Summary
本研究では多層カーボンナノ チューブの酸性酸化と銀ナノ粒子の後続の還元析出により抗菌ナノ材料を合成しました。準備としてナノ材料と抗菌活性と細胞毒性試験を行った。
Abstract
本研究では多層カーボンナノ チューブ (Mwcnt) は、酸素ベースの機能グループを形成する水溶液硫酸溶液で扱われました。銀 Mwcnt をアグノ3酸化 Mwcnt の水溶液から銀の還元析出によって作製した.Cnt の独特の色を考えると、それはなかった最小発育阻止濃度または彼らは、アッセイに干渉するので毒性および抗菌特性を評価するミトコンドリア毒性の試金に適用することが可能。抑制ゾーンと Ag Mwcnt の最小殺菌濃度を測定したし、ライブ/デッドとトリパン ブルーの試金は Cnt の色と干渉することがなく毒性および抗菌特性の測定に使用されました。
Introduction
本研究の最終的な目標は、そのフォームのバイオ フィルム細菌の増殖を抑制することが環境に優しいの抗菌ナノ材料をすることです。これらの抗菌ナノ材料には、一般的に使用される化学物質や抗生物質の化学物質の毒性と抗生物質抵抗の問題を克服するために可能性があります。バイオ フィルムは、多糖類、タンパク質、核酸、脂質1,2で構成される水和細胞外高分子物質 (EPS) です。バイオ フィルムは異物の侵入を防ぐためし、細菌3,4を活発に成長を助けます。バイオ フィルムは、臭気や慢性感染症5,6を引き起こします。Methylobacterium spp.、例えば、水は常に存在している、またはエアコン熱交換器、シャワー室や医療機器など、継続的に細菌の撲滅を確保することは困難がある場所に付着して育ちます。バイオ フィルムのこれらのタイプは、臭気や慢性感染症5,6を引き起こします。
通常、バイオ フィルムを形成する細菌の増殖を抑制する化学物質や抗生物質の化学化合物を使用します。抗生物質耐性菌や化学物質の生体内での安全性に対する懸念の出現は、バイオ フィルムの形成を防ぐために、細菌の増殖を抑制する新材料を開発する必要性を促進しています。
本研究では、抗生物質抵抗性と毒性から解放された抗菌ナノ材料が合成されます。銀はよく知られている抗菌物質・ ナノサイエンスとナノテクノロジーの最近の進歩は、金属ナノ粒子7,8抗菌効果に積極的な研究につながっています。最近の研究では、小さなサイズとナノ粒子の表面に容積率では、抗菌活性の増加9,10,11を報告しています。
ここに提示されたナノ材料は、増加の抗菌特性と単位体積当たりの表面積を増やす高アスペクト比を有する単層カーボンナノ チューブ銀ナノ粒子を組み合わせます。カーボンナノ チューブの作製した銀ナノ粒子-炭素複合材料は、実質的な抗菌特性、人間と動物の細胞に毒性を最小限を展示します。以前の研究で合成プロセスは、NaBH4ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ヒドラジンなど危険な還元剤を使用します。プロセスは、複雑な危険なと時間がかかる。報告された合成プロセスは、ここで大幅に危険の少ない還元剤としてエタノールを使用します。
抑制ゾーンと Ag Mwcnt の最小殺菌濃度 (MBC) を測定しました。ライブ/デッドとトリパン ブルーの試金は、毒性と抗菌特性を測定する使用されました。最小発育阻止濃度 (MIC) とミトコンドリア毒性 (MTT) の試金はあった、アッセイに干渉するいるとカーボンナノ チューブの異常な色のためは実行されません。最後に、哺乳類の細胞に影響を与えずにMethylobacterium 属菌の増殖を防ぐために最低濃度を測定しました。
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Protocol
1. MWCNT 酸化
- 30-50 mg を 50 mL バイアルに MWCNT を測定します。だから H28 mL を加えゆっくり4: 1 mL ピペット チップ、ピペットによる HNO3溶液 (初期濃度が 90%、3:1 巻/巻)。
注意: この準備は、化学の発煙のフードで実施する必要があります。- 発熱反応を完了するための 30 分を許可します。
- MWCNT がバイアルの下部に安定するまでの 60-80 ° C で 1 時間 160 W ソリューションの超音波照射します。
バイアルに水が生じないように注意:、超音波発生装置の水位はバイアルの上部よりも低いはずです。 - ソリューションを遠心管に転送します。
- 、ピペットを MWCNT COOH ソリューションに滴下 30 mL の蒸留水を追加します。
注意: 蒸留水添加時に強い発熱反応が発生します。ゆっくりと蒸留水を追加し、冷却のための時間を許可します。
- 、ピペットを MWCNT COOH ソリューションに滴下 30 mL の蒸留水を追加します。
- 12,000 × g、15 分間室温で MWCNT COOH 溶液を遠心します。
注意: 遠心分離機を操作する場合は、遠心分離機のサンプル チューブの反対側は同じ重量をチューブを配置することによってバランスのとれたままを確認します。 - ピペット、1 mL ピペット チップで上清を除去します。ピペット 1 mL ピペット チップとエタノール 5 mL を追加します。追加戻エタノールで瓶の壁をすすいでください。12,000 × g、15 分間室温で溶液を遠心します。
- Ph 試験紙で上澄みの pH を決定します。洗浄と遠心上清の pH が中性になるまで繰り返します。
- すべて上清を除去します。沈殿し、溶液中 MWCNT COOH を均等に分散する蒸留水 1 mL を追加します。真空下で-60 ° C でソリューションをフリーズドライ乾燥するまで。
2. 銀ナノ粒子沈着 Mwcnt
- MWCNT COOH の 10 mg を 50 mL の円錐管に置き、30 mL の蒸留水で希釈します。60 の ° C と 1 h の 160 W で溶液を超音波照射します。
- 50 mL の円錐管に 0.1 N アグノ3の 6 mL を置き、18 mL の蒸留水で希釈します。60 の ° C と 1 h の 160 W で溶液を超音波照射します。
注意: 追加 Ag の総質量が 20% を超えていない、アグノ3 Mwcnt の総質量に比例してであります。 - 60 ° C と続けるが AgNO3を追加した後 1 時間 sonicating W. 160 で混合物を sonicating 中、ピペット、1 mL ピペット チップ Mwcnt ソリューションに滴下アグノ3ソリューションを追加します。
- 12,000 × g、15 分間室温でソリューションを遠心し、上清を除去します。ソリューションを遠心し、上清を追加で 2 回削除します。
- Ag Mwcnt 混合物に 1 mL の蒸留水を追加し、ソリューションに均等に沈殿物を分散します。エタノール 5 mL を追加し、1 時間室温で進行する反応します。
- 12,000 × g、15 分間室温でソリューションを遠心し、上清を除去します。
- Ph 試験紙で上澄みの pH を決定します。洗浄と遠心上清の pH が中性になるまで繰り返します。
- Ag Mwcnt を 1 mL の蒸留水を追加し、ソリューションに均等に分散します。24 h の真空下で-70 ° C でソリューションをフリーズドライします。
3. ゾーンの抑制試験
- R2A 寒天の 18.12 g と 1 L フラスコに蒸留水をミックスします。121 ° C、15 分でオートクレーブで混合物を滅菌します。
- 室温で冷却するゲルを許可します。硬化固体媒体を準備する前にシャーレにゲルの 10 mL を配置します。
- 固体媒体の細菌の場所 100 μ L。拡散機を使用して固体培地に細菌を広げます。
注意: この手順はアルコール ランプで点灯している化学発煙のフードで実施する必要があります。 - 48 h の 30 ° C で料理を孵化させなさい。
- R2A スープの 3.12 g をフラスコに蒸留水 1 L に混ぜてください。121 ° C、15 分でオートクレーブで混合物を滅菌します。
- ループと針を使用して液体媒体に成長したコロニーを転送し、180 rpm および 30 ° C でインキュベーターで孵化させなさい
- 600 で紫外線吸光光度法による OD (光密度) 値を記録細菌の増殖を測定する毎に nm。
注: から R2A Methylobacterium 属菌の成長のため最寄りの寒天 R2A 寒天培地、標準ミューラー ・ ヒントン寒天ではなく、このテストで使用されました。 - 下の寒天培地を準備するシャーレの準備の R2A 寒天の場所 10 mL。
- 3.12 g R2A スープと寒天 8 g を蒸留水 1 L に混ぜてください。オートクレーブで 121 ° C、15 分位 10 mL 下の寒天ゲルの混合物を滅菌します。
- 50 μ L のピペット滅菌紙ディスク上の Ag Mwcnt ソリューションを読み込みます。
- 乾燥し、Ag Mwcnt サンプル 30 分間紫外線の下で真空チャンバー内を滅菌します。
- 寒天の場所 Ag Mwcnt サンプル。
- 48 h の 30 ° C で寒天版を孵化させなさい。
- 抑制12のメジャー ゾーン。
注: 使用しているソフトウェアについては、参照に含まれます。
4. 抗菌テスト
- 3.1 から 3.7 細菌培養を準備する手順を繰り返します。
- 最大径で細菌の 100 μ L をピペット、100 μ L マイクロ ピペット チップで新鮮な液体培地 3 mL に接種します。
- 5 準備 15 mL の円錐管に制御ソリューションの 50 μ L のサンプル。各管に以下を追加します: 1) メタノール;2) 1000 μ G/ml MWCNT-COOH;3) 50 μ G/ml Ag-Mwcnt;4) 40 μ G/ml Ag-MWMWCNTs;5) 30 μ G/ml Ag-Mwcnt。
- 前述の通り紫外線吸光光度法により最大限にアクティブになるまでは 180 rpm、30 ° C で孵化させなさい。
- 各サンプルの OD 値を測定し、MIC 濃度を計算します。OD 値はサンプル液中の細菌数に直結します。
- 拡散機が付いて固体培地に培養の細菌を広げます。
- 48 h の 30 ° C で皿を孵化させなさい。
- 細菌のコロニーと抗菌活性12を決定するメジャー CFU 値をカウントします。
注: 使用しているソフトウェアについては、参照に含まれます。
5. 実行可能性の試金
- インキュベーターから培養細胞を除去した後、培地を吸引し、5 mL の PBS の滴洗浄にて 3 回洗浄します。
- 1 分後に PBS で洗浄のセルと吸引にトリプシン-EDTA の 1 mL を追加します。
- スタックのセルを削除するプレートをタップします。
- DMEM (ダルベッコ変更イーグル培地) の 5 mL を追加し、セルを削除します。3 分の 200 x g でサンプルを遠心し、上清を除去します。
- DPBS とミックスの 1 つの mL を追加します。
- 自動細胞計数機とソリューションの 10 μ L のセルをカウントします。
注: 参照13細胞計数装置の使用のための指示が含まれます。
- DMEM ソリューションを含む 6 ウェル プレートのウェルあたりの AML12 細胞の場所 1 × 10 の5 。中には、10% (v/v) 牛胎児血清と 1% 滅菌抗生物質が含まれています。
- 5% CO295% の空気環境で 37 ° C で 8 ~ 12 時間のプレートを孵化させなさい。
- ヒメアリの井戸から上清を吸引します。
- コントロール、NMS DMSO (ジメチルスルホキシド) と 30-40 μ g/mL Ag MWCNT を DMEM の 1 mL から成る各サンプルを追加します。
- 8 h の 5% CO295% の空気環境で 37 ° C で孵化させなさい。
- 5 ml の PBS の上澄みと洗浄のサンプルを削除します。
- セルに滴下準備ライブ/デッド キット (5 μ L の PBS の 10 mL の DMSO で 4 mM カルセイン AM でに 2 mM EthD 1 の 20 μ L) の 1 つの mL を追加します。
- 100 X 300 X、標準的な蛍光顕微鏡による室温 30-45 分または 10 分測定蛍光の 37 ° C で孵化させなさい。
6. トリパン ブルー法
- 5.6.2 上記を通して 5.1 の手順に従ってサンプルを準備します。
- 上清を除去します。
- 1 ml の 1 x DPBS のプレートを洗い、デカントします。
- プレートし、文化から細胞をデタッチするのには 3 分間インキュベートするトリプシンの 1 mL を追加します。プレートを洗浄し、細胞を収集する細胞培養培地を使用します。15 mL チューブに集められたセルを配置します。
- 200 x g と 3 分の 4 ° C でチューブを遠心します。
- 上清を捨てます。細胞ペレットに新鮮な媒体の 1 つの mL を追加し、セルを再分散します。
- トリパン ブルー色素分散した細胞の 10 μ L で 10 μ L を追加し、自動細胞計数機とセルをカウントします。
注: 細胞計数装置の使用については、参照に含まれます。
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Representative Results
透過電子顕微鏡 (TEM) 像は、Ag Mwcnt (図 1 a および 1 b) の形成を確認します。自分の合成に成功は、表面電荷の変化を確認した.Mwcnt の堆積した銀粒子のサイズを求めた (図 1)。平均粒度が約 3.83 nm。合成として Ag Mwcnt の XRD パターンを図 1に示します。MWCNT; に対応するピークで 20-30 °残りのピークは、Ag に対応します。抗菌データを図 2に示します。細菌のコロニーの個体数を確認したMethylobacterium制御 (図 2 a)。メタノール添加減少人口 10 (図 2 b) に3回、MWCNT COOH の追加削減人口 108回 (図 2)。50 μ G/ml Ag MWCNT (図 2 D) 及び 40 μ G/ml Ag MWCNT (図 2 e) 試料中のコロニーを識別できませんでした。20 μ G/ml Ag MWCNT サンプルで人口の 10 の5回に減った (図 2 f)。Methylobacterium (図 3) に対する阻害試験のゾーン、10 μ g/mL を添加した抑制のゾーンが識別されます。1 μ G/ml の濃度で抑制帯は観察されなかった。細胞毒性試験ライブ/デッド試金 (図 4) はメタノールを使用した場合に、ネガティブ コントロール (図 4 a) の細胞毒性の有無と肯定的な制御 (図 4 b) の細胞毒性の存在を確認しました。(図 4) 40 μ g/mL Ag Mwcnt の追加は 30 μ g/mL の Ag Mwcnt (Figure 4 D) の添加は細胞毒性のかなりの量を明らかにしなかったしかしいくつかの細胞毒性を明らかにしました。トリパン ブルー法は、実行されます (図5) コントロール (図 5 a)、メタノール (図 5 b)、40 μ g/mL Ag Mwcnt (図 5)、30 μ G/ml Ag Mwcnt (図 5) サンプルのだった。結果は、30 μ G/ml Ag Mwcnt の非常に小さな細胞毒性があったことを確認しました。
図 1: Ag Mwcnt の物理化学的キャラクタリゼーション。Ag Mwcnt; の(A) と (B)の TEM 画像(C) Ag Mwcnt TEM による評価とサイズ分布 (n = 100);Ag の(D) x 線回折パターン-Mwcntこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 2: Methylobacterium sppを基準にして Ag Mwcnt の抗菌評価。(A)制御、メタノール(B) 、 (C) MWCNT-COOH、 (D) 50 μ g/mL (E) 40、Ag Mwcnt の μ g/mL、Ag Mwcnt と(F) 30 μ g/mL Ag の-Mwcntこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 3: Ag Mwcnt の抑制試験のゾーン。
図 4: Ag のセル実行可能性の試金-Mwcnt 顕微鏡写真の AML12 死んだ (赤) については、「蛍光、(緑) の細胞をライブ。 。制御(A) 、 (B)メタノール、 (C) 40 μ g/mL、Ag Mwcnt と(D) 30 μ g/mL Ag の-Mwcntこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 5: 30、40 μ g/mL Ag Mwcnt の試金のトリパン ブルー 。(A)制御、メタノール(B) 、 (C) 40 μ g/mL、Ag Mwcnt のと(D) Ag の 30 μ g/mL-Mwcnt (赤: 死んだ細胞; 青: 細胞)この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
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Discussion
堆積した Ag ナノ粒子を Mwcnt の準備のための簡単な方法を報告する.この銀を含有したナノマテリアルは、実質的な抗菌活性と体内の銀ナノ粒子の制御不能な吸収のため最小限の可能性を示しています。我々 はことを示す合成 Ag Mwcnt の 30 μ g/mL 哺乳類肝細胞にごくわずかな細胞毒性を持つMethylobacterium 属菌に対する抗菌活性の効果的なレベルであります。追加の改善と Ag Mwcnt のバイオ セーフティ アセスメントは商業セクターでの展開前に必要な環境にやさしいと安価な Ag Mwcnt を生成助けることができるエタノールを還元剤として使用します。
次の点が示されています。先進ナノ材料の細菌の様々 な種類を破壊することが可能です。銀ナノ粒子を預けられる、カーボンナノ チューブ表面で複数のサイトを設計することが可能です。抗菌特性は、サイズと表面上に堆積する銀ナノ粒子の数を制御することによって調整できます。先進ナノ材料は細菌の細胞に有毒であるが適切な濃度で人間と動物の細胞への毒性。
抗菌作用には次の機構を提案します。Ag MWCNT ナノ構造直接細菌細胞表層に連絡、細胞壁に損傷を与えるし、活性酸素種の二次酸化を引き起こすこれらのプロセスは、酸化ストレスになります。Methylobacterium属、それバイオ フィルムの形成を制御する遺伝子の発現を阻害するクオラムセンシングを阻害する銀イオンをリリースする Ag MWCNT ナノ構造を確認されています。
現在のプロトコルの制限には、銀ナノ粒子の Ag Mwcnt の人間の臨床試験で許容される未決定の最大量が含まれます。このプロトコルでは Ag Mwcnt の 30 μ g/mL のサンプルに含まれている銀のナノ粒子の量は平均で 0.4 μ g/mL と推定されました。この濃度は、以前研究6,7,8,9の報告された哺乳類細胞に生体適合性とみなされます。Ag Mwcnt の 40 μ G/ml の濃度で細胞毒性のメカニズムが決定、培養皿の底に血液細胞の添付ファイルが、文化の中に Ag MWCNT の接触の可能性を高めることを提案しました。将来は、様々 な異なる培養条件下での細胞の種類と銀ナノ粒子の詳細な毒性試験を実行できます。これらの研究は、細胞の Ag MWCNT の相互作用機構の追加情報を提供します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この研究は、韓国中央大学研究助成金 (2016) と、国立研究財団の Korea(NRF) 科学省と ICT (2017M3A7B8061942 号) によって資金を供給によるナノ材料技術開発プログラムに支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 N silver nitrate | SIGMA-ALDRICH | 1090811000 | |
| Carbon nanotube, multi-walled | Tokyo Chemical Industry Co., LTD | 308068-56-6 | |
| R2A agar | MBcell | MB-R1129 | |
| R2A broth | MBcell | MB-R2230 | |
| Methylobacterium spp. | KCTC | 12618 | from Korea Collection for Type Cultures Daejeon Korea 12618, Daejon, Korea |
| LIVE/DEAD Cell imaging Kit | ThermoFisher SCIENTIFIC | R37601 | |
| AML12 | from Chungnam University, Dajeon, Korea | ||
| human PBMC | ATCC | PCS-800-011 | |
| TEM | JEOL | JEM-2100F | |
| XRD | Rigaku | D/MAX 2500 | Cu K photon source (40kV, 100mA) |
| JuLI Br | NanoEnTek | JULI-BRSC |
References
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