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Immunology and Infection

Murine अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज में Inflammasome सक्रियण और Pyroptotic कोशिका मृत्यु का पता लगाने

Published: May 21, 2018 doi: 10.3791/57463
Automatic Translation
1, 1
1Department of Laboratory Medicine, University of Washington

Summary

हम सेलुलर आधार पर NLRP3 inflammasome सक्रियण का पता लगाने का वर्णन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और सक्रिय caspase के लिए दाग-1 और अनुकूलक, ए एस सी का उपयोग कर । एक स्तनपान डिहाइड्रोजनेज जारी परख एक जनसंख्या के आधार पर pyroptotic lysis का पता लगाने के लिए प्रस्तुत किया है । इन तकनीकों को inflammasome जीव विज्ञान के कई पहलुओं का अध्ययन अनुकूलित किया जा सकता है ।

Abstract

Inflammasomes जन्मजात प्रतिरक्षा संकेत प्लेटफार्मों कि कई रोगजनक जीवों के सफल नियंत्रण के लिए आवश्यक हैं, लेकिन यह भी भड़काऊ और भड़काऊ रोगों को बढ़ावा देने के हैं । Inflammasomes cytosolic पैटर्न मांयता रिसेप्टर्स, मंजूरी की तरह रिसेप्टर (NLR) परिवार के सदस्यों सहित द्वारा सक्रिय कर रहे हैं । इन रिसेप्टर्स माइक्रोबियल या क्षति से संबंधित उत्तेजनाओं का पता लगाने पर oligomerize । अनुकूलक प्रोटीन ए एस सी के बाद भर्ती एक microscopically दृश्यमान inflammasome परिसर, जो निकटता प्रेरित ऑटो-सक्रियण के माध्यम से caspase-1 सक्रिय रूपों । सक्रियण के बाद, caspase-1 सट प्रो-il-1β और प्रो-il-18, सक्रियण और इन समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस के स्राव के लिए अग्रणी । Caspase-1 भी कोशिका मृत्यु के भड़काऊ रूप pyroptosis, जो झिल्ली अखंडता और कोशिका lysis की हानि सुविधाओं मध्यस्थता । Caspase-1 gasdermin डी, N-टर्मिनल टुकड़ा जो प्लाज्मा झिल्ली pores रूपों जारी, आसमाटिक lysis करने के लिए अग्रणी ।

इन विट्रो में, caspase-1 के सक्रियकरण caspase-1 गतिविधि जांच FAM-YVAD-FMK के साथ अस्थि मज्जा-व्युत्पंन मैक्रोफेज लेबलिंग द्वारा निर्धारित किया जा सकता है और अनुकूलक प्रोटीन ए एस सी के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं लेबल द्वारा । इस तकनीक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर व्यक्तिगत कोशिकाओं में inflammasome गठन और caspase-1 सक्रियण की पहचान की अनुमति देता है । Pyroptotic कोशिका मृत्यु मध्यम में cytosolic स्तनपान डिहाइड्रोजनेज की रिहाई को मापने के द्वारा पता लगाया जा सकता है । इस प्रक्रिया को सरल, लागत प्रभावी है और एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में प्रदर्शन किया, स्क्रीनिंग के लिए अनुकूलन की अनुमति । इस पांडुलिपि में, हम बताते है कि NLRP3 inflammasome के सक्रियकरण nigericin द्वारा अनुकूलक प्रोटीन ए एस सी और सक्रिय caspase-1 के सह स्थानीयकरण के लिए सुराग, pyroptosis करने के लिए अग्रणी ।

Introduction

Inflammasome-मध्यस्थता सूजन रोगजनक जीवों के खिलाफ रक्षा का एक महत्वपूर्ण घटक है1, लेकिन यह भी कई रोगों के एटियलजि2पर निर्भर करता है । संक्रमण की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए भड़काऊ प्रतिक्रिया रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) या नुकसान आणविक पैटर्न (स्पंज) के cytosolic का पता लगाने के द्वारा शुरू हो रहा है । पैटर्न मांयता रिसेप्टर्स (पीआरआर), मंजूरी की तरह रिसेप्टर (NLR) परिवार के सदस्यों सहित, इन PAMPs और स्पंज का पता लगाने पर oligomerize. यह एक बहु प्रोटीन परिसर के गठन के inflammasome, जो पीआरआर, अनुकूलक प्रोटीन Apoptosis-जुड़े धब्बा एक सी-टर्मिनल caspase-भर्ती डोमेन (कार्ड) (ए एस सी) युक्त प्रोटीन की तरह शामिल है, और समर्थक के रूप में caspase-13,4. इस जटिल caspase-1 के निकटता प्रेरित ऑटो-सक्रियण की अनुमति देता है । सक्रिय caspase-1 तो घटना है कि भड़काऊ कोशिका मौत मार्ग pyroptosis की विशेषता है का एक सेट की ओर जाता है । इन घटनाओं में शामिल हैं: दरार और रिहाई के भड़काऊ साइटोकिंस il-1β और il-18, lysosomal अंतरिक्ष में extracellular सामग्री की रिहाई के साथ lysosome exocytosis, परमाणु संघनित्र, और gasdermin डी दरार । प्लाज्मा झिल्ली में gasdermin डी आवेषण के जारी एन टर्मिनल डोमेन, गठन pores कि प्लाज्मा झिल्ली टूटना और भड़काऊ सामग्री की रिहाई के कारण, दूर लेने के लिए एक सुरक्षात्मक जगह के अलावा रोगजनक प्रतिकृति5, ६ , 7.

यहां, हम अच्छी तरह से अध्ययन NLRP3 inflammasome पर ध्यान केंद्रित । NLRP3 inflammasome का सक्रियण एक दो-चरणीय प्रक्रिया8के माध्यम से होता है । पहले "भड़काना" कदम एक माइक्रोबियल उत्पाद के टोल की तरह रिसेप्टर्स (TLR) द्वारा मांयता के माध्यम से होता है । यह TLR4 को उत्तेजित करने के लिए एलपीएस का उपयोग करके प्रयोगशाला सेटिंग में प्रतिकृति है । यह उत्तेजना NLRP3 और प्रो-IL-1β NF-kB संकेतन के माध्यम से नियंत्रित करता है । इसके अलावा गैर transcriptional तंत्र के माध्यम से NLRP3 लाइसेंस भड़काने के द्वारा अपने deubiquitination9,10 और फास्फारिलीकरण या विशिष्ट अवशेषों के dephosphorylation11,12।

NLRP3 सक्रियण के लिए दूसरा संकेत mitochondrial कारकों, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों, पोटेशियम समाप्ति और कैल्शियम संकेतन शामिल करने के लिए सोचा है, हालांकि NLRP3 सक्रियण के लिए एक एकीकृत तंत्र8मायावी रहता है । सक्रिय NLRP3 oligomerizes अपने NACHT डोमेन के बीच बातचीत के माध्यम से, और रंगरूटों ए एस सी pyrin (PYD) डोमेन13के बंधन के द्वारा । प्रत्येक कक्ष में, ये macromolecular कॉम्प्लेक्स एक एकल microscopically दृश्यमान फ़ोकस बनाते हैं. ए एस सी मूल रूप से एक 22 केडीए प्रोटीन है कि मानव लेकिमिया कोशिकाओं के apoptosis के दौरान एक "धब्बा" रूपों के रूप में पहचान की थी, और नाम apoptosis-जुड़े धब्बा एक कार्ड14युक्त प्रोटीन की तरह । यह बाद में निर्धारित किया गया था कि ए एस सी रंगरूटों प्रो-caspase-1 के कार्ड के साथ ए एस सी के कार्ड की बातचीत के माध्यम से प्रो caspase-1, inflammasome15के गठन ।

नहीं सभी NLRs caspase-1 सक्रियण प्रेरित करने के लिए ए एस सी की उपस्थिति की आवश्यकता होती है । NLRP3 के विपरीत, NLRC4 और NLRP1b कार्ड डोमेन है और सीधे प्रो-caspase-कार्ड के माध्यम से 1 भर्ती कर सकते है कार्ड बातचीत caspase-1 सक्रियण प्रेरित करने के लिए । ए एस सी के अभाव में, सक्रिय caspase-1 cytosol भर में फैलाना रहता है और एक भी ध्यान केंद्रित फार्म नहीं है । इस फैलाना सक्रिय caspase-1 pyroptotic कोशिका मौत के लिए प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है, लेकिन समर्थक IL-1β13,16प्रक्रिया करने में असमर्थ है ।

इस पांडुलिपि में हम inflammasome सक्रियण का आकलन करने के लिए दो तरीकों पर चर्चा करेंगे । सबसे पहले फ्लोरोसेंट गतिविधि जांच का उपयोग करता है, FAM-YVAD-FMK, जो caspase-1 परिवार को चिढ़ाता बांधता है । इस परिवार में caspase-1, लेकिन इसके अलावा माउस caspase-11 और ह्यूमन caspase-4 और caspase-5 शामिल हैं । सभी प्रयोगों में caspase-1/11 आपुर्ति चूहों से मैक्रोफेज का उपयोग करके, इस जांच की विशिष्टता को संबोधित किया जाएगा । इस विधि inflammasome घटकों के एंटीबॉडी लेबलिंग के साथ जोड़ा जा सकता है, जो हम भी वर्णन करेंगे । सूक्ष्म विज़ुअलाइज़ेशन सक्रिय caspase-1 और oligomerized ए एस सी युक्त व्यक्तिगत कोशिकाओं की पहचान के लिए अनुमति देता है । इस विधि का प्रयोग, शोधकर्ताओं ने निर्धारित करने में सक्षम हो जाएगा, जहां inflammasome गठन झरना मेजबान सेल के अपने जोड़तोड़ या अध्ययन के तहत रोगजनक जीव एक प्रभाव है । उदाहरण के लिए, एक अंतर कर सकते है कि एक दिया हस्तक्षेप NLRP3 परिसर में ए एस सी की भर्ती को रोकता है या बाद में भर्ती और caspase के सक्रियकरण-117लक्ष्य । caspase-1 सक्रियकरण के परिणामों की जांच ऐसे IL-1β स्राव के रूप में इन दो संभावनाओं के बीच अंतर करने में सक्षम नहीं होगा । इसके अलावा, IL-1β का स्राव caspase-1 को सक्रिय करने और pyroptotic कोशिका मृत्यु16से गुजरना करने की क्षमता कोशिकाओं को बदलने के बिना बदला जा सकता है ।

दूसरी विधि सेल supernatant, जो pyroptotic मैक्रोफेज lysis निंनलिखित caspase-1 के रूप में ऊपर वर्णित सक्रियण के दौरान होता है में स्तनपान डिहाइड्रोजनेज (LDH) की रिहाई के उपाय । यह दूसरी विधि है एक जनसंख्या आधारित दृष्टिकोण के रूप में LDH की रिहाई में पूरी तरह से मापा जाता है । इस सरल दृष्टिकोण तेजी से विश्लेषण के लिए अनुमति देता है (गर्मी समय के 30 मिनट) नमूनों की निर्धारित करने के लिए अगर वहां है caspase-1-मध्यस्थ सेल मौत और एक ९६-well प्लेट प्रारूप में किया जा सकता है ।

इन तरीकों पूरक हैं, विभिंन लाभों के साथ प्रत्येक, और दोनों आसानी से संशोधनों के लिए उत्तरदाई हैं । उदाहरण के लिए, लक्षित छोटे आणविक वजन inflammasome उत्तेजना से पहले यौगिकों के साथ मैक्रोफेज उपचार भूमिका कुछ प्रोटीन भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करने पर हो सकता है की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं को मंजूरी दी और वॉशिंगटन विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशा निर्देशों के तहत आयोजित किया गया ।

1. अस्थि मज्जा की फसल

  1. Aseptically एक चूहे से फीमर और टिबिया निकालें और बाँझ उपकरणों का उपयोग हड्डियों को साफ । Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में साफ हड्डियों प्लेस + 5 मिमी HEPES + ०.२ मिलीग्राम/एमएल एल-glutamine + ०.०५ मिमी 2-mercaptoethanol + ५० मिलीग्राम/एमएल gentamicin सल्फेट + १०,००० U/एमएल पेनिसिलिन/streptomycin + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS, DMEM-10 पूर्ण) और मशीन 15 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब ।
  2. समीपस्थ और बाहर की गेंद कैंची का उपयोग कर जोड़ों निकालें । एक 10 मिलीलीटर हड्डियों के खोखले में मध्यम से भरा सिरिंज से जुड़ी एक 25 ग्राम सुई डालें । DMEM-10 पूर्ण का उपयोग कर अस्थि मज्जा बाहर फ्लश । मध्यम ऊपर और धीरे से नीचे pipetting द्वारा किसी भी झुरमुट reसस्पेंड ।
  3. ३०० x g पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं के केंद्रापसारक और एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं की संख्या गिनती । इस बिंदु पर, या तो ९०% FBS + 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) या प्लेट एक 15 सेमी पेट्री डिश में कोशिकाओं का उपयोग मैक्रोफेज वातानुकूलित मध्यम (चरण २.१) का उपयोग L929 अंतर करने के लिए कोशिकाओं फ्रीज ।

2. अस्थि मज्जा का भेदभाव-व्युत्पंन मैक्रोफेज

  1. पूर्व गरम भेदभाव मध्यम का उपयोग करना (DMEM के 21 मिलीलीटर-10 पूर्ण और L929 सेल वातानुकूलित माध्यम के 9 मिलीलीटर Swanson एट अल द्वारा वर्णित के रूप में. 18), एक 15 सेमी गैर ऊतक संस्कृति पेट्री डिश इलाज में अस्थि मज्जा कोशिकाओं डाल (1.2-1.5 x 107 कोशिकाओं) । 7 दिनों के लिए ३७ ° c और 5% सह2 पर थाली मशीन । 3 या 4 दिन में थाली के लिए एक अतिरिक्त 30 मिलीलीटर विभेदक जोड़ें ।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है के लिए ऊतक संस्कृति का इलाज प्लेटों का उपयोग नहीं, के रूप में मैक्रोफेज के लिए अलग और फसल मुश्किल हो जाएगा ।
  2. मैक्रोफेज इकट्ठा करने के लिए, प्लेट फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के साथ धोने और ठंडे पंजाबियों के 20 मिलीलीटर + 1 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) जोड़ें । 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर थाली मशीन, पंजाबियों को pipetting + EDTA कोशिकाओं पर फसल और पंजाब के 10 मिलीलीटर के साथ प्लेट धोने । २ १५ मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में दोनों बहाकर गठबंधन ।
  3. 10 मिनट के लिए ३०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक और phenol के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं reसस्पेंड-लाल मुक्त DMEM + 5 mM HEPES + ०.२ mg/एमएल एल-glutamine + ०.०५ मिमी 2-mercaptoethanol + 5% FBS (DMEM-5) और या तो एक hemocytometer या एक कल्टर काउंटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना । मतगणना के दौरान कोशिकाओं को बर्फ पर रखें ।
  4. 2 x 105 कोशिकाओं/एमएल में ऊतक संस्कृति लेपित प्लेटों में मैक्रोफेज बीज । सूक्ष्म प्रयोगों के लिए, बीज coverslips पर 24 अच्छी तरह से प्लेटों में कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर । LDH रिलीज की परख के लिए, एक ९६ अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं के बीज १०० µ एल । LDH परख के लिए, बीज 9 कुओं (3 कुओं अनुपचारित, १००% lysis नियंत्रण और प्रयोगात्मक उत्तेजना के लिए 3 कुओं के साथ 3 कुओं) ।
  5. ३०० एक्स जी में 5 मिनट के लिए ९६ अच्छी तरह से थाली केंद्रापसारक कुछ कोशिकाओं को समान रूप से अच्छी तरह से भर में वितरित कर रहे हैं ।
  6. ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर थाली मशीन + 5% सह2 भड़काना प्रक्रिया शुरू करने से पहले ।

3. भड़काना

  1. मीडियम को ताजे मीडियम से बदलें (DMEM-5) जिसमें १०० एनजी/एमएल एलपीएस (५०० μL के लिए 24 वेल प्लेट या ९६ वेल प्लेट के लिए ५० μL) शामिल हैं ।
    नोट: एलपीएस में संरचनात्मक रूपांतरों की एक किस्म है, जो TLR4 को उत्तेजित करने की क्षमता को प्रभावित19भड़काना । एलपीएस से साल्मोनेला मिनेसोटा R595 (आरई) कई विक्रेताओं से उपलब्ध है और सिफारिश की है ।
  2. ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह पर 3 एच के लिए थाली मशीन2।

4. FAM-YVAD-FMK के साथ Nigericin और लेबलिंग के साथ NLRP3 Inflammasome का सक्रियकरण

  1. मध्यम निकालें और DMEM-5 युक्त 5 माइक्रोन nigericin और 5 मिमी glycine के २९० μL के साथ प्रतिस्थापित करें । Glycine के दौरान होती है जो कक्ष lysis की मात्रा को कम करने के लिए जोड़ा गया है caspase-1 सक्रियकरण5। ३७ ° c और 5% CO2पर ६० मिनट के लिए मशीन । देखा लेबलिंग caspase-1 के लिए विशिष्ट है कि यह सुनिश्चित करने के लिए दोनों जंगली प्रकार और caspase-1 की कमी मैक्रोफेज का उपयोग करें ।
  2. पिछले ४५ मिनट के दौरान, निर्माता के निर्देशों के अनुसार तैयार किए गए 30एक्स FAM-YVAD-FMK के 10 μL जोड़ें ।
  3. ६० मिनट के बाद, मध्यम निकालें और 5 मिनट के लिए प्रत्येक ठंडे पंजाबियों के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
  4. जोड़ें २५० μL 2% paraformaldehyde के लिए एक अच्छी तरह से और 30 मिनट के लिए एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर बर्फ पर गर्मी ।
  5. पिछले 5 मिनट के दौरान, ०.२ मिमी के 4 μL जोड़ें दूर-लाल फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग नाभिक लेबल करने के लिए । 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) या अन्य रंगों का भी डीएनए लेबल किया जा सकता है ।
  6. ठंड पंजाबियों की 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को तीन बार धो और माइक्रोस्कोप स्लाइड पर coverslips माउंट 7 μL विरोधी फीका बढ़ते माध्यम का उपयोग कर । coverslip कील पॉलिश का उपयोग कर स्लाइड करने के लिए सील करने से पहले रात में बढ़ते मध्यम सख्त चलो ।
  7. फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा मैक्रोफेज छवि । FAM के लिए पूर्व/YVAD-FMK है 492/520nm और 642/661 के लिए दूर-लाल फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग । इस तरह कि अनुपचारित कोशिकाओं को ४८८ चैनल में किसी भी पृष्ठभूमि धुंधला नहीं दिखा माइक्रोस्कोप स्थापित करने के लिए सुनिश्चित करें. अंयथा, पृष्ठभूमि FAM-YVAD-FMK धुंधला पता लगाया जाएगा और नहीं वास्तविक सक्रिय caspase-1 ।
    नोट: माइक्रोस्कोप सेट-अप खंड 6 में वर्णित है ।

5. एंटीबॉडी धुंधलाना

नोट: के लिए एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं लेबल के लिए ए एस सी, बीज, प्रधानमंत्री का पता लगाने और कोशिकाओं को बेनकाब करने के लिए पिछले अनुभाग के समान nigericin । बाद में प्रसंस्करण निंनानुसार है:

  1. 5 मिनट के लिए प्रत्येक ठंडे पंजाबियों के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को तीन बार धो लें । निर्धारण और permeabilization समाधान के २५० μL जोड़ें । बर्फ पर कोशिकाओं को गर्मी, और 30 मिनट के लिए कवर किया ।
  2. धोने बफर के 1 मिलीलीटर के साथ 5 मिनट प्रत्येक के लिए मैक्रोफेज तीन बार धो लो ।
  3. जोड़ें २५० के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के μL धो बफर में 1:500 पतला और बर्फ पर 1 एच के लिए मशीन । शामिल एक coverslip है कि किसी भी प्राथमिक एंटीबॉडी प्राप्त नहीं है, लेकिन केवल माध्यमिक प्राप्त होगा । इस coverslip को सही ऑफ़सेट सेट करने के लिए माइक्रोस्कोप सेटअप के दौरान उपयोग किया जाएगा ।
  4. 1 मिलीलीटर धोने बफर के साथ 5 मिनट प्रत्येक के लिए कोशिकाओं को तीन बार धो लें ।
  5. जोड़ें २५० माध्यमिक एंटीबॉडी के μL (फ्लोरोसेंट डाई संयुग्मित बकरी-विरोधी माउस) धो बफर में 1:500 पतला और बर्फ पर 1 एच के लिए मशीन । ०.२ mM दूर के 4 μL जोड़ें-इस मशीन के पिछले 5 मिनट के लिए लाल फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग लेबल नाभिक के लिए ।
  6. ठंडा धोने बफर के 1 मिलीलीटर के साथ 3x कोशिकाओं धो और माइक्रोस्कोप स्लाइड पर coverslips माउंट 7 μL विरोधी बढ़ते मध्यम फीका का उपयोग कर । coverslip स्पष्ट नेल पॉलिश का उपयोग करके माइक्रोस्कोप स्लाइड करने के लिए सील पहले रात को बढ़ते मध्यम सख्त चलो ।
  7. फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा मैक्रोफेज छवि । माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए पूर्व/555/580 एनएम और 642/661 के लिए अब तक लाल फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग (जैसा कि नीचे वर्णित है) ।
    नोट: FAM-YVAD-FMK और एंटीबॉडी लेबलिंग के साथ लेबलिंग को सक्रिय caspase-1 और ए एस सी के सह-स्थानीयकरण को दिखाने के लिए संयोजित किया जा सकता है. इसके लिए, FAM-YVAD-FMK लेबलिंग के लिए शर्तों का पालन करें और फिर आगे की प्रक्रिया के लिए एंटीबॉडी लेबलिंग प्रोटोकॉल पर जाएं ।

6. फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा लेबल मैक्रोफेज की इमेजिंग

नोट: coverslips के बाद रात के इलाज की अनुमति दी गई है और नेल पॉलिश के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड को सील किया गया है के बाद सना हुआ कोशिकाओं को देखा जा सकता है । यहां, इमेजिंग एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर वर्णन किया गया है । कोशिकाओं को भी मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा जा सकता है.

  1. माइक्रोस्कोप के मंच पर अनुपचारित नियंत्रण कोशिकाओं के साथ स्लाइड प्लेस और कोशिकाओं पर माइक्रोस्कोप ध्यान केंद्रित.
  2. माइक्रोस्कोप के ऊपर देखो तालिका (LUT) सेटिंग्स का उपयोग करना, ऑफसेट ऐसी है कि कोई सकारात्मक FAM-YVAD-अनुपचारित कोशिकाओं में FMK धुंधला है समायोजित करें । यह प्रक्रिया भी caspase-1 कमी मैक्रोफेज का उपयोग किया जा सकता है ।
    नोट: ऑफसेट प्रत्येक प्रयोग में इस्तेमाल चैनल के लिए समायोजित किया जा करने के लिए है, लेकिन सही ऑफसेट सेटिंग FAM-YVAD-FMK चैनल और फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी चैनलों के लिए सबसे महत्वपूर्ण है । डीएनए चैनल के लिए ऑफसेट कम महत्वपूर्ण है । ऑफ़सेट सेट किए जाने के बाद, इस सेटिंग को शेष प्रयोग के लिए समायोजित न करें ।
  3. nigericin उपचारित नमूना के लिए स्लाइड स्विच करें । कोई फ़ील्ड ढूंढें जिसमें FAM-YVAD-FMK धुंधला होने के लिए धनात्मक और ऋणात्मक दोनों कक्ष हों । FAM-YVAD-FMK चैनल के इमेजिंग विमान है कि सकारात्मक दाग की सबसे अधिक तीव्रता है विमान को समायोजित करें । यह आम तौर पर विमान जहां inflammasome ध्यान केंद्रित के केंद्र की छवि है होगा ।
  4. इस तरह है कि घावों नाभिक गाढ़ा है कोशिकाओं में दिखाई दे रहे है लाभ समायोजित करें । दोनों लाभ और ऑफ़सेट सेट करने के बाद, इन सेटिंग्स इमेजिंग सत्र के शेष के लिए छोड़ दें ।
    नोट: एक आसान तरीका है अगर एक सेल pyroptotic है निर्धारित करने के लिए परमाणु आकृति विज्ञान को देखकर है । सक्रिय caspase-1 के साथ कोशिकाओं गोल और गाढ़ा नाभिक है, जबकि nucleoli कोशिकाओं में caspase-1 सक्रियण के बिना दिखाई दे रहे हैं और परमाणु आकृति विज्ञान अनुपचारित कोशिकाओं के उन लोगों के लिए समान है ।
  5. 100X कुल आवर्धन पर 5 बेतरतीब ढंग से चयनित क्षेत्रों की छवियों को इकट्ठा । यह सामांय रूप से छवि प्रति ४० कोशिकाओं के बारे में परिणाम होगा । प्रत्येक नमूने के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ ।
  6. छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके प्रत्येक छवि में कक्षों की संख्या गिनना. फिर कोशिकाओं है कि सकारात्मक FAM-YVAD-FMK धुंधला है की संख्या गिनती । FAM-YVAD-FMK धनात्मक कक्षों के प्रतिशत के रूप में caspase-1 सक्रियण के स्तर का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

7. LDH जारी परख

नोट: LDH जारी परख, बीज और प्रधानमंत्री के रूप में पिछले अनुभाग में वर्णित कोशिकाओं के लिए, एक ९६ अच्छी तरह से थाली का उपयोग छोड़कर । मीडियम को भड़काने के बाद न निकालें ।

  1. DMEM-5 युक्त 10 माइक्रोन nigericin के प्रायोगिक कुओं और ५० μL DMEM-5 को सहज और १००% lysis नियंत्रण कुओं को जोड़ने के ५० μL जोड़ें । इस प्रयोग में glycine न जोड़ें क्योंकि लक्ष्य कोशिका lysis को मापने का है । ३७ ° c और 5% CO2पर ६० मिनट के लिए मशीन ।
  2. 30 मिनट के बाद, १००% lysis नियंत्रण कुओं के लिए 10x lysis बफर के 10 μL जोड़ें और अंय कुओं के लिए DMEM-5 के 10 μL जोड़ें । इस मशीन के दौरान, सब्सट्रेट मिश्रण (फ्रीजर-सूखे सब्सट्रेट के १.५ मिलीलीटर) और 1 aliquot परख बफर (~ 12 एमएल) फ्रीजर से के 1 शीशी निकालें और उन्हें गल कमरे के तापमान को प्रकाश से संरक्षित करते हैं ।
    नोट: सब्सट्रेट मिश्रण में एक tetrazolium नमक (iodonitro-tetrazolium वायलेट) होता है, जो एक लाल formazan उत्पाद में परिवर्तित हो जाता है ।
  3. ६० मिनट कुल गर्मी के बाद, 10 डिग्री सेल्सियस पर ५०० एक्स जी में 5 मिनट के लिए थाली केंद्रापसारक । supernatant के ५० μL को स् पष् ट फ्लैट-डाउन प्लेट में ट्रांसफर करें । इस समय के दौरान, 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर उपयोग करने से पहले सब्सट्रेट मिश्रण और गर्मी की शीशी को परख बफर के 12 मिलीलीटर जोड़ें ।
  4. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए सब्सट्रेट के ५० μL जोड़ें और अंधेरे में 30 मिनट के लिए गर्मी । रिक्त मानों के लिए मध्यम ही कुओं को शामिल करें । 15 मिनट के बाद प्लेट की जांच करें सुनिश्चित करें कि संकेत प्लेट रीडर का पता लगाने की सीमा से अधिक नहीं होगा बनाने के लिए ।
  5. 30 मिनट के बाद, जोड़ें ५० μL समाधान (1 एम एसिटिक एसिड) और माप आयुध डिपो४९० एक प्लेट रीडर का उपयोग कर ।
  6. निंन सूत्र का उपयोग करके कक्ष lysis का प्रतिशत परिकलित करें:
    % Cytoxicity = ((प्रयोगात्मक-सहज)/(अधिकतम-सहज)) × 100
    प्रायोगिक: nigericin कोशिकाओं का इलाज; सहज: अनुपचारित कोशिकाओं; अधिकतम: कक्ष lysis बफ़र से अवगत कराया

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Representative Results

nigericin करने के लिए एक्सपोज़र के बाद caspase-1 सक्रियण का पता लगाने के लिए, कक्ष प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित के रूप में संसाधित किए गए थे । हम दोनों FAM-YVAD-FMK और ए एस सी एंटीबॉडी लेबलिंग के क्रम में दिखाने के लिए कि ए एस सी और सक्रिय caspase-1 सह स्थानीयकरण निंनलिखित NLRP3-मध्यस्थता inflammasome सक्रियकरण संयुक्त । चित्र 1a से पता चलता है कि जंगली प्रकार मैक्रोफेज 5 माइक्रोन nigericin उजागर perinuclear क्षेत्र में एक ए एस सी ध्यान के गठन किया है । इन घावों भी FAM-YVAD-FMK के साथ ए एस सी के सह स्थानीयकरण द्वारा देखा के रूप में सक्रिय caspase-1 होते हैं । सक्रिय caspase-1 के लिए सकारात्मक कोशिकाओं है कि इन कोशिकाओं pyroptosis के दौर से गुजर रहे है दिखा परमाणु संघनित्र है । चित्र 1b से पता चलता है कि जबकि मैक्रोफेज caspase-1/11 की कमी चूहों एक ए एस सी ध्यान के गठन किया है, वे किसी भी सक्रिय caspase-1 के रूप में इस ध्यान के साथ जुड़े नहीं है FAM-YVAD-FMK धुंधला के अभाव द्वारा दिखाया गया है । इन कोशिकाओं का नाभिक गाढ़ा नहीं होता, यह दर्शाता है कि कोई pyroptotic कोशिका मृत्यु होने वाली है. छवियां एक 63X तेल विसर्जन उद्देश्य के साथ एक स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर लिया गया । छवियाँ किसी भी आगे संसाधन के बिना TIFF फ़ाइलों के रूप में सहेजे गए थे ।

आदेश में सेल मौत है कि nigericin के लिए जोखिम के साथ जुड़ा हुआ है के स्तर का निर्धारण करने के लिए, हम संस्कृति supernatant पर एक LDH जारी परख प्रदर्शन किया । चित्रा 2 से पता चलता है कि जंगली प्रकार मैक्रोफेज nigericin को जोखिम के बाद सेल मौत से गुजरना । इसके विपरीत, caspase-1 में मैक्रोफेज की कमी सेल supernatant में LDH जारी नहीं है, यह दर्शाता है कि कोशिकाओं को बरकरार हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: FAM-YVAD-FMK और एंटी-ए एस लेबलिंग. (क) जंगली प्रकार (WT) और (ख) caspase-1/11 आपुर्ति (c1/11-/) मैक्रोफेज उजागर किए गए 1 के लिए 5 माइक्रोन nigericin के लिए और सक्रिय caspase-1 के लिए विश्लेषण द्वारा फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग FAM-YVAD-FMK का पता लगाने के लिए सक्रिय caspase-1, और विरोधी ए एस सी प्राथमिक और बकरी-विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी ए एस सी फोकस गठन का पता लगाने के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: LDH रिलीज परख परिणाम. जंगली प्रकार और caspase-1/11 की कमी मैक्रोफेज 1 एच के लिए 5 माइक्रोन nigericin के संपर्क में थे और सेल supernatant LDH की उपस्थिति के लिए विश्लेषण किया गया था । डेटा का अर्थ है ± एसडी तीन की प्रतिकृति । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस पांडुलिपि में, हम inflammasome सक्रियण की जांच करने के लिए दो तकनीक प्रस्तुत किया है और murine अस्थि मज्जा में NLRP3 उत्तेजना के बाद caspase-1 सक्रियण के परिणाम-मैक्रोफेज व्युत्पंन । पहली तकनीक की अनुमति देता है शोधकर्ता फ्लोरोसेंट रिपोर्टर FAM-YVAD-FMK का उपयोग कर एक सेलुलर आधार पर caspase-1 सक्रियण के स्तर का निर्धारण करने के लिए । इस रिपोर्टर अत्यधिक एंजाइमों के caspase-1 परिवार बाध्यकारी के लिए विशिष्ट है, के रूप में caspase में धुंधला के अभाव से देखा-1/ विशिष्टता भी LaRock एट अलद्वारा दिखाया गया था । उनकी पांडुलिपि में caspase-1 सक्रियण पर Yersinia प्रोटीन YopM की भूमिका का वर्णन । उनकी पांडुलिपि में, वे बताते है कि FAM-YVAD-FMK घावों घावों कि caspase के खिलाफ निर्देश एंटीबॉडी के साथ लेबल किया गया के साथ ओवरलैप-117।

के रूप में किसी भी प्रयोग के साथ मामला है, वहां कुछ महत्वपूर्ण कदम है कि करने की आवश्यकता के लिए झूठी सकारात्मक परिणाम को खत्म करने का पालन कर रहे हैं । सबसे पहले, यह दोनों जंगली प्रकार और caspase-1/11 की कमी मैक्रोफेज का उपयोग करने के लिए आवश्यक है । इन दो प्रकार के सेल का उपयोग करके, शर्तों है कि गैर विशिष्ट धुंधला करने के लिए नेतृत्व आगे विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है । दूसरा, के रूप में किसी भी एंटीबॉडी या गतिविधि जांच लेबल परख के साथ, यह अच्छी तरह से FAM-YVAD-FMK के साथ धुंधला के बाद कोशिकाओं को धोने के लिए महत्वपूर्ण है । तीन 5 मिनट धोने का उपयोग करके, पृष्ठभूमि संकेत के स्तर बहुत कम है । एक तीसरा महत्वपूर्ण कदम फोकल माइक्रोस्कोप के सेटअप के दौरान होता है । यहां, यह महत्वपूर्ण है कि अनुपचारित कोशिकाओं FAM-YVAD-FMK के साथ लेबल के लिए इस तरह से फोकल माइक्रोस्कोप की ऑफसेट सेट किया जाता है कि कोई सकारात्मक cytoplasmic धुंधला अनुपचारित कोशिकाओं में मनाया जाता है । जब इन चरणों का पालन किया जाता है, तो यह तकनीक सेलुलर आधार पर caspase-1 के सक्रियण का आकलन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है ।

इस प्रोटोकॉल को शोधकर्ताओं की जरूरत के अनुरूप संशोधित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, कोशिकाओं को छोटे आणविक वजन यौगिकों के साथ पूरी प्रक्रिया के दौरान कई चरणों में इलाज किया जा सकता है । यह रास्ते कि NLR के oligomerization, या तो ए एस सी या प्रो-caspase-1, या caspase के सक्रियण-1 ही की भर्ती का नियमन करने की पहचान के लिए अनुमति होगी । इस प्रोटोकॉल के संशोधनों के लिए इस तरह है कि वे caspase-1 अपने आप को सक्रिय नहीं करना होगा । यदि ऐसा होता है, एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र प्रश्न में दवा की आवश्यकता है । हालांकि हम NLRP3 inflammasome के सक्रियण पर ध्यान केंद्रित, इस प्रोटोकॉल भी अंय PRRs द्वारा ट्रिगर inflammasomes की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक और संशोधन हम इस पांडुलिपि में शामिल किया है FAM-YVAD-FMK inflammasome घटकों के एंटीबॉडी लेबलिंग के साथ धुंधला का संयोजन है । हम बताते है कि वहां है सह स्थानीयकरण inflammasome एडेप्टर ए एस सी के साथ सक्रिय caspase-1 । वर्णित के रूप में इस पद्धति की एक सीमा है, कि यह एक फोकल माइक्रोस्कोप के लिए उपयोग की आवश्यकता है । हालांकि, प्रवाह cytometry द्वारा ए एस सी फोकस गठन का पता लगाने के लिए एक संबंधित रणनीति20,21बताया गया है ।

दूसरी तकनीक हम चर्चा सेल lysis के तेजी से पता लगाने के लिए एक LDH जारी परख का उपयोग करने की अनुमति देता है । यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि LDH जारी प्लाज्मा झिल्ली अखंडता और कोशिका lysis, जो भी कोशिका मृत्यु के कई अंय रूपों के दौरान होता है की हानि इंगित करता है, और pyroptosis के लिए विशिष्ट नहीं है । हालांकि, caspase-1 कमी कोशिकाओं के उपयोग caspase-1-निर्भर सेल lysis, pyroptosis की एक परिभाषित सुविधा की पहचान कर सकते हैं ।

इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम (विशेष रूप से जब एक संक्रामक एजेंट का उपयोग कर) को एक ९६ अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं बोने के बाद थाली केंद्रापसारक है । प्लेट के केंद्रापसारक अच्छी तरह की पूरी सतह भर में मैक्रोफेज के बराबर वितरण के लिए अनुमति देता है । समान वितरण के साथ, प्रत्येक मैक्रोफेज बैक्टीरिया की एक ही संख्या को उजागर किया जाएगा । बिना केंद्रापसारक, अच्छी तरह से में तरल पदार्थ के meniscus प्रभाव अधिक मैक्रोफेज को अच्छी तरह से किनारे पर जमते के लिए नेतृत्व करेंगे । इस संक्रमण का इरादा गुणा से कम करने के लिए नेतृत्व करेंगे (MOI) अच्छी तरह से दीवार के पास और अच्छा के केंद्र में इरादा MOI से अधिक है ।

LDH जारी परख के एक संभावित नुकसान यह है कि यह एक जनसंख्या स्तर पर lysis उपाय और परख प्रति एक समय बिंदु पर । एक वैकल्पिक तरीका माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिका impermeant रंजक के ऊपर है, जो एक ही कोशिका के आधार पर झिल्ली अखंडता की हानि की पहचान करता है । लाइव सेल इमेजिंग प्लेटफार्मों के साथ संयुक्त, इस दृष्टिकोण भी pyroptosis22के एक लौकिक मूल्यांकन प्रदान कर सकते हैं । छोटे डीएनए ऐसे propidium आयोडाइड या ethidium ब्रोमाइड के रूप में फ्लोरोसेंट रंजक बाध्यकारी gasdermin डी ताकना, बांध सेलुलर न्यूक्लिक एसिड, और fluoresce5,22,23के माध्यम से पारित कर सकते हैं । ताकना गठन और इन छोटे रंगों के आगे अस्थाई टर्मिनल सेल lysis से पहले । Lysis बड़ा रंजक और LDH जैसे बड़े सेलुलर प्रोटीन की हानि के ऊपर की अनुमति देता है । glycine का उपयोग कर सकते है प्रयोग lysis से कुछ भी नहीं ताकना निर्माण, के रूप में glycine ब्लॉक gasdermin डी-ताकना गठन, छोटे डाई तेज या IL-1β स्राव, लेकिन glycine को रोकने करता है रैपिड lysis और LDH रिलीज नहीं रोकता है5,22 , 23 , 24. हम FAM-YAVD-FMK धुंधला प्रयोग में glycine सहित सुझाव झिल्ली अखंडता की पूरी तरह से नुकसान को रोकने के लिए, लेकिन glycine pyroptotic LDH रिलीज को मापने जब लोप होना चाहिए ।

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Disclosures

लेखकों के हित का कोई टकराव नहीं है खुलासा

Acknowledgments

सभी माइक्रोस्कोपी Nathaniel पीटर्स के समर्थन के साथ और NIH पुरस्कार S10OD016240 के समर्थन के साथ डब्ल्यू एम उबकना माइक्रोस्कोपी केंद्र पर किया गया था । S.L.F. NIH K08AI119142 और R21AI130281 द्वारा समर्थित है । हम डॉ रिचर्ड Flavell और डॉ ब्रैड Cookson caspase-1/11 की कमी चूहों के लिए धंयवाद, और डॉ ब्राड Cookson प्रयोगशाला सुविधाओं और उपकरणों के बंटवारे के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E-MEM ATCC 30-2003 For growing L929 cells
NCRC clone 929 (L929) ATCC CCL-1
Fixation/Permeabilization Kit BD Biosciences 554714 Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer. Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde
Glycine Biorad 161-0718
Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay Fisher Scientific PR-G1780 Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid
FAM-YVAD-FMK Immunocytochemistry Technologies 98
DMEM, high glucose, no glutamine Invitrogen 11960044
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red Invitrogen 31053028
Dulbecco's PBS, no calcium, no magnesium Invitrogen 14190144
Fetal Bovine Serum, qualified, US origin Invitrogen 26140079 Heat inactivated at 55°C for 50 min
Gentamicin Invitrogen 15750060
ProLong Gold Mounting Medium Invitrogen p36934 Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46
goat anti-mouse ALEXA555 Invitrogen A-21422
HEPES (Ultra Pure) Invitrogen 11344041
L-Glutamine Invitrogen 21051024
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
TO-PRO-3 Iodide Invitrogen T3605 far-red fluorescent nucleic acid stain
C57BL/6J mouse Jackson Laboratoy 000664
caspase-1/11-/- mouse Jackson Laboratory 016621
Leica SP8X Confocal Microscope Leica
Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re) List Biologicals 434
anti-ASC clone 2EI-7 Millipore-Sigma 04-417
beta-mercapto-ethanol Millipore-Sigma M6250-10ML
DMSO Millipore-Sigma D2650-5X10ML
EDTA Millipore-Sigma E5391
Spectramax M3 plate reader Molecular Devices 5000414

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १३५ इम्यूनोलॉजी जन्मजात उन्मुक्ति inflammasome caspase-1 ए एस सी NLRP3 pyroptosis nigericin murine अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज
Murine अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज में Inflammasome सक्रियण और Pyroptotic कोशिका मृत्यु का पता लगाने
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den Hartigh, A. B., Fink, S. L. Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages. J. Vis. Exp. (135), e57463, doi:10.3791/57463 (2018).

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