Summary
Neste estudo, nanomateriais antimicrobianos foram sintetizados por oxidação ácida de nanotubos de carbono multiwalled e subsequente deposição redutora de nanopartículas de prata. Antimicrobial atividade e citotoxicidade testes foram realizados com os nanomateriais como preparada.
Abstract
Neste estudo, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) foram tratados com uma solução aquosa de ácido sulfúrico para formar um grupo funcional à base de oxigénio. MWCNTs prata foram preparados pela deposição de prata de uma solução aquosa de AgNO3 sobre os MWCNTs oxidados redutora. Dada a cor original das CNTs, não foi possível aplicá-las para a concentração inibitória mínima ou ensaios de toxicidade mitocondrial para avaliar as toxicidade e antibacteriano Propriedades, desde que eles iria interferir com os ensaios. A zona de inibição e concentração bactericida mínima para as Ag-MWCNTs foram medidos e Live/mortos e azul Trypan ensaios foram usados para medir as toxicidade e antibacteriano Propriedades sem interferir com a cor da CNTs.
Introduction
O objetivo deste estudo é tornar ambientalmente amigáveis nanomateriais antibacterianos que podem inibir o crescimento de bactérias que forma de biofilmes. Desses nanomateriais antibacterianos têm o potencial para superar problemas de resistência a antibiótico e toxicidade de produtos químicos comumente usados ou compostos químicos antibióticos. Um biofilme é uma hidratada extracelular polimérica substância (EPS) que é composta por polissacarídeos, proteínas, ácidos nucleicos e lipídios1,2. Biofilmes impedem a invasão de substâncias estranhas e ajudarem as bactérias a crescer vigorosamente3,4. Biofilmes causam odor e doenças infecciosas crônicas5,6. Methylobacterium spp., por exemplo, cresce, aderindo aos lugares onde a água está sempre presente, ou onde é difícil garantir a erradicação bacteriana em uma base contínua, tais como trocadores de calor ar-condicionado, quartos de banho e dispositivos médicos. Estes tipos de biofilmes causam odor e doenças infecciosas crônicas5,6.
Normalmente, produtos químicos ou antibióticos compostos químicos são utilizados para inibir o crescimento de bactérias que podem formar biofilmes. O surgimento de bactérias resistentes aos antibióticos e preocupações sobre a segurança na vivo de produtos químicos estão conduzindo a necessidade de desenvolver novos materiais para evitar a formação de biofilmes e para inibir o crescimento de bactérias.
Neste estudo, antimicrobianos nanomateriais são sintetizados que são livre de toxicidade e resistência aos antibióticos. A prata é uma substância antimicrobiana conhecida, e desenvolvimentos recentes em Nanociência e nanotecnologia conduziram a investigação sobre os efeitos antimicrobianos de nanopartículas de metal7,8. Estudos recentes têm relatado que o pequeno tamanho e alta proporção de superfície e o volume das nanopartículas resultam em aumento da atividade antibacteriana de10,9,11.
Os nanomateriais apresentados combinam nanopartículas de prata com propriedades antimicrobianas aumentada e nanotubos de carbono com uma proporção elevada, aumentando assim a área de superfície por unidade de volume. O composto de nanotubo de nanopartículas de prata fabricados-carbono apresenta propriedades antimicrobianas substanciais e mínima toxicidade às células humanas e animais. Os processos sintéticos em estudos anteriores usam perigosos agentes redutores tais como4NaBH, formamida, dimetilformamida e hidrazina. O processo é demorado, complicado e perigoso. O processo sintético relatado aqui usa etanol como agente redutor significativamente menos perigoso.
A zona de inibição e concentração bactericida mínima (MBC) para os Ag-MWCNTs foram medidos; Ao vivo/morto e azul Trypan ensaios foram usados para medir a toxicidade e propriedades antibacterianas. Concentração inibitória mínima (CIM) e ensaios de toxicidade mitocondrial (MTT) não foram realizados devido a cor incomum os de nanotubos de carbono que poderia ter interferido com os ensaios. Finalmente, determinou-se a concentração mínima para impedir o crescimento de Methylobacterium spp. sem afetar células de mamíferos.
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Protocol
1. MWCNT oxidação
- Medir 30-50 mg de MWCNT dentro de um frasco de 50 mL. Lentamente, adicionar 8 mL de um H2então4: solução de3 HNO (90% da concentração inicial, 3:1 vol/vol) com uma pipeta com pontas de pipetas de 1 mL.
Atenção: Esta preparação deve ser conduzida em uma coifa de química.- Permita a 30 min. para a reação exotérmica completar.
- Proceda à sonicação a solução a 60-80 ° C e 160 W para 1 h até MWCNT instala-se na parte inferior do frasco.
Atenção: O nível da água no sonicador deve ser menor do que a parte superior do frasco para que a água não será introduzida dentro do frasco. - Transferi a solução para um tubo de centrifugação.
- Com uma micropipeta, adicione 30 mL de água destilada gota a gota à solução MWCNT-COOH.
Atenção: Uma forte reação exotérmica ocorre durante a adição de água destilada. Adicionar a água destilada lentamente e permitir tempo para refrigerar.
- Com uma micropipeta, adicione 30 mL de água destilada gota a gota à solução MWCNT-COOH.
- Centrifugue a solução MWCNT-COOH a 12.000 x g e a temperatura ambiente por 15 min.
Cuidado: Ao operar uma centrífuga, certifique-se de que centrífuga permanece equilibrada pela colocação de um tubo com o mesmo peso em frente do tubo de amostra. - Remova o sobrenadante com uma pipeta e a ponta da pipeta de 1 mL. Adicione 5 mL de etanol com uma pipeta e a ponta da pipeta de 1 mL. Lave as paredes do frasco com etanol pipetado adicional. Centrifugue a solução a 12.000 x g e a temperatura ambiente por 15 min.
- Determine o pH de sobrenadante com papel de pH. Repeti a lavagem e a centrifugação até que o sobrenadante pH neutro.
- Remova todos os sobrenadante. Adicione 1 mL de água destilada para precipitar e dispersar MWCNT-COOH uniformemente em solução. Congela a-60 ° C sob vácuo até secar.
2. deposição de nanopartículas prata na MWCNTs
- Coloque 10 mg de MWCNT-COOH em um tubo cónico de 50 mL e diluir com 30 mL de água destilada. Proceda à sonicação solução a 60 ° C e 160 W por 1h.
- Coloque 6 mL de 0.1 N AgNO3 em um tubo cónico de 50 mL e diluir com 18 mL de água destilada. Proceda à sonicação solução a 60 ° C e 160 W por 1h.
Atenção: Adicione AgNO3 proporcionalmente à massa total da MWCNTs tais que a massa total do Ag não exceda 20%. - Adicione a solução de3 AgNO gota a gota à solução com uma pipeta e a ponta da pipeta de 1 mL MWCNTs enquanto sonicating a mistura a 60 ° C e 160 w. Continue sonicating por 1h depois da adição do AgNO3.
- Centrifugue a solução a 12.000 x g e a temperatura ambiente por 15 min e retirar o sobrenadante. Centrifugue a solução e remover o sobrenadante mais duas vezes.
- Adicionar 1 mL de água destilada para a mistura de Ag-MWCNTs e dispersar o precipitado uniformemente na solução. Adicionar 5 mL de etanol e permitir a reação proceder à temperatura ambiente durante 1 h.
- Centrifugue a solução a 12.000 x g e a temperatura ambiente por 15 min e retirar o sobrenadante.
- Determine o pH de sobrenadante com papel de pH. Repeti a lavagem e a centrifugação até pH sobrenadante é neutro.
- Adicionar 1 mL de água destilada para Ag-MWCNTs e dispersar uniformemente em solução. Congela a solução a-70 ° C sob vácuo por 24 h.
3. zona de inibição teste
- Misture 18,12 g de ágar-ágar R2A e 1 L de água destilada num balão. Esterilize a mistura em uma autoclave a 121 ° C por 15 min.
- Permitir que o gel de arrefecer à temperatura ambiente. Coloque 10 mL de gel em placas de Petri antes da têmpera para preparar o meio sólido.
- Lugar de 100 µ l de bactérias em meio sólido. Espalhe as bactérias no meio sólido usando um difusor.
Atenção: Este procedimento deve ser conduzido em uma coifa química iluminada com uma lâmpada de álcool. - Incube os pratos a 30 ° C, durante 48 h.
- Misture 3,12 g de R2A caldo com 1 L de água destilada num balão. Esterilize a mistura em uma autoclave a 121 ° C por 15 min.
- Transferir as colônias crescidas para um meio líquido, usando um loop e agulha e incubá-los numa incubadora a 180 rpm e 30 ° C.
- Registre o valor de OD (densidade óptica) por espectrofotometria UV em 600 nm numa base horária para medir o crescimento bacteriano.
Nota: Ágar R2A foi usado neste teste, em vez do padrão Ágar Mueller-Hinton, porque R2A é o ágar preferencial para crescimento de Methylobacterium spp. - Lugar 10 mL do preparado ágar R2A em uma placa de Petri para preparar um ágar de fundo.
- Misture 3,12 g de caldo R2A e 8 g de ágar com 1 L de água destilada. Esterilize a mistura em uma autoclave a 121 ° C por 15 min. lugar de 10 mL deste gel no agar inferior.
- Carrega 50 µ l de solução de Ag-MWCNTs no disco de papel estéril com uma micropipeta.
- Secar e esterilizar amostra Ag-MWCNTs em uma câmara de vácuo sob UV luz por 30 min.
- Amostra de lugar Ag-MWCNTs no ágar.
- Incube a placa de ágar a 30 ° C, durante 48 h.
- Zona de medida de inibição de12.
Nota: As instruções para o software usado estão incluídas nas referências.
4. teste antibacteriano
- Repita as etapas de 3.1 a 3.7 para preparar a cultura bacteriana.
- No máximo OD, inocule 100 µ l de bactérias em 3 mL de meio líquido fresco com uma ponta de micro pipeta pipeta e 100 µ l.
- Preparar cinco 50 amostras µ l da solução de controle em tubos cônicos de 15 mL. Adicione o seguinte para cada tubo: 1) metanol; 2) 1000 µ g/mL MWCNT-COOH; 3) 50 µ g/mL Ag-MWCNTs; 4) 40 µ g/mL Ag-MWMWCNTs; 5) 30 µ g/mL Ag-MWCNTs.
- Incube a 180 rpm e 30 ° C até que o controle é maximamente ativo conforme determinado por espectrofotometria UV conforme descrito acima.
- Medir o valor de OD de cada amostra e calcular a concentração de MIC. O valor de OD está diretamente relacionado ao número de células bacterianas em caldo de amostra.
- Espalhe as bactérias cultivadas em meio sólido com um espalhador.
- Incube o prato a 30 ° C, durante 48 h.
- Contagem de colônias bacterianas e os valores da CFU de medida para determinar a atividade antibacteriana12.
Nota: As instruções para o software usado estão incluídas nas referências.
5. ensaio da viabilidade
- Depois de remover as células de cultura da incubadora, o médio de sucção e lavar três vezes com uma lavagem gota a gota de 5 mL de PBS.
- Adicione 1 mL de tripsina-EDTA em PBS para a célula lavada e sucção após 1 min.
- Bata a placa para remover células presas.
- Adicionar 5 mL de DMEM (médio modificado águia de Dulbecco) e em seguida, retire as pilhas. Centrifugar as amostras a 200 x g por 3 min e retirar o sobrenadante.
- Adicione 1 mL de DPBS e misture.
- Contar as células de 10 µ l da solução com uma máquina automatizada de contagem de células.
Nota: Instruções para a máquina de contagem de células utilizadas constam as referências13.
- Coloque 1 × 105 de AML12 células por poço em uma placa de seis contendo solução DMEM. O meio contém antibiótico estéril de 1% e 10% (v/v) de soro fetal bovino.
- Incube a placa para 8-12 h a 37 ° C, em um ambiente de ar 95% 5% CO2.
- Aspire o sobrenadante de poços com um aspirador.
- Adicione a cada amostra composta de controle, NMS-DMSO (Dimetilsulfóxido) e 30-40 µ g/mL Ag-MWCNT a 1 mL de DMEM.
- Incube a 37 ° C, em um ambiente de ar 95% 5% CO2para 8 h.
- Remova o sobrenadante e lavar as amostras com 5 mL de PBS.
- Adicione 1 mL do preparado ao vivo/morto kit (20 µ l de 2 mM, EthD-1 com 5 µ l de 4mm calceína AM em DMSO em 10 mL de PBS) gota a gota para a célula.
- Incube a room temperature por 30-45 min ou a 37 ° C por 10 min. fluorescência medida com microscopia de fluorescência padrão 100 X ou 300 X.
6. ensaio de azul de Trypan
- Prepare as amostras de acordo com passos 5.1 através de 5.6.2 acima.
- Remova o sobrenadante.
- Lave a placa com 1 mL de 1 x DPBS e decantar.
- Adicione 1 mL de tripsina a placa e incubar durante 3 min separar as células de cultura. Use o meio de cultura celular para lavar prato e recolher as células. Coloque as células coletadas em um tubo de 15 mL.
- Centrifugar o tubo a 200 x g e 4 ° C por 3 min.
- Descarte o sobrenadante. Adicione 1 mL de meio fresco de centrifugado e re-dispersar as células.
- Adicionar 10 µ l de trypan azul com 10 µ l de células dispersas e contar as células com uma máquina automatizada de contagem de células.
Nota: Instruções para a máquina de contagem de células utilizadas estão incluídas nas referências.
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Representative Results
Imagens de microscopia eletrônica (TEM) transmissão confirmam a formação de Ag-MWCNTs (figura 1A e 1B). Sua síntese bem sucedida foi confirmado pela mudança na carga de superfície. Calculou-se o tamanho das partículas depositadas sobre os MWCNTs Ag (Figura 1). O tamanho médio da partícula foi aproximadamente 3.83 nm. O padrão XRD dos MWCNTs-Ag-sintetizados como é mostrado na Figura 1. O pico em 20-30° corresponde a MWCNT; os picos restantes correspondem a Ag. Dados de atividade antimicrobiana são mostrados na Figura 2. Populações de colônia bacteriana foram confirmadas por Methylobacterium controle (Figura 2A); adição de metanol reduziu a população de 103 vezes (Figura 2B), e adição de MWCNT-COOH reduziu a população 108 vezes (Figura 2). Colônias não podem ser identificadas na 50 µ g/mL Ag-MWCNT (Figura 2D) e 40 µ g/mL (Figura 2E) Ag-MWCNT as amostras. Da amostra de 20 µ g/mL Ag-MWCNT a população foi reduzida a 105 vezes (Figura 2F). Na zona de teste de inibição contra Methylobacterium (Figura 3), a zona de inibição foi identificada quando 10 µ g/mL foi adicionado. Uma zona de inibição não foi observada na concentração de 1 µ g/mL. No teste de citotoxicidade, o ensaio ao vivo/morto (Figura 4) confirmou a ausência de citotoxicidade no controle negativo (Figura 4A) e a presença de citotoxicidade no controle positivo (Figura 4B) quando o metanol foi utilizado. A adição de 40 µ g/mL Ag-MWCNTs (Figura 4) revelou alguns citotoxicidade, no entanto, a adição de 30 µ g/mL (FIkuren 4D) Ag-MWCNTs não revelou uma quantidade significativa de citotoxicidade. Um ensaio de trypan azul foi realizada (Figura5) para o controle (Figura 5A), metanol (Figura 5B), Ag-MWCNTs (Figura 5) de 40 µ g/mL e 30 amostras de Ag-MWCNTs (Figura 5) µ g/mL. Os resultados confirmaram que havia muito pouco de citotoxicidade em 30 µ g/mL MWCNTs-Ag.
Figura 1: caracterização físico-química de Ag-MWCNTs. (A) e (B) imagens de temperatura da Ag-MWCNTs; (C) distribuição de tamanho de Ag-MWCNTs, avaliadas através de temperatura (n = 100); (D) padrão XRD da Ag-MWCNTs. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Avaliação antibacteriana de Ag-MWCNTs relativo Methylobacterium spp. (A) controle, (B) metanol, (C) MWCNT-COOH, (D) 50 μg/mL de Ag-MWCNTs, (E) 40 μg/mL de Ag-MWCNTs e (F) 30 μg/mL de Ag-MWCNTs. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Zona de teste de inibição da Ag-MWCNTs.
Figura 4: ensaios de viabilidade de células para Ag-MWCNTs. fotomicrografias de AML12 que são rotulados fluorescente para morrer (vermelho) e viver (verdes) células. (A) controle, (B) metanol, (C) 40 μg/mL de Ag-MWCNTs e (D) 30 μg/mL de Ag-MWCNTs. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: azul Trypan ensaios para 30 e 40μg/mL Ag-MWCNTs. (A) controle, (B) metanol, (C) 40 μg/mL de Ag-MWCNTs, e (D) 30 μg/mL de Ag-MWCNTs. (Red: células mortas; azul: células vivas) clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, nós relatamos um método simples para a preparação de MWCNTs com nanopartículas de Ag depositadas. Esse nanomaterial contendo prata demonstra substancial atividade antibacteriana e mínimo potencial de absorção descontrolada de nanopartículas de prata no corpo. Demonstramos que 30 µ g/mL de Ag-MWCNTs sintetizados é um nível eficaz de atividade antibacteriana contra Methylobacterium spp. com insignificante citotoxidade de células de fígado de mamíferos. Embora as melhorias adicionais e avaliações de biossegurança para Ag-MWCNTs são necessários antes de expansão no setor comercial, usando etanol como agente redutor poderia ajudar a produzir Ag-MWCNTs ambientalmente amigável e baratos.
Os seguintes pontos são demonstrados. É possível destruir vários tipos de bactérias com as nanomateriais desenvolvidos. É possível criar vários sites em uma superfície de nanotubos em que nanopartículas de prata podem ser depositadas. Propriedades antibacterianas também podem ser adaptadas ao controlar o tamanho e o número de nanopartículas de prata que são depositados na superfície. Os nanomateriais desenvolvidos são tóxicos para as células bacterianas mas não tóxico para as células humanas e animais, em concentrações adequadas.
O seguinte mecanismo é proposto para a atividade antibacteriana. As Ag-MWCNT nanoestruturas diretamente entre em contato com a superfície da célula bacteriana, danificar a parede celular e causam oxidação secundária de espécies reativas de oxigênio; Estes processos resultam em estresse oxidativo. AG-MWCNT nanoestruturas foram confirmadas para liberar íons de prata que inibem o quórum de sensoriamento de Methylobacterium spp., assim, inibindo a expressão dos genes que regulam a formação de biofilmes.
As limitações do atual protocolo incluiria a quantidade máxima indeterminada de nanopartículas de prata e Ag-MWCNTs admissíveis em ensaios em humanos. Neste protocolo, a quantidade de nanopartículas de prata foram incluídas na amostra 30 µ g/mL de Ag-MWCNTs foi estimada como 0,4 µ g/mL, em média. Esta concentração é considerada como biocompatível com as células de mamíferos, como relatado em estudos anteriores6,7,8,9. Enquanto o mecanismo de citotoxicidade na concentração de 40 µ g/mL de Ag-MWCNTs é indeterminado, propõe-se que o não-apego de glóbulos para o fundo das placas de cultura pode aumentar a probabilidade de contato Ag-MWCNT durante a cultura. No futuro, estudos detalhados de toxicidade de nanopartículas de prata com uma variedade de tipos de células sob condições de cultura diferentes podem ser executados. Estes estudos podem fornecer informações adicionais sobre o mecanismo de interação Ag-MWCNT com células.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi suportado por bolsas de investigação de Universidade Chung-Ang (2016) e pelo programa de desenvolvimento de tecnologia de Nano-materiais através do nacional Research Foundation de Korea(NRF) financiado pelo Ministério da ciência e TIC (n º 2017M3A7B8061942).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 N silver nitrate | SIGMA-ALDRICH | 1090811000 | |
| Carbon nanotube, multi-walled | Tokyo Chemical Industry Co., LTD | 308068-56-6 | |
| R2A agar | MBcell | MB-R1129 | |
| R2A broth | MBcell | MB-R2230 | |
| Methylobacterium spp. | KCTC | 12618 | from Korea Collection for Type Cultures Daejeon Korea 12618, Daejon, Korea |
| LIVE/DEAD Cell imaging Kit | ThermoFisher SCIENTIFIC | R37601 | |
| AML12 | from Chungnam University, Dajeon, Korea | ||
| human PBMC | ATCC | PCS-800-011 | |
| TEM | JEOL | JEM-2100F | |
| XRD | Rigaku | D/MAX 2500 | Cu K photon source (40kV, 100mA) |
| JuLI Br | NanoEnTek | JULI-BRSC |
References
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