan blå med 10 µL av spredte celler og telle celler med en automatisert celle-telling maskin.
    Merk: Instruksjonene for cellen telling maskin brukes inngår i referansene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Overføring elektronmikroskop (TEM) bildene bekrefter dannelsen av Ag-MWCNTs (figur 1A og 1B). Deres vellykkede syntese bekrefter endringen overflaten ansvaret. Størrelsen på Ag partikler avsatt på MWCNTs ble beregnet (figur 1 c). Gjennomsnittlig partikkelstørrelse var ca 3.83 nm. XRD mønster av de som syntetisert Ag-MWCNTs er vist i figur 1 d. Toppen på 20-30° tilsvarer MWCNT; de resterende toppene tilsvarer Ag. Antimikrobiell aktivitetsdata vises i figur 2. Bakterie kolonien bestander ble bekreftet av Methylobacterium kontroll (figur 2A); tillegg av metanol redusert befolkningen 103 ganger (figur 2B), og tillegg av MWCNT-COOH redusert befolkningen 108 ganger (figur 2C). Kolonier kan ikke identifiseres i 50 µg/mL Ag-MWCNT (figur 2D) og 40 µg/mL Ag-MWCNT (figur 2E) prøver. I 20 µg/mL Ag-MWCNT eksempel befolkningen redusert 105 ganger (figur 2F). I sonen i hemming test mot Methylobacterium (Figur 3), ble sonen i hemming identifisert når 10 µg/mL ble lagt. En sone av hemming var ikke observert i en konsentrasjon av 1 µg/mL. I cytotoksisitet testen bekreftet Live/Dead analysen (Figur 4) at cytotoksisitet i kontrollen negative (figur 4A) og tilstedeværelsen av cytotoksisitet i positiv kontroll (figur 4B) når metanol ble brukt. Tillegg av 40 µg/mL Ag-MWCNTs (figur 4C) avslørte noen cytotoksisitet, men tillegg av 30 µg/mL Ag-MWCNTs (Figure 4 D) ikke avsløre en betydelig mengde cytotoksisitet. En trypan blå analysen var utført (figur5) for kontrollen (figur 5A), metanol (figur 5B), 40 µg/mL Ag-MWCNTs (figur 5C) og 30 µg/mL Ag-MWCNTs (figur 5 d) prøver. Resultatene bekrefter at det var svært lite cytotoksisitet på 30 µg/mL Ag-MWCNTs.

Figure 1
Figur 1: mekanisk-karakterisering av Ag-MWCNTs. (A) og (B) TEM bilder av Ag-MWCNTs; (C) størrelsesDistribusjon av Ag-MWCNTs som vurdert via TEM (n = 100); (D) XRD mønster av Ag-MWCNTs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Antibakterielle evaluering av Ag-MWCNTs i forhold til Methylobacterium spp. (A) kontroll, (B) metanol, (C) MWCNT-COOH, (D) 50 μg/mL Ag-MWCNTs, (E) 40 μg/mL Ag-MWCNTs, og (F) 30 μg/mL AG-MWCNTs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Sone av hemming test av Ag-MWCNTs.

Figure 4
Figur 4: celle levedyktighet analyser for Ag-MWCNTs. Photomicrographs av AML12 som fluorescently merket for døde (rød) og live (grønn) celler. (A) kontroll, (B) metanol, (C) 40 μg/mL Ag-MWCNTs, og (D) 30 μg/mL AG-MWCNTs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Trypan blå søk for 30 og 40μg/mL Ag-MWCNTs. (A) kontroll, (B) metanol, (C) 40 μg/mL Ag-MWCNTs, og (D) 30 μg/mL AG-MWCNTs. (Red: døde celler, blå: live celler) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her rapporterer vi en enkel metode for utarbeidelse av MWCNTs med avsatt Ag nanopartikler. Dette sølv inneholder nanomaterial viser betydelig antibakteriell aktivitet og minimal potensial for ukontrollerte absorpsjon av silver nanopartikler i kroppen. Vi viser at 30 µg/mL syntetisert Ag-MWCNTs er en effektiv antibakteriell aktivitet mot Methylobacterium spp. med ubetydelig cytotoksisitet til leveren pattedyrceller. Om ytterligere forbedringer og biosikkerhet vurderinger for Ag-MWCNTs kreves før utvidelsen i den kommersielle sektoren, kan bruke etanol som et reduksjonsmiddel hjelpe produsere miljøvennlig og rimelig Ag-MWCNTs.

Følgende punkter er vist. Det er mulig å ødelegge ulike typer bakterier med utviklet nanomaterialer. Det er mulig å flere områder på en nanotube overflate som silver nanopartikler kan settes. Antibakterielle egenskaper kan også tilpasses ved å kontrollere størrelse og antall silver nanopartikler som settes på overflaten. Utviklet nanomaterialer er giftig for bakterielle celler, men er nontoxic på mennesker og dyr celler i riktig konsentrasjoner.

Følgende mekanismen er foreslått for den antibakterielle aktiviteten. De Ag-MWCNT nanostrukturer direkte kontakt bakteriell celleoverflaten skade cellen vegg og forårsake sekundære oksidasjon av reaktive oksygen arter; disse prosessene føre oksidativt stress. AG-MWCNT nanostrukturer er bekreftet for å løslate sølv ioner som hemmer quorum sensing av Methylobacterium spp., og dermed begrenser uttrykket av gener som regulerer dannelsen av biofilm.

Begrensningene for gjeldende protokollen omfatter ubestemt maksimumstiden silver nanopartikler og Ag-MWCNTs tillatt i menneskelige studier. I denne protokollen, er mengden silver nanopartikler inkludert i 30 µg/mL prøven av Ag-MWCNTs beregnet til 0,4 µg/mL, i gjennomsnitt. Denne konsentrasjonen regnes som biokompatible med pattedyrceller som rapportert i forrige studier6,7,8,9. Mekanismen for cytotoksisitet på konsentrasjonen av 40 µg/mL Ag-MWCNTs er ukjent, er det foreslått at det ikke-vedlegget av blodceller til bunnen av kultur plater kan øke sannsynligheten for Ag-MWCNT kontakt under kultur. I fremtiden, kan detaljert toksisitet studier av silver nanopartikler med en rekke celletyper under annen kultur forhold utføres. Disse studiene kan gi ytterligere informasjon på mekanismen av Ag-MWCNT interaksjon med celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av Chung-Ang University forskningsmidler (2016) og Nano-materiale Technology Development Program gjennom National Research Foundation av Korea(NRF) finansiert av departementet for vitenskap og IKT (nr. 2017M3A7B8061942).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 N silver nitrate SIGMA-ALDRICH 1090811000
Carbon nanotube, multi-walled Tokyo Chemical Industry Co., LTD 308068-56-6
R2A agar MBcell MB-R1129
R2A broth MBcell MB-R2230
Methylobacterium spp. KCTC 12618 from Korea Collection for Type Cultures Daejeon Korea 12618, Daejon, Korea
LIVE/DEAD Cell imaging Kit ThermoFisher SCIENTIFIC R37601
AML12 from Chungnam University, Dajeon, Korea
human PBMC ATCC PCS-800-011
TEM JEOL JEM-2100F
XRD Rigaku D/MAX 2500 Cu K photon source (40kV, 100mA)
JuLI Br NanoEnTek JULI-BRSC 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Löndahl, J. Physical and Biological Properties of Bioaerosols. Bioaerosol Detection Technologies. , Springer. 33-48 (2014).
  2. Jennings, S., Moran, A., Carroll, C. Bioaerosols and biofilms. Biofilms in medicine, industry and environmental biotechnology. , IWA, London. 160-178 (2003).
  3. Flemming, H. -C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 623-633 (2010).
  4. Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrobial agents and chemotherapy. 45 (4), 999-1007 (2001).
  5. Doronina, N. V., et al. Methylobacterium suomiense sp. nov. and Methylobacterium lusitanum sp. nov., aerobic, pink-pigmented, facultatively methylotrophic bacteria. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 52 (3), 773-776 (2002).
  6. Seo, Y., et al. Antibacterial activity and cytotoxicity of multiwalled carbon nanotubes decorated with silver nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 9, 4621-4629 (2014).
  7. Chen, X., Schluesener, H. Nanosilver: a nanoproduct in medical application. Toxicologyletters. 176 (1), 1-12 (2008).
  8. Singh, M., et al. Nanotechnology in medicine and antibacterial effect of silver nanoparticles. Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures. 3 (3), 115-122 (2008).
  9. Morones, J. R., et al. The bactericidal effect of silver nanoparticles. Nanotechnology. 16 (10), 2346 (2005).
  10. Martinez-Castanon, G., et al. Synthesis and antibacterial activity of silver nanoparticles with different sizes. Journal of Nanoparticle Research. 10 (8), 1343-1348 (2008).
  11. Lok, C. -N., et al. Silver nanoparticles: partial oxidation and antibacterial activities. JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry. 12 (4), 527-534 (2007).
  12. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide Home Page. , Available from: http://imageJ.nih.gov/ij/docs/guide (2010).
  13. NanoEnTek Inc. Juli Br User Guide. , Hwaseong, Korea. Available from: http://www.nanoentek.com/upload/product/11/JuLI%20Br_User%20manual%20(V.1.6).pdf (2012).

Tags

Bioteknologi problemet 135 biofilm multi vegger Karbonnanorør metall hydrogenion antibakterielle eiendom cytotoksisitet bakterier
Syntese av Multi vegger Karbonnanorør endret med Silver nanopartikler og evaluering av sine antibakterielle aktiviteter og cytotoksiske egenskaper
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seo, Y., Park, C., Son, J., Lee, K., More

Seo, Y., Park, C., Son, J., Lee, K., Hwang, J., Jo, Y., Lee, D., Khan, M. S., Chavan, S. G., Choi, Y., Kim, D., Gilad, A. A., Choi, J. Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties. J. Vis. Exp. (135), e57384, doi:10.3791/57384 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter