Summary
Wir beschreiben die Erkennung des NLRP3-Inflammasome-Aktivierung auf zellulärer Basis mit Fluoreszenz-Mikroskopie und Färbung für aktive Caspase-1 und den Adapter, ASC. Ein Laktat-Dehydrogenase-Release-Assay wird vorgestellt, um Pyroptotic Lyse auf Basis einer Bevölkerung zu erkennen. Diese Techniken können angepasst werden, um viele Aspekte der Inflammasome Biologie zu studieren.
Abstract
Inflammasomes sind angeborene immun Signalisierung Plattformen, die für die erfolgreiche Bekämpfung vieler pathogenen Organismen sind erforderlich, sondern auch fördern entzündliche und Autoimmun-Krankheiten. Inflammasomes werden durch cytosolische Muster Anerkennung Rezeptoren, einschließlich derjenigen der NOD-Like-Rezeptor (NLR) Familienmitglieder aktiviert. Diese Rezeptoren oligomerize auf den Nachweis der mikrobiellen oder Schäden verbundenen Reize. Nachträgliche Einstellung des Adapter-Proteins ASC bildet eine mikroskopisch sichtbaren Inflammasome Komplex, die Caspase-1 durch Nähe-induzierte Auto-Aktivierung aktiviert. Nach der Aktivierung spaltet Caspase-1 Pro-IL-1β und Pro-IL-18, zur Aktivierung und Sekretion dieser Pro-inflammatorische Zytokine. Caspase-1 vermittelt auch entzündliche Form des Zelltods bezeichnet Pyroptosis, verfügt über den Verlust der Membran Integrität und Zell-Lyse. Caspase-1 spaltet Gasdermin D, die N-terminale Fragment, das Plasmamembran Poren bildet die Freigabe zu osmotische Lyse.
In Vitro, die Aktivierung von Caspase-1 kann durch Knochenmark stammenden Makrophagen mit der Caspase-1 Aktivität Sonde FAM-YVAD-FMK Kennzeichnung und Etikettierung der Zellen mit Antikörpern gegen das Adapter-Protein ASC ermittelt werden. Diese Technik ermöglicht die Identifikation von Inflammasome Bildung und Aktivierung der Caspase-1 in einzelnen Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie. Pyroptotic Zelltod kann durch Messung der Veröffentlichung der cytosolischen Laktat-Dehydrogenase in das Medium erkannt werden. Dieses Verfahren ist einfach, kostengünstig und in einer 96-Well-Platte-Format, so dass die Anpassung für das Screening durchgeführt. In dieser Handschrift zeigen wir, dass die Aktivierung des NLRP3-Inflammasome von Nigericin bis zur Co Lokalisierung der Adapter Protein ASC und aktive Caspase-1, führt zu Pyroptosis.
Introduction
Inflammasome-vermittelte Entzündung zugrunde liegt auch die Ursache von vielen Krankheiten2ist ein wesentlicher Bestandteil der Abwehr pathogener Organismen1 Die entzündliche Reaktion auf eine Vielzahl von Infektionen ausgelöst durch cytosolische Nachweis des Erregers verbunden molekulare Muster (PAMPs) oder Schäden verbunden molekulare Muster (DAMPs). Muster-Anerkennung-Rezeptoren (PRR), einschließlich derjenigen der NOD-Like-Rezeptor (NLR) Familienmitglieder oligomerize auf den Nachweis dieser PAMPs und DAMPs. Dies löst die Bildung eines Multi-Protein-Komplex bezeichnet die Inflammasome, die die PRR, Adapter Protein Apoptose-assoziierten Speck-Like Protein mit einer C-terminalen Caspase Recruitment Domain (Karte) (ASC) und pro-Form enthält Caspase-13,4. Diese Anlage ermöglicht Nähe-induzierte Auto-Aktivierung von Caspase-1. Aktive Caspase-1 führt dann zu einer Reihe von Ereignissen, die charakteristisch für die entzündliche Zelle Tod Weg Pyroptosis. Zu diesen Ereignissen gehören: die Spaltung und die Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen IL-1β und IL-18, Lysosomen Exozytose mit Freisetzung von lysosomalen Inhalts in den Extrazellulärraum, nukleare Kondensation und Gasdermin D Dekolleté. Die freigesetzte N-terminale Domäne des Gasdermin D fügt in der Plasmamembran, Bildung von Poren, die dazu führen, dass die Plasmamembran Bruch und Freisetzung von entzündlichen Inhalt, zusätzlich eine schützende Nische für Erreger Replikation5, wegnehmen 6 , 7.
Hier konzentrieren wir uns auf den gut untersuchten NLRP3-Inflammasome. Die Aktivierung des NLRP3-Inflammasome erfolgt durch einen zweistufigen Prozess8. Der erste "Priming" Schritt erfolgt durch die Anerkennung von Toll-Like-Rezeptoren (TLR) eines mikrobiellen Produkts. Dies wird in der Laborumgebung repliziert, mithilfe von LPS, um TLR4 zu stimulieren. Diese Stimulation reguliert NLRP3 und Pro-IL-1β durch NF-κB-Signalisierung. Grundierung zusätzlich Lizenzen NLRP3 durch nicht-transcriptional Mechanismen durch Induktion der Deubiquitination9,10 und Phosphorylierung oder Dephosphorylation bestimmte Rückstände11,12.
Das zweite Signal für NLRP3 Aktivierung wird gedacht, um mitochondrialen Faktoren, reaktive Sauerstoffspezies, Kalium Ausfluss und Kalzium-Signalisierung, beinhalten ein einheitlicher Mechanismus für NLRP3 Aktivierung schwer fassbaren8bleibt. Aktivierte NLRP3 durch Interaktionen zwischen seinen NACHT-Domains oligomerizes und ASC über Bindung von Pyrin (PYD) Domänen13Rekruten. In jeder Zelle bilden diese makromolekulare Komplexe einen einzigen mikroskopisch sichtbaren Fokus. ASC wurde ursprünglich als ein 22 KDa-Protein, das einen "Fleck" während der Apoptose von menschlichen Leukämie-Zellen bildet und benannte Apoptose-assoziierten Speck-Like Protein enthält eine Karte14identifiziert. Es wurde später festgestellt, dass ASC Pro-Caspase-1 durch das Zusammenspiel der Karte des ASC mit der Karte von Pro-Caspase-1, bilden die Inflammasome15Rekruten.
Nicht alle NLRs erfordern das Vorhandensein der ASC induzieren Caspase-1 Aktivierung. Im Gegensatz zu NLRP3 NLRC4 und NLRP1b Karte Domänen und Pro-Caspase-1 über Karte Interaktionen induzieren Caspase-1 Aktivierung direkt einstellen können. In Ermangelung von ASC aktive Caspase-1 bleibt diffus in die Zellflüssigkeit und bildet keinen einzigen Fokus. Diese diffuse aktive Caspase-1 ist ausreichend, um Pyroptotic Zelltod induzieren, aber ist nicht in der Lage, Pro-IL-1β13,16zu verarbeiten.
In diesem Manuskript besprechen wir zwei Möglichkeiten zur Aktivierung der Inflammasome zu beurteilen. Die erste verwendet die fluoreszierende Aktivität Sonde, FAM-YVAD-FMK, die die Caspase-1-Familie von Proteasen bindet. Diese Familie umfasst Caspase-1, aber auch Maus Caspase-11 und menschlichen Caspase-4 und Caspase-5. Makrophagen von Caspase-1/11 mangelhaft Mäuse in allen Experimenten verwenden, wird die Spezifität dieser Sonde angesprochen werden. Diese Methode kann kombiniert werden mit Antikörper Kennzeichnung von Inflammasome Komponenten, die wir auch beschreiben. Mikroskopische Visualisierung ermöglicht die Identifizierung von einzelnen Zellen, die aktive Caspase-1 und oligomerized ASC. Forscher werden mit dieser Methode feststellen, wo in der Inflammasome-Bildung-Kaskade ihren Manipulationen der Wirtszelle oder pathogener Organismus unter Studie auswirken. Zum Beispiel kann man unterscheiden, ob eine bestimmte Intervention verhindert, die Rekrutierung von ASC, komplexe NLRP3 dass oder richtet sich an die nachfolgenden Rekrutierung und Aktivierung von Caspase-117. Ergebnisse der Caspase-1 Aktivierung wie IL-1β-Sekretion zu prüfen wäre nicht in der Lage sein, zwischen diesen beiden Möglichkeiten zu unterscheiden. Auch, könnte die Sekretion von IL-1β geändert werden, ohne dass die Fähigkeit der Zellen zur Aktivierung der Caspase-1 und Pyroptotic Zelle Tod16zu unterziehen.
Die zweite Methode misst die Freisetzung von Laktat-Dehydrogenase (LDH) in die Zelle überstand, die auftritt, während Pyroptotic Makrophagen Lyse nach Aktivierung der Caspase-1, wie oben beschrieben. Diese zweite Methode ist eine bevölkerungsbezogene Ansatz wie die Freisetzung von LDH im gesamten gut gemessen wird. Dieser einfache Ansatz ermöglicht die schnelle Analyse von Proben (30 min Inkubation Zeit) um festzustellen, ob es Caspase-1-vermittelte Zelltod gibt und kann in einem 96-Well-Plattenformat durchgeführt werden.
Diese Methoden sind komplementär, jeweils mit verschiedenen Vorteilen, und beide sind Modifikationen leicht zugänglich. Beispielsweise kann Makrophagen Behandlung mit gezielten kleinen Molekulargewicht Verbindungen vor Inflammasome Stimulation verwendet werden, untersuchen die Rolle sicher, dass Proteine auf Entzündungsreaktionen Steuern haben können.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle tierische Verfahren geprüft und bei der Universität von Washington institutionelle Animal Care und Use Committee Richtlinien durchgeführt.
(1) die Ernte des Knochenmarks
- Aseptisch Femur und Tibia aus einer Maus herausnehmen und Reinigen der Knochen mit sterilen Instrumenten. Legen Sie die gereinigten Knochen in Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL L-Glutamin + 0,05 mM 2-Mercaptoethanol + 50 mg/mL Gentamicin Sulfat + 10.000 U/mL Penicillin/Streptomycin + 10 % fetalen bovine Serum (FBS, DMEM-10 komplette) und inkubieren Sie die Rohr für 15 min auf Eis.
- Entfernen Sie die proximalen und distalen Kugelgelenke mit einer Schere. Nadel 25 G an eine 10 mL Spritze gefüllt mit Medium in den Hohlraum der Knochen befestigt. Spülen Sie das Knochenmark mit DMEM-10 abgeschlossen. Aufzuwirbeln Sie jeder Klumpen durch das Medium sanft auf und ab pipettieren.
- Die Zellen für 10 min bei 300 X g zentrifugieren und die Anzahl der Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer. An dieser Stelle entweder Einfrieren der Zellen mit 90 % FBS + 10 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO) oder Platte Zellen in einem 15 cm Petrischale Makrophagen mit L929 konditioniert Medium (Schritt 2.1) zu unterscheiden.
(2) Differenzierung von Makrophagen Knochenmark abgeleitet
- Verwenden vorgewärmte Differenzierung Medium (21 mL DMEM-10 abgeschlossen und L929 Zellen bedingt Medium wie von Swanson Et Al. beschrieben 9 mL ( 18), habe Knochenmarkzellen in einem 15 cm nicht Gewebekultur Petrischale (1,2-1,5 x 107 Zellen) behandelt. 7 Tage inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C und 5 % CO2 . Fügen Sie eine zusätzliche 30 mL Differenzierung Medium auf den Teller am Tag 3 oder 4.
Hinweis: Es ist wichtig nicht zu Gewebekultur behandelt Platten verwenden wie Makrophagen schwierig werden zu lösen und zu ernten. - Makrophagen zu sammeln, waschen Sie die Platte mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und 20 mL kaltem PBS + 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA). Brüten Sie der Platte bei 4 ° C für 10 min. Ernte der Zellen durch pipettieren der PBS + EDTA über die Zellen und waschen Sie die Platte mit 10 mL PBS. Kombinieren Sie beide Waschgänge in zwei 15 mL konische Röhrchen.
- Die Zellen bei 300 X g für 10 min zentrifugieren und Aufschwemmen der Zellen in 10 mL von Phenol-rot frei DMEM + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL L-Glutamin + 0,05 mM 2-Mercaptoethanol + 5 % FBS (DMEM-5) und die Zellen, die entweder ein Hemocytometer oder ein Coulter Counter zählen. Halten Sie die Zellen auf dem Eis während der Auszählung.
- Samen der Makrophagen in Gewebekultur beschichtete Platten 2 x 105 Zellen/ml. Samen Sie für Mikroskopie-Experimente 1 mL der Zellen auf Deckgläsern in 24-well-Platten. Samen Sie für LDH Release Assays 100 µL der Zellen in einer 96-well-Platte. Samen Sie für die LDH-Assay 9 Brunnen (3 Brunnen unbehandelt, 3 Brunnen mit 100 % Lyse Kontrollen und 3 Brunnen für den experimentellen Stimulus).
- Zentrifugieren der 96-well-Platte für 5 min bei 300 X g, stellen Sie sicher, dass die Zellen gleichmäßig über die gut verteilt sind.
- Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 ° C + 5 % CO2 vor der Grundierung beginnen.
3. grundieren
- Ersetzen Sie das Medium mit frischem Medium (DMEM-5) mit 100 ng/mL LPS (500 μL für die 24 gut Platte oder 50 μL für die 96 gut Platte).
Hinweis: Es gibt eine Vielzahl von strukturellen Variationen in LPS, die Einfluss auf die Fähigkeit, TLR4-vermittelten Priming19zu stimulieren. LPS von Salmonella Minnesota R595 (Re) ist von mehreren Herstellern erhältlich und wird empfohlen. - Inkubieren Sie die Platte für 3 h bei 37 ° C und 5 % CO2.
(4) Aktivierung des NLRP3-Inflammasome mit Nigericin und Etikettierung mit FAM-YVAD-FMK
- Entfernen Sie das Medium zu und ersetzen Sie es mit 290 μL DMEM-5, 5 μM Nigericin und 5 mM Glycin enthält. Glycin wird hinzugefügt, um die Reduzierung der Lyse der Zelle bei der Aktivierung von Caspase-15. 60 min bei 37 ° C und 5 % CO2inkubieren. Verwenden Sie Wildtyp und Caspase-1 mangelhafte Makrophagen, um sicherzustellen, dass die beobachteten Beschriftung spezifisch für Caspase-1 ist.
- Während die letzten 45 min hinzufügen 10 μL 30 x FAM-YVAD-FMK, zubereitet nach den Anweisungen des Herstellers.
- Entfernen Sie nach 60 min das Medium und waschen Sie die Zellen dreimal für jeweils 5 min. mit 1 mL kaltem PBS.
- Fügen Sie 250 μL von 2 % Paraformaldehyd in jede Vertiefung und auf Eis bedeckt mit Alu-Folie für 30 min inkubieren.
- Fügen Sie während der letzten 5 min 4 μl 0,2 mM dunkelrote fluoreszierende Nukleinsäure Fleck um die Kerne zu beschriften. 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) oder andere Farbstoffe können auch Label DNA verwendet werden.
- Die Zellen dreimal mit 1 mL kaltem PBS waschen und Deckgläsern auf Objektträger mit 7 μl Anti-Fade Eindeckmittel zu montieren. Lassen Sie die Montage Medium über Nacht vor dem Versiegeln das Deckglas auf den Objektträger mit Nagellack Härten.
- Bild der Makrophagen durch konfokale Mikroskopie. Ex / Em für FAM-YVAD-FMK ist 492/520nm und 642/661 für dunkelrote fluoreszierende Nukleinsäure-Fleck. Achten Sie darauf, das Mikroskop einrichten, so dass unbehandelte Zellen nicht jeden beliebigen Hintergrund Färbung in den 488 Kanal angezeigt werden. Andernfalls wird die Hintergrundfärbung FAM-YVAD-FMK erkannt und nicht die tatsächliche aktive Caspase-1 sein.
Hinweis: Mikroskop-Set-up ist in Abschnitt 6 beschrieben.
5. Antikörper Färbung
Hinweis: Um die Zellen mit Antikörpern gegen ASC erkennen zu beschriften, Saatgut, prime und setzen Sie die Zellen, die Nigericin identisch mit dem vorherigen Abschnitt. Die Verarbeitung ist danach wie folgt:
- Waschen Sie die Zellen dreimal für jeweils 5 min. mit 1 mL kaltem PBS. Fügen Sie 250 μL der Fixierung und Permeabilisierung Lösung. Brüten die Zellen auf Eis, und für 30 min abgedeckt.
- Waschen Sie die Makrophagen dreimal für jeweils 5 min. mit 1 mL der Waschpuffer.
- Fügen Sie 250 μl Primärantikörper gegen ASC 1: 500 in Waschpuffer verdünnt und 1 h auf dem Eis inkubieren. Gehören Sie ein deckgläschen, der erhält keiner primären Antikörper, sondern erhält nur die sekundäre. Das Deckglas wird während des Setups Mikroskop verwendet werden, um den richtigen Abstand vom Koordinatenursprung.
- Waschen Sie die Zellen dreimal für jeweils 5 min. mit 1 mL Waschpuffer.
- Fügen Sie 250 μL der Sekundärantikörper (Fluoreszenzfarbstoff konjugierten Ziege-Anti-Maus) 1: 500 in Waschpuffer verdünnt und 1 h auf dem Eis inkubieren. Label-Kerne 4 μl 0,2 mM dunkelrote fluoreszierende Nukleinsäure Fleck für die letzten 5 min diese Inkubation hinzufügen.
- Waschen Sie die Zellen 3 X mit 1 mL kalte Waschpuffer und Mount Deckgläsern auf Mikroskop Folien mit 7 μl Anti-Fade Eindeckmedium. Lassen Sie die Montage Medium über Nacht vor dem Versiegeln das Deckglas auf den Objektträger mit klaren Nagellack Härten.
- Bild Makrophagen konfokalen Mikroskopie. Ex / Em für den sekundären Antikörper ist 555/580 nm und 642/661 für dunkelrote fluoreszierende Nukleinsäure Fleck (wie unten beschrieben).
Hinweis: Mit FAM-YVAD-FMK und Antikörper Beschriftung Beschriftung kann kombiniert werden um Co Lokalisierung von aktive Caspase-1 und ASC zeigen. Hierzu folgen Sie die Bedingungen für die FAM-YVAD-FMK Kennzeichnung und wechseln Sie dann in der Antikörper labeling Protokoll zur weiteren Verarbeitung.
6. Bildgebung von beschrifteten Makrophagen durch konfokale Mikroskopie
Hinweis: Die gefärbten Zellen können nach der Deckgläsern erlaubt haben, über Nacht zu heilen und wurde auf dem Objektträger mit Nagellack versiegelt angesehen werden. Hier ist die Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop beschrieben. Zellen können auch durch standard Fluoreszenzmikroskopie beobachtet werden.
- Legen Sie die Folie mit den unbehandelten Zellen auf den Mikroskoptisch und konzentrieren Sie das Mikroskop auf die Zellen zu.
- Das Mikroskop Look Up Table (LUT) einstellen Einstellungen, Versatz, so dass es keine positiven FAM-YVAD-FMK Färbung in den unbehandelten Zellen. Dieser Vorgang kann auch mit mangelhaft Makrophagen Caspase-1 durchgeführt werden.
Hinweis: Der Offset hat für jeden Kanal in das Experiment verwendet angepasst werden, aber einstellen den korrekten Offset ist kritischste für die FAM-YVAD-FMK Kanal und fluoreszierende Antikörper Kanäle. Der Offset für die DNA-Kanal ist weniger kritisch. Sobald der Offset festgelegt wurde, stellen Sie diese Einstellung für den Rest des Experiments nicht. - Wechseln Sie die Folie zum Beispiel Nigericin behandelt. Finden Sie ein Feld, beide Zellen, die positiv und negativ enthält für die FAM-YVAD-FMK Färbung sind. Passen Sie die Abbildungsebene des FAM-YVAD-FMK Kanals auf das Flugzeug, das die höchste Intensität der positive Färbung hat. Normalerweise werden dies im Flugzeug, wo das Zentrum des Inflammasome Fokus abgebildet ist.
- Passen Sie die Verstärkung so dass Brennpunkte in den Zellen sichtbar sind, die verdichteten Kerne haben. Lassen Sie nach der Einstellung von Gain und Offset diese Einstellungen für den Rest der bildgebenden Sitzung.
Hinweis: Eine einfache Möglichkeit, festzustellen, ob eine Zelle Pyroptotic ist durch das nukleare Morphologie betrachten. Zellen mit aktiven Caspase-1 haben abgerundete und verdichteten Kerne, während nukleolen in Zellen ohne Aktivierung der Caspase-1 und die nukleare Morphologie sichtbar sind ist ähnlich denen von unbehandelten Zellen. - Sammeln Sie Bilder von 5 zufällig ausgewählten Felder bei 100 X Gesamtvergrößerung. Dies führt normalerweise ca. 40 Zellen pro Bild. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Probe.
- Die Anzahl der Zellen in jedem Bild mit Bildanalyse-Software. Dann die Anzahl der Zellen, die positive FAM-YVAD-FMK Färbung haben. Vertreten Sie die Aktivierung der Caspase-1 als der Anteil der FAM-YVAD-FMK positive Zellen.
(7) LDH-Release-Assay
Hinweis: Für die LDH-Release-Assay verwenden Saatgut und Prime, was die Zellen wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, außer einer 96-well-Platte. Entfernen Sie das Medium nicht nach dem grundieren.
- Fügen Sie 50 μL DMEM-5 mit 10 μM Nigericin in die experimentelle Vertiefungen und 50 μL DMEM-5, die spontanen und 100 % Lyse-Kontroll-Vertiefungen. Fügen Sie keine Glycin in diesem Experiment, da die Zelle Lysis messen soll. 60 min bei 37 ° C und 5 % CO2inkubieren.
- Nach 30 min 10 μl 10 X Lyse Puffer zu 100 % Lyse Kontroll-Vertiefungen und fügen Sie 10 μL DMEM-5 hinzu, die weiteren Bohrungen. Während diese Inkubation 1 Durchstechflasche Substrat-Mix (1,5 mL gefriergetrocknete Substrat) und 1 aliquoten testpuffer (~ 12 mL) aus der Tiefkühltruhe zu entfernen und lichtgeschützt auf Zimmertemperatur auftauen lassen.
Hinweis: Die Substrat-Mischung enthält eine Tetrazolium Salz (Iodonitro-tetrazoliumsalz violett), die zu einem roten Formazan Produkt umgewandelt wird. - Nach insgesamt 60 min Inkubation Zentrifugieren der Platte für 5 min bei 500 X g bei 10 ° C. Übertragen Sie 50 μl des Überstands auf eine klare flach-Boden-Platte. Während dieser Zeit das Fläschchen des Substrat-Mix 12 mL testpuffer hinzu und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min vor der Verwendung.
- Fügen Sie 50 μL des Substrats in jede Vertiefung und 30 Minuten im Dunkeln inkubieren. Enthalten Sie mittlere nur Brunnen für leere Werte. Überprüfen Sie die Platte nach 15 min um sicherzustellen, dass das Signal die Nachweisgrenze des Lesers Platte nicht überschreiten wird.
- Fügen Sie nach 30 min 50 μL Stopp-Lösung (1 M Essigsäure hinzu) und Messen Sie OD490 mit einem Teller-Reader.
- Berechnen Sie den Anteil der Lyse der Zelle mit Hilfe der folgenden Formel:
% Cytoxicity = ((Experimental-Spontaneous) / (maximale-spontane)) × 100
Experimentelle: Nigericin behandelt Zellen; spontane: unbehandelten Zellen; maximal: Zellen, Lyse-Puffer
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Um Caspase-1 Aktivierung nach der Exposition gegenüber Nigericin zu erkennen, wurden die Zellen verarbeitet, wie im Abschnitt Protokoll beschrieben. Wir kombinierten FAM-YVAD-FMK und ASC Etikettieren Antikörper um zu zeigen, dass ASC und aktive Caspase-1 Co lokalisieren nach Aktivierung des NLRP3-vermittelten Inflammasome. Abbildung 1A zeigt, dass Wildtyp Makrophagen ausgesetzt 5 μM Nigericin Bildung von einer ASC-Fokus in der perinukleären Region. Diese Schwerpunkte enthalten außerdem aktive Caspase-1 durch die Co Lokalisierung der ASC mit FAM-YVAD-FMK gesehen. Die Zellen, die positiv für aktive Caspase-1 haben nuklearen Kondensation, die zeigen, dass diese Zellen Pyroptosis renoviert werden. Abbildung 1 b zeigt, dass während Makrophagen Caspase-1/11 mangelhaft Mäuse die Bildung einer ASC-Fokus haben, sie kein aktive Caspase-1 verbunden mit dieser Ausrichtung, wie gezeigt durch das Fehlen der FAM-YVAD-FMK Färbung haben. Die Kerne dieser Zellen werden nicht verdichtet, darauf hinweist, dass es keine Pyroptotic Zelle Tod auftreten. Bilder wurden mit einem Scan confocal Mikroskop mit einem 63 X Öl Immersion Ziel. Bilder wurden als TIFF-Dateien gespeichert, ohne weitere Verarbeitung.
Um den Umfang des Zelltods bestimmen, die Exposition gegenüber Nigericin zugeordnet ist, haben wir auf die Kultur überstand einen LDH-Release-Assay durchgeführt. Abbildung 2 zeigt, dass Wildtyp Makrophagen Zelltod nach der Exposition gegenüber Nigericin unterziehen. Im Gegensatz dazu entbinden einen Mangel an Caspase-1 Makrophagen nicht LDH in der Zelle überstand, darauf hinweist, dass die Zellen intakt sind.
Abbildung 1: FAM-YVAD-FMK und Anti-ASC Kennzeichnung. (A) Wildtyp (WT) und (B) Caspase-1/11-defizienten (c1/11- / -) Makrophagen wurden 5 μM Nigericin für 1 h ausgesetzt und analysiert für aktive Caspase-1 durch konfokale Mikroskopie mit FAM-YVAD-FMK aktive Caspase-1 und Anti-ASC erkennen Primär- und Ziege-Anti-Maus Sekundärantikörper ASC erkennen Fokus Bildung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: LDH-Freisetzung Untersuchungsergebnisse. Wildtyp und Caspase-1/11 mangelhaft Makrophagen 5 μM Nigericin für 1 h ausgesetzt waren und Zelle überstand wurde auf das Vorhandensein von LDH analysiert. Daten sind Mittel ± SD von drei Wiederholungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dieser Handschrift haben wir zwei Techniken untersuchen Inflammasome Aktivierung und die Folge der Aktivierung der Caspase-1 nach NLRP3 Stimulation in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet vorgestellt. Die erste Technik ermöglicht den Forscher, die Aktivierung der Caspase-1 auf einer zellulären Basis mit fluoreszierenden Reporter FAM-YVAD-FMK bestimmen. Dieser Reporter ist hochspezifisch für die Bindung der Caspase-1-Familie von Enzymen, wie durch das Fehlen der Färbung in Caspase-1/11 mangelhaft Makrophagen gesehen. Spezifität wurde auch von LaRock Et al.gezeigt. in ihr Manuskript beschreibt die Rolle des Proteins Yersinia YopM zur Aktivierung der Caspase-1. In ihrer Handschrift zeigen sie, dass FAM-YVAD-FMK Brennpunkte überschneidet sich mit Schwerpunkten, die mit Antikörpern gegen Caspase-117beschriftet wurden.
Wie bei jedem Experiment der Fall ist, gibt es einige wichtige Schritte, die befolgt werden, um falsch positive Ergebnisse zu beseitigen müssen. Zunächst einmal ist es unerlässlich, Wildtyp und Caspase-1/11 mangelhafte Makrophagen zu verwenden. Mithilfe dieser beiden Zelltypen können Bedingungen, die zu unspezifischen Flecken führen von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden. Zweitens: wie bei jeder Antikörper oder Aktivität Taster Beschriftung Assay, ist es wichtig, gründlich waschen die Zellen nach der Färbung mit FAM-YVAD-FMK. Mithilfe von drei 5 min wäscht, ist das Niveau der Hintergrundsignal stark reduziert. Ein dritter wichtiger Schritt tritt während der Installation von confocal Mikroskop. Hier ist es wichtig, dass die unbehandelte Zellen beschriftet mit FAM-YVAD-FMK verwendet werden, um den Offset des confocal Mikroskop so eingestellt, dass keine positive zytoplasmatischen Färbung in den unbehandelten Zellen beobachtet wird. Wenn diese Schritte befolgt werden, ist diese Technik ein nützliches Instrument zur Aktivierung der Caspase-1 auf einer zellulären Basis zu bewerten.
Dieses Protokoll kann die Forscher Bedürfnisse angepasst werden. Zum Beispiel können die Zellen mit kleinen Molekulargewicht Verbindungen in mehreren Schritten während des gesamten Prozesses behandelt werden. Dies würde es ermöglichen für die Identifizierung von Bahnen, die die Oligomerisierung NLR, die Rekrutierung von ASC oder Pro-Caspase-1, zu modulieren oder die Aktivierung von Caspase-1 selbst. Die Änderungen dieses Protokolls müssen so sein, dass sie nicht Caspase-1 von selbst aktivieren. In diesem Fall ist eine Dosis-Antwort-Kurve des betreffenden Arzneimittels erforderlich. Obwohl wir uns auf die Aktivierung des NLRP3 Inflammasome konzentriert, dieses Protokoll auch einsetzbar, Inflammasomes, ausgelöst durch andere PRRs zu untersuchen. Eine weitere Modifikation haben wir in dieser Handschrift enthalten ist die Kombination der FAM-YVAD-FMK Färbung mit Antikörper Kennzeichnung von Inflammasome Komponenten. Wir zeigen, dass es Co Lokalisierung des Inflammasome Adapters ASC mit aktiven Caspase-1. Eine Einschränkung dieser Methode ist wie beschrieben, es Zugang zu einem confocal Mikroskop erforderlich. Allerdings wurde eine ähnliche Strategie, ASC Fokus Bildung von Durchflusszytometrie zu erkennen gemeldeten20,21.
Die zweite Technik, die wir besprochen ermöglicht die schnelle Erkennung von Zelle Lyse mit Hilfe eines LDH-Release-Assays. Es ist wichtig zu beachten, dass LDH-Freisetzung Verlust der Plasmamembran Integrität und Zell-Lyse, wodurch angezeigt, auch tritt auf, während viele andere Formen des Zelltods wird, und ist nicht spezifisch für Pyroptosis. Allerdings kann die Verwendung von Caspase-1 mangelhaft Zellen Caspase-1-abhängige Zelle Lysis, ein bezeichnendes Merkmal des Pyroptosis identifizieren.
Ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll (insbesondere bei Verwendung eines infektiösen Agens) soll die Platte nach der Aussaat der Zellen in einer 96-well-Platte Zentrifugieren. Zentrifugation der Platte ermöglicht gleichmäßige Verteilung der Makrophagen über die gesamte Oberfläche des Brunnens. Gleichmäßige Verteilung wird jedes Makrophagen, die gleiche Anzahl von Bakterien ausgesetzt werden. Ohne Zentrifugation führt der Meniskus-Effekt der Flüssigkeit in den Brunnen zu mehr Makrophagen an den Rand des Brunnens ansammeln. Dies würde zu MOI (MOI) in der Nähe der gut Wand und höher als vorgesehen in der Mitte des Brunnens niedriger als beabsichtigte Multiplizität der Infektion führen.
Ein potentieller Nachteil des LDH-Release-Assays ist, dass es Lyse Bevölkerung und zu einem einzigen Zeitpunkt pro Assay misst. Ein alternativer Ansatz besteht, Aufnahme von Zelle impermeant Farbstoffe durch Mikroskopie, zu quantifizieren, der Verlust der Integrität der Membran auf eine einzelne Zelle identifiziert. Kombiniert mit live Cell imaging-Plattformen bieten diesen Ansatz auch eine zeitliche Einschätzung der Pyroptosis22. Kleine DNA-Bindung fluoreszierende Farbstoffe wie Propidium Jodid oder Interkalation Bromid durchlaufen die Gasdermin D-Pore, zelluläre Nukleinsäuren binden und fluoreszieren5,22,23. Pore Bildung und Aufnahme dieser kleinen Farbstoffe zeitlich vor terminal Zelle Lysis. Lyse ermöglicht die Aufnahme von größeren Farbstoffe und Verlust der großen zelluläre Proteine wie LDH. Die Verwendung von Glycin kann experimentell Porenbildung von Lyse, abkoppeln, wie Glycin nicht, Gasdermin D-vermittelten Porenbildung, kleine Farbstoff Aufnahme oder IL-1β-Sekretion blockiert wird, aber Glycin schnelle Lyse und LDH Version5,22 hindert , 23 , 24. empfehlen wir auch Glycin in FAM-YAVD-FMK Färbung Experimente zum vollständigen Verlust der Integrität der Membran zu verhindern, aber Glycin muss ausgelassen werden, wenn Pyroptotic LDH-Freisetzung zu messen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen
Acknowledgments
Alle Mikroskopie erfolgte in der W. M. Keck Mikroskopie Mitte mit Unterstützung von Nathaniel Peters und mit Unterstützung des NIH Award S10OD016240. S.L.F. wird von NIH K08AI119142 und R21AI130281 unterstützt. Wir danken Dr. Richard Flavell und Dr. Brad Cookson Caspase-1/11 mangelhaft Mäuse und Dr. Brad Cookson für den Austausch von Laboreinrichtungen und Geräte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E-MEM | ATCC | 30-2003 | For growing L929 cells |
| NCRC clone 929 (L929) | ATCC | CCL-1 | |
| Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer. Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde |
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay | Fisher Scientific | PR-G1780 | Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid |
| FAM-YVAD-FMK | Immunocytochemistry Technologies | 98 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Invitrogen | 11960044 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Dulbecco's PBS, no calcium, no magnesium | Invitrogen | 14190144 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin | Invitrogen | 26140079 | Heat inactivated at 55°C for 50 min |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750060 | |
| ProLong Gold Mounting Medium | Invitrogen | p36934 | Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46 |
| goat anti-mouse ALEXA555 | Invitrogen | A-21422 | |
| HEPES (Ultra Pure) | Invitrogen | 11344041 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| TO-PRO-3 Iodide | Invitrogen | T3605 | far-red fluorescent nucleic acid stain |
| C57BL/6J mouse | Jackson Laboratoy | 000664 | |
| caspase-1/11-/- mouse | Jackson Laboratory | 016621 | |
| Leica SP8X Confocal Microscope | Leica | ||
| Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re) | List Biologicals | 434 | |
| anti-ASC clone 2EI-7 | Millipore-Sigma | 04-417 | |
| beta-mercapto-ethanol | Millipore-Sigma | M6250-10ML | |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650-5X10ML | |
| EDTA | Millipore-Sigma | E5391 | |
| Spectramax M3 plate reader | Molecular Devices | 5000414 |
References
- Jorgensen, I., Miao, E. A. Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens. Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).
- Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics. Nat Med. 21 (7), 677-687 (2015).
- Bergsbaken, T., Fink, S. L., Cookson, B. T. Pyroptosis: host cell death and inflammation. Nat Rev Microbiol. 7 (2), 99-109 (2009).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cell Microbiol. 8 (11), 1812-1825 (2006).
- Bergsbaken, T., Fink, S. L., den Hartigh, A. B., Loomis, W. P., Cookson, B. T. Coordinated host responses during pyroptosis: caspase-1-dependent lysosome exocytosis and inflammatory cytokine maturation. J Immunol. 187 (5), 2748-2754 (2011).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Sutterwala, F. S., Haasken, S., Cassel, S. L. Mechanism of NLRP3 inflammasome activation. Ann N Y Acad Sci. 1319, 82-95 (2014).
- Juliana, C., et al. Non-transcriptional priming and deubiquitination regulate NLRP3 inflammasome activation. J Biol Chem. 287 (43), 36617-36622 (2012).
- Py, B. F., Kim, M. S., Vakifahmetoglu-Norberg, H., Yuan, J. Deubiquitination of NLRP3 by BRCC3 critically regulates inflammasome activity. Mol Cell. 49 (2), 331-338 (2013).
- Song, N., et al. NLRP3 Phosphorylation Is an Essential Priming Event for Inflammasome Activation. Mol Cell. 68 (1), 185-197 (2017).
- Stutz, A., et al. NLRP3 inflammasome assembly is regulated by phosphorylation of the pyrin domain. J Exp Med. 214 (6), 1725-1736 (2017).
- Broz, P., Dixit, V. M. Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling. Nat Rev Immunol. 16 (7), 407-420 (2016).
- Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. J Biol Chem. 274 (48), 33835-33838 (1999).
- Yamamoto, M., et al. ASC is essential for LPS-induced activation of procaspase-1 independently of TLR-associated signal adaptor molecules. Genes Cells. 9 (11), 1055-1067 (2004).
- Miao, E. A., Rajan, J. V., Aderem, A. Caspase-1-induced pyroptotic cell death. Immunol Rev. 243 (1), 206-214 (2011).
- LaRock, C. N., Cookson, B. T. The Yersinia virulence effector YopM binds caspase-1 to arrest inflammasome assembly and processing. Cell Host Microbe. 12 (6), 799-805 (2012).
- Swanson, M. S., Isberg, R. R. Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum. Infect Immun. 63 (9), 3609-3620 (1995).
- Miller, S. I., Ernst, R. K., Bader, M. W. LPS, TLR4 and infectious disease diversity. Nat Rev Microbiol. 3 (1), 36-46 (2005).
- Sester, D. P., et al. A novel flow cytometric method to assess inflammasome formation. J Immunol. 194 (1), 455-462 (2015).
- Sester, D. P., et al. Assessment of Inflammasome Formation by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2016).
- DiPeso, L., Ji, D. X., Vance, R. E., Price, J. V. Cell death and cell lysis are separable events during pyroptosis. Cell Death Discov. , (2017).
- Russo, H. M., et al. Active Caspase-1 Induces Plasma Membrane Pores That Precede Pyroptotic Lysis and Are Blocked by Lanthanides. J Immunol. 197 (4), 1353-1367 (2016).
- Evavold, C. L., et al. The Pore-Forming Protein Gasdermin D Regulates Interleukin-1 Secretion from Living Macrophages. Immunity. , (2017).
