Summary
本研究通过多壁纳米碳纳米管的酸性氧化和银纳米粒子随后的还原沉积合成了抗菌纳米材料。用制备的纳米材料进行抗菌活性和细胞毒性试验。
Abstract
本研究采用水硫酸溶液处理多壁碳纳米管 (MWCNTs), 形成氧基功能基团。银 MWCNTs 是由还原沉积银从 AgNO3的水溶液中氧化 MWCNTs。鉴于碳纳米管的独特颜色, 不可能将其应用于最小抑制浓度或线粒体毒性检测, 以评估毒性和抗菌性能, 因为它们会干扰化验。测定了银 MWCNTs 的抑菌区和最低杀菌浓度, 并利用台盼蓝法测定了其毒性和抗菌性能, 不影响碳纳米管的颜色。
Introduction
这项研究的最终目的是制造环境友好的抗菌纳米材料, 从而抑制形成生物膜的细菌的生长。这些抗菌纳米材料有可能克服常用化学药品或抗生素化合物的毒性和耐药性问题。生物膜是由多糖、蛋白质、核酸和血脂组成的水合胞外高分子物质 (EPS),1,2。生物膜防止外来物质的侵入, 帮助细菌大力生长3,4。生物膜引起气味和慢性传染性疾病5,6。例如, Methylobacterium通过附着在水始终存在的地方或难以确保连续进行细菌根除 (如空调热交换器、淋浴室和医疗设备) 而生长。这些类型的生物膜引起气味和慢性传染性疾病5,6。
通常, 化学物质或抗生素化合物用于抑制形成生物膜的细菌的生长。抗生素耐药性细菌的出现和对化学品的体内安全性的担忧促使人们需要开发新材料, 以防止生物膜的形成和抑制细菌的生长。
在本研究中, 合成了抗菌纳米材料, 无抗生素耐药性和毒性。银是一种众所周知的抗菌物质, 最近的纳米和纳米技术的发展导致了对金属纳米粒子的抗菌作用的积极研究7,8。最近的研究报告说, 纳米粒子的体积小, 体积比大, 导致抗菌活性增加9,10,11。
本文介绍的纳米材料将银纳米粒子与增强的抗菌性能和碳纳米管结合在一起, 从而增加了单位体积的表面积。制备的银纳米粒子-碳纳米管复合材料具有很大的抗菌性能和对人体和动物细胞的最小毒性。以前研究中的合成过程使用了诸如 NaBH4、甲酰胺、甲基酰胺和肼等有害还原剂。这个过程很复杂, 很危险, 而且耗时。这里报告的合成过程使用乙醇作为一种显著减少危险的还原剂。
测定了银 MWCNTs 的抑菌区和最低杀菌浓度;用活/死和台盼蓝法测定毒性和抗菌性能。最低抑制浓度 (MIC) 和线粒体毒性 (MTT) 检测没有执行, 因为不寻常的颜色的碳纳米管, 这将干扰的化验。最后, 确定了在不影响哺乳动物细胞的情况下, 防止Methylobacterium生长的最小浓度。
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Protocol
1. MWCNT 氧化
- 测量 30-50 毫克的 MWCNT 成一个50毫升的瓶子。缓慢地添加8毫升的 H2, 所以4: HNO3解决方案 (90% 初始浓度, 3:1 卷/卷) 的吸管与1毫升吸管提示。
注意: 此制剂必须在化学油烟机中进行。- 允许30分钟的放热反应完成。
- 油脂实验溶液在 60-80 °c 和 160 W 为1小时, 直到 MWCNT 安定在瓶的底部。
注意: sonicator 的水位应该低于瓶子的顶端, 这样水就不会被引入瓶子里。 - 把溶液转移到离心管上。
- 用微, 加入30毫升蒸馏水滴到 MWCNT-COOH 溶液中。
注意: 在加蒸馏水的过程中会发生强烈的放热反应。慢慢加入蒸馏水, 让时间冷却。
- 用微, 加入30毫升蒸馏水滴到 MWCNT-COOH 溶液中。
- 离心机的 MWCNT-COOH 溶液在 1.2万 x g 和室温15分钟。
注意: 在操作离心机时, 要确保离心机保持平衡, 在取样管对面放置一个与重量相同的管。 - 用吸管和1毫升吸管端取出上清液。添加5毫升乙醇与吸管和1毫升吸管提示。用额外的 pipetted 乙醇冲洗瓶子的壁。离心溶液在 1.2万 x g 和室温15分钟。
- 用 ph 纸测定上清液的 ph 值。重复洗涤和离心, 直到上清液 pH 值为中性。
- 移除所有上清。加入1毫升蒸馏水, 在溶液中均匀沉淀和分散 MWCNT-COOH。冷冻干燥溶液在-60 摄氏度真空下直到干燥。
2. 纳米银在 MWCNTs 上的沉积
- 将10毫克的 MWCNT-COOH 在50毫升圆锥管中, 稀释30毫升蒸馏水。油脂实验溶液在60°c 和 160 W 为 1 h。
- 在50毫升圆锥管中放置6毫升的 0.1 N AgNO3 , 然后用18毫升蒸馏水稀释。油脂实验溶液在60°c 和 160 W 为 1 h。
警告: 添加 AgNO3与 MWCNTs 总质量的比例, 使 Ag 的总质量不超过20%。 - 在添加 AgNO1后, 将 AgNO3解决方案添加到带吸管和1毫升吸管尖端的 MWCNTs 溶液中, sonicating 60 摄氏度和 160 w 的混合物继续 sonicating 3 h。
- 离心溶液在 1.2万 x g 和室温15分钟, 并清除上清。离心溶液, 并去除上清液两次。
- 将1毫升蒸馏水添加到银 MWCNTs 混合物中, 在溶液中均匀地分散沉淀。添加5毫升乙醇, 并允许反应在室温下进行1小时。
- 离心溶液在 1.2万 x g 和室温15分钟, 并清除上清。
- 用 ph 纸测定上清液的 ph 值。重复洗涤和离心, 直到清液 pH 值为中性。
- 将1毫升蒸馏水加入银 MWCNTs, 均匀分散在溶液中。冷冻干燥溶液在-70 摄氏度真空下24小时。
3. 抑制试验区
- 将18.12 克的 R2A 琼脂和1升的蒸馏水混合在烧瓶中。在121摄氏度的蒸压釜中消毒混合物15分钟。
- 允许凝胶在室温下冷却。在硬化前, 在培养皿中放置10毫升凝胶以制备固体培养基。
- 在固体培养基上放置100µL 细菌。使用吊具将细菌传播到固体介质中。
注意: 此程序必须在用酒精灯点燃的化学油烟罩中进行。 - 在30摄氏度的盘子里孵化48小时。
- 将3.12 克的 R2A 汤与1升的蒸馏水混合在一个烧瓶中。在121摄氏度的蒸压釜中消毒混合物15分钟。
- 使用循环和针将生长的菌落转移到液体培养基中, 在 180 rpm 和30摄氏度的孵化器中孵化。
- 以每小时 600 nm 的紫外分光光度法记录 OD (光学密度) 值以测量细菌生长。
注: R2A 琼脂是用于本试验, 而不是标准的米勒-韩丁琼脂, 因为 R2A 是首选琼脂生长的Methylobacterium. - 在培养皿中放置10毫升准备好的 R2A 琼脂, 准备下琼脂。
- 将3.12 克 R2A 汤和8克琼脂和1升蒸馏水混合在一起。在121摄氏度的高压釜中消毒混合物15分钟. 在底部琼脂上放置10毫升的凝胶。
- 用微在无菌纸盘上加载50µL 银 MWCNTs 溶液。
- 在紫外光照射下, 在真空室中干燥和消毒银 MWCNTs 样品30分钟。
- 在琼脂上放置银 MWCNTs 样品。
- 在30摄氏度孵育琼脂盘48小时。
- 抑制12的度量区域。
注意: 引用中包含用于软件的说明。
4. 抗菌试验
- 重复步骤3.1 至 3.7, 准备细菌培养。
- 在最大 OD, 接种100µL 细菌成3毫升新鲜液体培养基与吸管和100µL 微吸管提示。
- 在15毫升圆锥管中准备五50µL 的控制溶液样品。将以下各管加入: 1) 甲醇;2) 1000 µg/毫升 MWCNT COOH;3) 50 µg/毫升银 MWCNTs;4) 40 µg/毫升银 MWMWCNTs;5) 30 µg/毫升银 MWCNTs。
- 孵育在180转每分钟和30°c, 直到控制是最大地活跃的由紫外分光光度的决定如上文所述。
- 测量每个样品的 OD 值并计算麦克风浓度。OD 值与样品汤中的细菌细胞数量直接相关。
- 将培养出来的细菌传播到固体培养基上。
- 在30摄氏度孵化出48小时的菜肴。
- 计数细菌菌落数和测量 CFU 值以确定抗菌活性12。
注意: 引用中包含用于软件的说明。
5. 生存能力测定
- 从孵化器中取出培养细胞后, 吸入培养基, 用5毫升 PBS 的滴状洗涤清洗三次。
- 在 PBS 中加入1毫升的胰蛋白酶-EDTA, 对洗涤后的细胞进行1分钟的吸入。
- 点击盘子移除卡住的细胞。
- 添加5毫升的 DMEM (Dulbecco 的改良鹰的培养基), 然后取出细胞。将样品离心 200 x 克3分钟, 取出上清液。
- 加入1毫升的 DPBS 和混合。
- 用自动计数机对解决方案的10µL 中的单元格进行计数。
注意: 使用的单元计数机的说明包含在引用13中。
- 在含有 DMEM 溶液的六井板中, 每井放置 1 x 105的 AML12 细胞。培养基中含有 10% (v/v) 胎牛血清和1% 无菌抗生素。
- 在 5% CO2/95% 空气环境中, 在37摄氏度孵育 8-12 小时的孵化板。
- 用吸尘口从水井中吸取上清。
- 添加每个样本包括控制, NMS-二甲基亚砜) 和30-40 µg/毫升银 MWCNT 到1毫升的 DMEM。
- 37°c 在 5% CO2/95% 空气环境中孵化 8 h。
- 清除上清液, 用5毫升的 PBS 冲洗样品。
- 添加1毫升准备活/死套件 (20 µL 2 毫米 EthD-1 与5µL 4 毫米 calcein 是在亚砜在10毫升 PBS) 滴向细胞。
- 在室温下孵育 30-45 分钟或37摄氏度, 用标准荧光显微镜在100X 或300X 测量荧光。
6. 台盼蓝检测
- 根据步骤5.1 通过以上5.6.2 准备样品。
- 移除上清。
- 1毫升 1x DPBS 和醒酒的洗涤板。
- 添加1毫升的胰蛋白酶到板块和孵化3分钟, 以分离细胞从文化。用细胞培养基冲洗板材, 收集细胞。将收集到的细胞放置在15毫升的试管中。
- 离心管在 200 x g 和4°c 为3分钟。
- 放弃上清。将1毫升新鲜培养基添加到细胞颗粒中, 重新分散细胞。
- 添加10µL 的台盼蓝与10µL 分散细胞和计数的细胞与自动计数机。
注: 所使用的细胞计数机的说明包括在参考资料中。
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Representative Results
透射电镜 (TEM) 图像确认银 MWCNTs 的形成 (图 1A 和 1B)。表面电荷的变化证实了它们的成功合成。计算了 MWCNTs 上沉积的 Ag 粒子的大小 (图 1C)。平均微粒大小是大约3.83 毫微米。该合成银 MWCNTs 的 XRD 模式显示在图 1D中。峰值在 20-30°对应于 MWCNT;其余的峰值对应于 Ag。抗菌活动数据显示在图 2中。细菌菌落数量由Methylobacterium控件确认 (图 2A);增加甲醇减少了人口 103次 (图 2B), 并且加法 MWCNT-COOH 减少了人口 108时间 (图 2C)。在50µg/ml ag MWCNT (图 2D) 和40µg/ml ag MWCNT (图 2E) 样品中无法识别菌落。在20µg/mL Ag MWCNT 样品中, 人口减少了 105次 (图 2F)。在针对Methylobacterium (图 3) 的抑制测试区域中, 在添加了10µg/mL 时确定了抑制区域。在1µg/毫升浓度下未观察到抑制区。在细胞毒性试验中, 活体/死法 (图 4) 确认阴性控制 (图 4A) 中没有细胞毒性, 在使用甲醇时阳性控制 (图 4B) 中存在细胞毒性。增加了40µg/毫升 ag MWCNTs (图 4C) 揭示了一些细胞毒性, 然而增加30µg/毫升 ag MWCNTs (Figure 4D) 没有显示大量的细胞毒性。对该控件执行了一个台盼蓝检测 (图5) (图 5A), 甲醇 (图 5B), 40 µg/毫升 ag MWCNTs (图 5C) 和30µg/毫升 ag MWCNTs (图 5D) 样品。结果证实, 在30µg/毫升银 MWCNTs 中, 细胞毒性很少。
图 1: 银 MWCNTs 的物理化学特性.(A) 和 (B)银 MWCNTs 的透射电镜图像;(C)通过 TEM 评估的银 MWCNTs 的大小分布 (n = 100);MWCNTs 的(D) XRD 模式请单击此处查看此图的更大版本.
图 2: 银 MWCNTs 相对于Methylobacterium的抗菌性评价。(A)控件, (B)甲醇, (C) MWCNT-COOH, (D) 50 微克/毫升的银 MWCNTs, (E) 40 微克/毫升的银 MWCNTs, 和(F) 30 微克/毫升的银 MWCNTs.请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 银 MWCNTs 的抑制试验区。
图 4: MWCNTs 显微照片的细胞生存性测定 AML12 荧光标记为死 (红) 和活 (绿) 细胞。(A)控件, (B)甲醇, (C) 40 微克/毫升 MWCNTs, 和(D) 30 微克/毫升的银 MWCNTs.请单击此处查看此图的较大版本.
图 5:30 和 40μg/毫升银 MWCNTs 的台盼蓝化验.(A)控件, (B)甲醇, (C) 40 微克/毫升的银 MWCNTs, 和(D) 30 微克/毫升的银 MWCNTs. (红色: 死细胞; 蓝色: 活细胞)请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在这里, 我们报告了一个简单的方法来制备 MWCNTs 与沉积银纳米粒子。这种含银的纳米材料显示了大量的抗菌活性和极少的潜力, 不受控制地吸收银纳米粒子在体内。我们证明, 30 µg/毫升的合成银-MWCNTs 是一个有效的水平的抗菌活性的Methylobacterium. , 对哺乳动物肝细胞的毒性微乎其微。虽然在商业部门扩大之前需要对银 MWCNTs 进行额外的改进和生物安全评估, 但使用乙醇作为减少剂可以帮助生产环保和廉价的银 MWCNTs。
下面是演示的要点。用所开发的纳米材料可以破坏各种类型的细菌。有可能在纳米管表面上设计多个位置, 在这些地方可以沉积银纳米粒子。抗菌性能也可以通过控制在表面沉积的银纳米粒子的大小和数量来量身定做。所开发的纳米材料对细菌细胞是有毒的, 但在适当浓度下对人体和动物细胞无毒。
为抗菌活性提出了以下机制。银 MWCNT 纳米结构直接接触细菌细胞表面, 破坏细胞壁, 导致活性氧的二次氧化;这些过程导致氧化应激。银-MWCNT 纳米结构已被证实释放银离子, 抑制的法定人数传感的Methylobacterium , 从而抑制基因的表达, 控制生物膜的形成。
目前的协议的局限性将包括在人体试验中允许的不确定的最大数量的银纳米粒子和银 MWCNTs。在本议定书中, 银-MWCNTs 30 µg/毫升样品中所含的银色纳米粒子的数量平均估计为0.4 µg/毫升。这种浓度被视为与哺乳动物细胞的生物相容, 正如以前研究报告的6,7,8,9。MWCNTs 40 µg/毫升浓度的细胞毒性机制尚不确定, 但建议在培养皿的底部不附着血细胞可增加银 MWCNT 接触的可能性。今后可以对不同培养条件下的多种细胞类型的银纳米粒子进行详细的毒性研究。这些研究可以提供更多的信息, 关于银 MWCNT 与细胞相互作用的机制。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了 NRF 大学研究补助金 (2016) 和纳米材料技术开发项目的支持, 通过由科学和信息和通信技术部 (2017M3A7B8061942) 资助的韩国国家研究基金会 ()。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 N silver nitrate | SIGMA-ALDRICH | 1090811000 | |
| Carbon nanotube, multi-walled | Tokyo Chemical Industry Co., LTD | 308068-56-6 | |
| R2A agar | MBcell | MB-R1129 | |
| R2A broth | MBcell | MB-R2230 | |
| Methylobacterium spp. | KCTC | 12618 | from Korea Collection for Type Cultures Daejeon Korea 12618, Daejon, Korea |
| LIVE/DEAD Cell imaging Kit | ThermoFisher SCIENTIFIC | R37601 | |
| AML12 | from Chungnam University, Dajeon, Korea | ||
| human PBMC | ATCC | PCS-800-011 | |
| TEM | JEOL | JEM-2100F | |
| XRD | Rigaku | D/MAX 2500 | Cu K photon source (40kV, 100mA) |
| JuLI Br | NanoEnTek | JULI-BRSC |
References
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