Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Påvisning af Inflammasome aktivering og Pyroptotic celledød i Murine knoglemarv-afledte makrofager

Published: May 21, 2018 doi: 10.3791/57463
Automatic Translation
1, 1
1Department of Laboratory Medicine, University of Washington

Summary

Vi beskriver påvisning af NLRP3 inflammasome aktivering på cellulære grundlag ved hjælp af Fluorescens mikroskopi og farvning for aktive caspase-1 og adapteren, ASC. En laktat dehydrogenase release assay er præsenteret for at opdage pyroptotic lysis på grundlag af befolkningen. Disse teknikker kan tilpasses for at studere mange aspekter af inflammasome biologi.

Abstract

Inflammasomes er medfødte immun signaling platforme, der er nødvendige for vellykket kontrol af mange patogene organismer, men også fremme inflammatoriske og autoinflammatory sygdomme. Inflammasomes aktiveres ved cytosole mønster anerkendelse receptorer, herunder medlemmer af familien NOD-lignende receptor (NLR). Disse receptorer oligomerize ved påvisning af mikrobiel eller skade-associerede stimuli. Efterfølgende ansættelse af adapter protein ASC danner en mikroskopisk synlige inflammasome komplekse, som aktiverer caspase-1 gennem nærhed-induceret auto-aktivering. Efter aktivering kløver caspase-1 pro-IL-1β og pro-IL-18, fører til aktivering og udskillelsen af disse pro-inflammatoriske cytokiner. Caspase-1 også medierer inflammatorisk form for celledød kaldes pyroptosis, som byder på tabet af membran integritet og celle lysering. Caspase-1 kløver gasdermin D, frigiver den N-terminale fragment, som er plasma membran porer, hvilket fører til osmotisk lysering.

In vitro, aktivering af caspase-1 kan bestemmes ved mærkning knoglemarv-afledte makrofager med caspase-1 aktivitet sonden FAM-YVAD-FMK og ved mærkning celler med antistoffer mod adapter protein ASC. Denne teknik giver mulighed for identificering af inflammasome dannelse og caspase-1 aktivering i enkelte celler ved hjælp af Fluorescens mikroskopi. Pyroptotic celledød kan påvises ved at måle udgivelsen af cytosole laktat dehydrogenase til mediet. Denne procedure er enkel, omkostningseffektiv og udført i en 96-brønd plade format, muliggør tilpasning til screening. I dette manuskript viser vi, at aktivering af NLRP3 inflammasome af nigericin fører Co lokalisering af adapter protein ASC og aktive caspase-1, fører til pyroptosis.

Introduction

Inflammasome-medieret betændelse er et afgørende element i forsvar mod patogene organismer1, men også ligger til grund for ætiologien af mange sygdomme2. Det inflammatoriske respons til en bred vifte af infektioner er udløst af cytosole påvisning af patogenet associeret molekylære mønstre (PAMPs) eller skader associeret molekylære mønstre (DAMPs). Mønster anerkendelse receptorer (PRR), herunder medlemmer af familien NOD-lignende receptor (NLR) oligomerize ved detektion af disse PAMPs og DAMPs. Dette udløser dannelsen af et multi protein kompleks betegnes inflammasome, som indeholder PRR, adapter protein apoptose-associerede plet-lignende protein som indeholder et C-terminale caspase-rekruttering domæne (kort) (ASC) og Pro form af caspase-13,4. Dette kompleks tillader nærhed-induceret auto-aktivering af caspase-1. Aktive caspase-1 og derefter fører til et sæt af begivenheder, der er karakteristiske for inflammatoriske celle død pathway pyroptosis. Disse arrangementer omfatter: kavalergang og frigivelsen af inflammatoriske cytokiner IL-1β og IL-18, lysosomet exocytose med frigivelse af lysosomale indholdet i det ekstracellulære rum, nukleare kondens og gasdermin D kavalergang. Domænet frigivne N-terminalen af gasdermin D indsættes i plasma membranen, danner porer, der forårsager plasmamembran brud og frigivelsen af inflammatoriske indholdet, ud over at tage væk en beskyttende niche for patogenet replikering5, 6 , 7.

Her fokuserer vi på de velundersøgte NLRP3 inflammasome. Aktivering af NLRP3 inflammasome sker gennem en to-trins proces8. Den første "priming" skridt opstår ved anerkendelse af Toll-lignende receptorer (TLR) af en mikrobiel produkt. Dette er gentaget i indstillingen laboratorium ved hjælp af LP'ER til at stimulere TLR4. Denne stimulation upregulates NLRP3 og pro-IL-1β gennem NF-kB signalering. Priming desuden licenser NLRP3 gennem ikke-transcriptional mekanismer ved at inducere sin deubiquitination9,10 og fosforylering eller dephosphorylation af specifikke restkoncentrationer11,12.

Det andet signal for NLRP3 aktivering menes at inddrage mitokondrie faktorer, reaktive ilt arter, kalium efflux og calcium signalering, selv om en samlende mekanismen for NLRP3 aktivering stadig undvigende8. Aktiveret NLRP3 oligomerizes gennem interaktioner mellem dens NACHT domæner og rekrutter ASC via binding af pyrin (PYD) domæner13. I hver celle danne disse makromolekylære komplekser en enkelt mikroskopisk synlige fokus. ASC blev oprindeligt identificeret som en 22 KDa protein, som danner en "plet" under apoptose af humane leukæmiceller og navngivne apoptose-associerede plet-lignende protein som indeholder en kort14. Senere blev det fastslået, at ASC rekrutter pro-caspase-1 gennem samspillet mellem ASC kort med kort af pro-caspase-1, danner inflammasome15.

Ikke alle NLRs kræver tilstedeværelse af ASC til at fremkalde caspase-1 aktivering. I modsætning til NLRP3, NLRC4 og NLRP1b har kort domæner og kan direkte ansætte pro-caspase-1 via kort-kort interaktioner at fremkalde caspase-1 aktivering. I mangel af ASC, aktive caspase-1 er stadig diffus i hele cytosol og udgør ikke en enkelt fokus. Denne diffuse aktive caspase-1 er tilstrækkelig til at fremkalde pyroptotic celledød, men er ikke i stand til at behandle pro-IL-1β13,16.

I dette manuskript, vil vi diskutere to måder at vurdere inflammasome aktivering. Først bruger de fluorescerende aktivitet sonde, FAM-YVAD-FMK, som binder caspase-1 familie af proteaser. Denne familie indeholder caspase-1, men også mus caspase-11 og menneskelige caspase-4 og caspase-5. Ved hjælp af makrofager fra caspase-1/11 mangelfuld mus i alle forsøg, vil blive behandlet af denne sonde specificitet. Denne metode kan kombineres med antistof mærkning af inflammasome komponenter, som vi også vil beskrive. Mikroskopiske visualisering giver mulighed for identifikation af individuelle celler, der indeholder aktive caspase-1 og oligomerized ASC. Du bruger denne metode, vil forskere kunne bestemme hvor i inflammasome dannelse cascade deres manipulationer af cellen vært eller den sygdomsfremkaldende organisme under studiet har en effekt. For eksempel kan man skelne om en given intervention forhindrer ansættelse af ASC til NLRP3 komplekse eller mål efterfølgende rekruttering og aktivering af caspase-117. Undersøge resultaterne af caspase-1 aktivering som IL-1β sekretion ville ikke være i stand til at skelne mellem disse to muligheder. Ligeledes kunne sekretion af IL-1β ændres uden at ændre cellerne evnen til at aktivere caspase-1 og gennemgå pyroptotic celle død16.

Den anden metode måler frigivelse af laktat dehydrogenase (LDH) i cellen supernatanten, som opstår under pyroptotic makrofag lysis efter caspase-1 aktivering som beskrevet ovenfor. Denne anden metode er en befolkning-baseret tilgang, da udgivelsen af LDH i hele godt måles. Denne simple metode giver mulighed for hurtig analyse (30 min. i inkubationstiden) prøver at afgøre, om der er caspase-1-medieret celledød og kan udføres i et format, 96-brønd plade.

Disse metoder er komplementære, hver med forskellige fordele, og begge er let åbne over for ændringer. For eksempel kan makrofag behandling med målrettet små molekylvægt forbindelser før inflammasome stimulation bruges til at undersøge rollen visse proteiner kan have på at kontrollere inflammatoriske respons.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr procedurer blev godkendt og gennemført under University of Washington institutionelle Animal Care og brug Udvalget retningslinjer.

1. høst af knoglemarv

  1. Aseptisk fjerne lårben og skinneben fra en mus og rense knoglerne ved hjælp af sterile instrumenter. Placere de rensede knogler i Dulbecco ændret Eagle Medium (DMEM) + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL L-glutamin + 0,05 mM 2-mercaptoethanol + 50 mg/mL gentamicin sulfat + 10.000 U/mL penicillin/streptomycin + 10% føtal bovint serum (FBS, DMEM-10 komplet), og der inkuberes i rør i isbad i 15 min.
  2. Fjerne de proksimale og distale kugleled ved hjælp af saks. Indsæt en 25 G kanyle tilsluttet en 10 mL sprøjte fyldt med medium i hule af knoglerne. Skylle ud knoglemarven ved hjælp af DMEM-10 komplet. Resuspend eventuelle klumper af pipettering medium op og ned forsigtigt.
  3. Centrifugeres celler i 10 minutter ved 300 x g og tæller antallet af celler ved hjælp af en hemocytometer. På dette tidspunkt, enten fryser cellerne ved hjælp af 90% FBS + 10% dimethylsulfoxid (DMSO) eller plade celler i en 15 cm petriskål at differentiere makrofager ved hjælp af L929 aircondition medium (trin 2.1).

2. differentiering af knoglemarv-afledte makrofager

  1. Ved hjælp af pre varmede differentiering medium (21 mL af DMEM-10 komplette og 9 mL L929 celle aircondition medium som beskrevet af Swanson et al. 18), sætte knoglemarv celler i en 15 cm ikke-vævskultur behandlet petriskål (1,2-1,5 x 107 celler). Inkuber plade på 37 ° C og 5% CO2 i 7 dage. Tilføje en ekstra 30 mL af differentiering medium til pladen på dag 3 eller 4.
    Bemærk: Det er vigtigt ikke at bruge vævskultur behandlet plader, som makrofager vil være svært at løsrive og høste.
  2. At indsamle makrofager, vaske pladen med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og tilsættes 20 mL koldt PBS + 1 mM ethylendiamintetra syre (EDTA). Inkuber plade ved 4 ° C i 10 min. høst cellerne af pipettering PBS + EDTA over cellerne og vaske pladen med 10 mL PBS. Kombinere begge vasker i to 15 mL konisk rør.
  3. Centrifugeres celler på 300 x g i 10 min. og resuspend celler i 10 mL af phenol-rød gratis DMEM + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL L-glutamin + 0,05 mM 2-mercaptoethanol + 5% FBS (DMEM-5) og tælle de celler ved hjælp af enten en hemocytometer eller en Coulter counter. Hold celler på isen ved optællingen.
  4. Seed makrofager i vævskultur overtrukne plader på 2 x 105 celler/mL. Mikroskopi eksperimenter, frø 1 mL af celler på coverslips i 24 godt plader. LDH release assays, seed 100 µL af celler i en 96 godt plade. LDH assay, seed 9 wells (3 wells ubehandlet, 3 boringer med 100% lysis kontrol og 3 brønde for den eksperimentelle stimulus).
  5. Centrifuge 96 godt plade i 5 min på 300 x g at gøre visse celler er ligeligt fordelt på tværs af brønden.
  6. Inkuber plade natten over ved 37 ° C + 5% CO2 før du starter priming processen.

3. priming

  1. Udskift mediet med friske medium (DMEM-5) indeholdende 100 ng/mL LP'ER (500 μl til 24 godt plade eller 50 μL for 96 godt plade).
    Bemærk: Der er en række strukturelle variationer i LP'ER, som påvirker evnen til at stimulere TLR4-medieret priming19. LP'ER fra Salmonella minnesota R595 (Re) er tilgængelig fra flere leverandører og anbefales.
  2. Inkuber plade i 3 timer ved 37 ° C og 5% CO2.

4. aktivering af NLRP3 Inflammasome med Nigericin og mærkning med FAM-YVAD-FMK

  1. Fjern mediet og erstatte det med 290 μL af DMEM-5 indeholdende 5 μM nigericin og 5 mM glycin. Glycin er tilføjet til at reducere mængden af celle lysis, der opstår under caspase-1 aktivering5. Inkuber i 60 minutter ved 37 ° C og 5% CO2. Brug både vildtype og caspase-1 mangelfulde makrofager til at sikre, at den observerede mærkningsbestemmelserne er specifikke for caspase-1.
  2. I løbet af de sidste 45 min, tilsættes 10 μL af 30 x FAM-YVAD-FMK, tilberedt efter fabrikantens anvisninger.
  3. Efter 60 min, fjerne medium og vaske cellerne tre gange for 5 min hver med 1 mL koldt PBS.
  4. Tilsæt 250 μL af 2% PARAFORMALDEHYD til hver brønd og Inkuber på is dækket med aluminiumsfolie for 30 min.
  5. I løbet af de sidste 5 min, tilsættes 4 μL 0,2 mM far-red fluorescerende nukleinsyre pletten til at mærke kerner. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) eller andre farvestoffer kan også bruges til at afmærke DNA.
  6. Cellerne vaskes tre gange med 1 mL PBS, koldt og montere coverslips på objektglas bruge 7 μl anti-fade montering medium. Lad montering medium hærde natten før forsegling coverslip til objektglas bruger neglelak over.
  7. Billede af makrofager ved Konfokal mikroskopi. Ex / Em for FAM-YVAD-FMK er 492/520nm og 642/661 for far-red fluorescerende nukleinsyre pletten. Sørg for at konfigurere mikroskopet at ubehandlede celler ikke viser nogen baggrund farvning i 488 kanal. Ellers bliver baggrunden FAM-YVAD-FMK farvning opdaget og ikke faktiske aktive caspase-1.
    Bemærk: Mikroskop set-up er beskrevet i afsnit 6.

5. antistoffarvning

Bemærk: Hvis du vil navngive celler med antistoffer til at opdage ASC, frø, prime og udsætte celler til nigericin identisk med den foregående sektion. Behandling bagefter er som følger:

  1. Vaske cellerne tre gange for 5 min hver med 1 mL koldt PBS. Tilsæt 250 μL af fiksering og permeabilization løsning. Inkuber celler på is, og dækket i 30 min.
  2. Vask makrofager tre gange for 5 min hver med 1 mL af wash buffer.
  3. Tilsæt 250 μL af primære antistof mod ASC fortyndet 1: 500 i wash buffer og Inkuber i 1 time på køl. Omfatte en coverslip, der ikke modtager nogen primær antistof, men får kun sekundære. Denne coverslip vil blive brugt under opsætningen af mikroskop til at indstille den korrekte forskydning.
  4. Vaske cellerne tre gange for 5 min med 1 mL wash buffer.
  5. Tilsæt 250 μL af sekundær antistof (fluorescerende farvestof konjugeret gede-anti-mus) fortyndet til 1: 500 i wash buffer og Inkuber i 1 time på køl. Tilføj 4 μL af 0,2 mM far-red fluorescerende nukleinsyre pletten for de sidste 5 min af denne inkubation til etiketten kerner.
  6. Vaske cellerne 3 x med 1 mL koldt wash buffer og mount coverslips på mikroskop dias ved hjælp af 7 μl anti-fade montering medium. Lad montering medium hærde natten før forsegling coverslip til objektglas ved hjælp af klare neglelak over.
  7. Billede makrofager af Konfokal mikroskopi. Ex / Em for sekundær antistof er 555/580 nm og 642/661 for far-red fluorescerende nukleinsyre pletten (som beskrevet nedenfor).
    Bemærk: Mærkning med FAM-YVAD-FMK og antistof mærkning kan kombineres for at vise Co lokalisering af aktive caspase-1 og ASC. For dette, følge betingelserne for FAM-YVAD-FMK mærkning og derefter skifte til antistof mærkning protokol til videreforarbejdning.

6. billeddannelse af mærket makrofager af konfokalmikroskopi

Bemærk: De farvede celler kan ses, efter at coverslips har fået lov til at helbrede natten over og er blevet forseglet til objektglas med neglelak. Her, er imaging ved hjælp af en Konfokal mikroskop beskrevet. Celler kan også ses ved standard Fluorescens mikroskopi.

  1. Placere lysbillede med ubehandlet kontrol celler på stadiet mikroskop og fokusere mikroskop på cellerne.
  2. Ved hjælp af mikroskop ser op Table (LUT) justere indstillinger, forskydningen, så der er ingen positive FAM-YVAD-FMK farvning i de ubehandlede celler. Denne proces kan også udføres ved hjælp af caspase-1 mangelfulde makrofager.
    Bemærk: Forskydningen har at være justeret for hver kanal, der anvendes i forsøget, men angive den korrekte forskydning er mest kritiske for FAM-YVAD-FMK kanal og fluorescerende antistof kanaler. Forskydning for DNA-kanal er mindre kritiske. Når forskydningen er angivet, ikke justere denne indstilling for resten af forsøget.
  3. Skifte dias til eksemplet nigericin behandlet. Find et felt, der indeholder både celler, der er positive og negative for FAM-YVAD-FMK farvning. Justere imaging flyet af FAM-YVAD-FMK kanal til den plan, som har den højeste intensitet af positive farvning. Dette vil normalt være det fly, hvor midten af inflammasome fokus er afbildet.
  4. Du kan justere forstærkningen sådan foci er synlige i celler, der har kondenseret kerner. Efter indstilling af både gevinst og offset, forlade disse indstillinger for resten af imaging-session.
    Bemærk: En nem måde at afgøre, om en celle er pyroptotic er ved at kigge på nukleare morfologi. Celler med aktive caspase-1 har rundet og kondenseret kerner, mens nucleoli er synlige i celler uden caspase-1 aktivering og den nukleare morfologi er lig de ubehandlede celler.
  5. Indsamle billeder af 5 tilfældigt udvalgte felter på 100 X samlede forstørrelse. Dette vil normalt resultere i omkring 40 celler pr. billede. Gentag denne proces for hver prøve.
  6. Tæl antallet af celler i hver billede ved hjælp af billede analyse software. Derefter Tæl antallet af celler, der har positiv FAM-YVAD-FMK farvning. Repræsentere niveauet af caspase-1 aktivering som procentdelen af FAM-YVAD-FMK positive celler.

7. LDH Release Assay

Bemærk: For LDH release assay, frø og prime cellerne som beskrevet i det foregående afsnit, undtagen bruge en 96 godt plade. Fjern ikke mediet efter priming.

  1. Tilsæt 50 μL af DMEM-5 indeholdende 10 μM nigericin eksperimentelle brønde og 50 μL DMEM-5 til de spontane og 100% lysis kontrolhullerne. Undlad at tilføje glycin i dette eksperiment, da målet er at måle celle lysering. Inkuber i 60 minutter ved 37 ° C og 5% CO2.
  2. Efter 30 min, tilføje 10 μl af 10 x lysisbuffer til 100% lysis kontrolhullerne og tilsættes 10 μL DMEM-5 andre brønde. Under denne inkubering fjerner 1 hætteglas af substrat mix (1,5 mL frysetørret substrat) og 1 alikvot af analysebuffer (~ 12 mL) fra fryseren og lad dem tø beskyttet fra lys til stuetemperatur.
    Bemærk: Substrat mix indeholder en tetrazolium salt (iodonitro-tetrazolium violet), som er konverteret til en rød formazankoncentrationen produkt.
  3. Efter 60 min samlede inkubation, centrifugeres plade i 5 min på 500 x g ved 10 ° C. Overføre 50 μL af supernatanten til en klar fladbundede plade. I løbet af denne tid, tilføje 12 mL analysebuffer til hætteglas af substrat mix og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min før brug.
  4. Tilsæt 50 μL af substrat til hver brønd og Inkuber i 30 min. i mørke. Omfatte mellemstore eneste brønde for tomme værdier. Kontrollere pladen efter 15 min for at sikre, at signalet ikke vil overstige detektionsgraensen for i pladelæseren.
  5. Efter 30 min, tilsættes 50 μL stopopløsning (1 M eddikesyre) og måle OD490 ved hjælp af en Pladelæser.
  6. Beregne procentdelen af celle lysis ved hjælp af følgende formel:
    % Cytoxicity = ((Experimental-Spontaneous) / (maksimal-spontan)) × 100
    Eksperimentelle: nigericin behandlede celler; Spontan: ubehandlet celler; maksimal: celler udsat for lysisbuffer

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at påvise en caspase-1 aktivering efter udsættelse for nigericin, blev cellerne behandles som beskrevet i afsnittet protokol. Vi har kombineret både FAM-YVAD-FMK og ASC antistof mærkning for at vise at ASC og aktive caspase-1 Co lokalisere følgende NLRP3-medieret inflammasome aktivering. Figur 1A viser, at vildtype makrofager udsat for 5 μM nigericin har dannelsen af en ASC fokus i perinuclear regionen. Disse foci også indeholde aktive caspase-1 som det ses af fælles lokalisering af ASC med FAM-YVAD-FMK. De celler, der er positive for aktive caspase-1 har nukleare kondens viser, at disse celler under pyroptosis. Figur 1B viser, at mens makrofager af caspase-1/11 mangelfuld mus har dannelsen af en ASC fokus, de ikke har nogen aktiv caspase-1 forbundet med dette fokus som vist ved fravær af FAM-YVAD-FMK farvning. Kerner af disse celler er ikke kondenseret, der angiver, at der er ingen pyroptotic celle døden indtræffer. Billeder blev taget med en scanning Konfokal mikroskop med en 63 X oliebestandighedsobjektet. Billeder blev gemt som TIFF-filer uden yderligere forarbejdning.

For at fastslå omfanget af celledød, der er forbundet med eksponering for nigericin, udført vi en LDH release assay supernatanten Kulturudvalget. Figur 2 viser, at vildtype makrofager gennemgå celledød efter udsættelse for nigericin. Derimod frigive makrofager mangelfuld i caspase-1 ikke LDH i celle supernatanten, angiver, at cellerne er intakt.

Figure 1
Figur 1: FAM-YVAD-FMK og anti-ASC mærkning. (A) vildtype (WT) og (B) caspase-1/11 mangelfuld (c1/11- / -) makrofager blev udsat for 5 μM nigericin for 1 h og analyseret for aktive caspase-1 ved Konfokal mikroskopi af FAM-YVAD-FMK til påvisning af aktive caspase-1, og anti-ASC primære og gede-anti-mus sekundære antistoffer til at opdage ASC fokusere dannelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: LDH release assay resultater. Vildtype og caspase-1/11 mangelfulde makrofager blev udsat for 5 μM nigericin for 1 h og celle supernatanten blev analyseret for tilstedeværelsen af LDH. Data er middel ± SD af tre replikater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette håndskrift, har vi fremlagt to teknikker til at undersøge inflammasome aktivering og konsekvens af caspase-1 aktivering efter NLRP3 stimulation i murine knoglemarv-afledte makrofager. Den første teknik gør det muligt for forskeren til at fastslå omfanget af caspase-1 aktivering på cellulære grundlag bruger de fluorescerende reporter FAM-YVAD-FMK. Denne journalist er meget specifikke for bindende caspase-1 familie af enzymer, som ses ved fravær af farvning i caspase-1/11 mangelfulde makrofager. Specificitet blev også vist ved LaRock mfl. i deres manuskript, der beskriver rollen af Yersinia protein YopM på caspase-1 aktivering. I deres manuskript viser de, at FAM-YVAD-FMK foci overlapper med foci, der var mærket med antistoffer rettet mod caspase-117.

Som er tilfældet med ethvert eksperiment, er der nogle vigtige skridt, der skal følges for at eliminere falske positive resultater. Først og fremmest, er det bydende nødvendigt at bruge både vildtype og caspase-1/11 mangelfulde makrofager. Ved hjælp af disse to celletyper, kan betingelser, der fører til uspecifik farvning udelukkes fra yderligere analyse. For det andet, som med enhver antistof eller aktivitet sonde mærkning assay, det er vigtigt at cellerne vaskes grundigt efter farvning med FAM-YVAD-FMK. Ved hjælp af tre 5 min vasker, er niveau af baggrunden signal stærkt reduceret. En tredje kritiske trin opstår under installationen af en Konfokal mikroskop. Her er det vigtigt, at ubehandlede celler mærket med FAM-YVAD-FMK er bruges til at angive forskydningen af Konfokal mikroskop på en sådan måde, at ingen positiv cytoplasmatisk farvning er observeret i de ubehandlede celler. Når disse trin er fulgt, er denne teknik et nyttigt værktøj til at vurdere aktivering af caspase-1 på grundlag af cellulære.

Denne protokol kan ændres så de passer til forskere behov. For eksempel, kan cellerne behandles med små molekylvægt forbindelser på flere trin under hele processen. Dette ville give mulighed for identifikation af veje, der modulerer oligomerisering af NLR, ansættelse af enten ASC eller pro-caspase-1, eller aktivering af caspase-1 selv. Ændringer til denne protokol skal være sådan, at de ikke lave aktivere caspase-1 i sig selv. Hvis dette sker, er en dosis responskurve af det pågældende stof påkrævet. Selvom vi fokuserer på aktivering af NLRP3 inflammasome, kan denne protokol også bruges til at undersøge inflammasomes udløst af andre PRRs. En anden ændring, vi har medtaget i dette håndskrift er kombinationen af FAM-YVAD-FMK farvning med antistof mærkning af inflammasome komponenter. Vi viser, at fælles lokalisering af inflammasome adapter ASC med aktive caspase-1. En begrænsning af denne metode er som beskrevet, at det kræver adgang til en Konfokal mikroskop. En beslægtet strategi at opdage ASC fokus dannelse ved flowcytometri har imidlertid været rapporteret20,21.

Den anden teknik vi drøftede giver mulighed for hurtig påvisning af celle lysis ved hjælp af en LDH release assay. Det er vigtigt at bemærke, at LDH release angiver tab af plasma membran integritet og celle lysis, som også forekommer i mange andre former for celledød, og er ikke specifik for pyroptosis. Men brugen af caspase-1 mangelfuld celler kan identificere caspase-1-afhængige celle lysis, et definerende træk ved pyroptosis.

Et afgørende skridt i denne protokol (især når du bruger et smitstof) er at centrifugeres pladen efter såning celler i en 96 godt plade. Centrifugering af pladen giver mulighed for lige fordeling af makrofager over hele overfladen af brønden. Med ligelig fordeling, vil hver makrofag blive udsat for det samme antal bakterier. Uden centrifugering, vil menisk effekten af væske i brønden føre til flere makrofager akkumulere på kanten af brønden. Dette vil føre til lavere end tilsigtede mangfoldighed af infektion (MOI) tæt på godt væggen og højere end beregnet MOI midt i brønden.

En potentiel ulempe af LDH release assay er at det måler lysis på befolkningsniveau og på et enkelt tidspunkt pr. assay. En alternativ fremgangsmåde er at kvantificere optagelsen af celle impermeant farvestoffer ved mikroskopi, som identificerer tab af membran integritet på grundlag af enkelt celle. Kombineret med levende celle imaging platforme, kan denne tilgang også give en tidsmæssig vurdering af pyroptosis22. Små DNA-bindende fluorescerende farvestoffer såsom propidium Iodid eller ethidiumbromid kan passere gennem gasdermin D pore, binde cellulære nukleinsyrer og fluorescerer5,22,23. Pore dannelse og udbredelse af disse små farvestoffer forud tidsligt terminal celle lysering. Lysis giver mulighed for optagelse af større farvestoffer og tab af store cellulære proteiner som LDH. Anvendelse af glycin kan eksperimentelt koble pore dannelse fra lysis, som glycin ikke blokerer gasdermin D-medieret pore dannelse, lille farvestof optagelse eller IL-1β sekretion, men glycin forhindrer hurtige lysis og LDH frigivelse5,22 , 23 , 24. vi foreslår herunder glycin i FAM-YAVD-FMK farvning eksperimenter til at forhindre fuldstændig tab af membran integritet, men glycin skal udelades, når måling pyroptotic LDH frigivelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive

Acknowledgments

Alle mikroskopi blev gjort på W. M. Keck mikroskopi Center med støtte af Nathaniel Peters og med støtte af NIH award S10OD016240. S.L.F. er støttet af NIH K08AI119142 og R21AI130281. Vi takker Dr. Richard Flavell og Dr. Brad Cookson for caspase-1/11 mangelfuld mus og Dr. Brad Cookson til deling af laboratoriefaciliteter og udstyr.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E-MEM ATCC 30-2003 For growing L929 cells
NCRC clone 929 (L929) ATCC CCL-1
Fixation/Permeabilization Kit BD Biosciences 554714 Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer. Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde
Glycine Biorad 161-0718
Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay Fisher Scientific PR-G1780 Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid
FAM-YVAD-FMK Immunocytochemistry Technologies 98
DMEM, high glucose, no glutamine Invitrogen 11960044
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red Invitrogen 31053028
Dulbecco's PBS, no calcium, no magnesium Invitrogen 14190144
Fetal Bovine Serum, qualified, US origin Invitrogen 26140079 Heat inactivated at 55°C for 50 min
Gentamicin Invitrogen 15750060
ProLong Gold Mounting Medium Invitrogen p36934 Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46
goat anti-mouse ALEXA555 Invitrogen A-21422
HEPES (Ultra Pure) Invitrogen 11344041
L-Glutamine Invitrogen 21051024
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
TO-PRO-3 Iodide Invitrogen T3605 far-red fluorescent nucleic acid stain
C57BL/6J mouse Jackson Laboratoy 000664
caspase-1/11-/- mouse Jackson Laboratory 016621
Leica SP8X Confocal Microscope Leica
Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re) List Biologicals 434
anti-ASC clone 2EI-7 Millipore-Sigma 04-417
beta-mercapto-ethanol Millipore-Sigma M6250-10ML
DMSO Millipore-Sigma D2650-5X10ML
EDTA Millipore-Sigma E5391
Spectramax M3 plate reader Molecular Devices 5000414

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jorgensen, I., Miao, E. A. Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens. Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).
  2. Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics. Nat Med. 21 (7), 677-687 (2015).
  3. Bergsbaken, T., Fink, S. L., Cookson, B. T. Pyroptosis: host cell death and inflammation. Nat Rev Microbiol. 7 (2), 99-109 (2009).
  4. Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
  5. Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cell Microbiol. 8 (11), 1812-1825 (2006).
  6. Bergsbaken, T., Fink, S. L., den Hartigh, A. B., Loomis, W. P., Cookson, B. T. Coordinated host responses during pyroptosis: caspase-1-dependent lysosome exocytosis and inflammatory cytokine maturation. J Immunol. 187 (5), 2748-2754 (2011).
  7. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  8. Sutterwala, F. S., Haasken, S., Cassel, S. L. Mechanism of NLRP3 inflammasome activation. Ann N Y Acad Sci. 1319, 82-95 (2014).
  9. Juliana, C., et al. Non-transcriptional priming and deubiquitination regulate NLRP3 inflammasome activation. J Biol Chem. 287 (43), 36617-36622 (2012).
  10. Py, B. F., Kim, M. S., Vakifahmetoglu-Norberg, H., Yuan, J. Deubiquitination of NLRP3 by BRCC3 critically regulates inflammasome activity. Mol Cell. 49 (2), 331-338 (2013).
  11. Song, N., et al. NLRP3 Phosphorylation Is an Essential Priming Event for Inflammasome Activation. Mol Cell. 68 (1), 185-197 (2017).
  12. Stutz, A., et al. NLRP3 inflammasome assembly is regulated by phosphorylation of the pyrin domain. J Exp Med. 214 (6), 1725-1736 (2017).
  13. Broz, P., Dixit, V. M. Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling. Nat Rev Immunol. 16 (7), 407-420 (2016).
  14. Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. J Biol Chem. 274 (48), 33835-33838 (1999).
  15. Yamamoto, M., et al. ASC is essential for LPS-induced activation of procaspase-1 independently of TLR-associated signal adaptor molecules. Genes Cells. 9 (11), 1055-1067 (2004).
  16. Miao, E. A., Rajan, J. V., Aderem, A. Caspase-1-induced pyroptotic cell death. Immunol Rev. 243 (1), 206-214 (2011).
  17. LaRock, C. N., Cookson, B. T. The Yersinia virulence effector YopM binds caspase-1 to arrest inflammasome assembly and processing. Cell Host Microbe. 12 (6), 799-805 (2012).
  18. Swanson, M. S., Isberg, R. R. Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum. Infect Immun. 63 (9), 3609-3620 (1995).
  19. Miller, S. I., Ernst, R. K., Bader, M. W. LPS, TLR4 and infectious disease diversity. Nat Rev Microbiol. 3 (1), 36-46 (2005).
  20. Sester, D. P., et al. A novel flow cytometric method to assess inflammasome formation. J Immunol. 194 (1), 455-462 (2015).
  21. Sester, D. P., et al. Assessment of Inflammasome Formation by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2016).
  22. DiPeso, L., Ji, D. X., Vance, R. E., Price, J. V. Cell death and cell lysis are separable events during pyroptosis. Cell Death Discov. , (2017).
  23. Russo, H. M., et al. Active Caspase-1 Induces Plasma Membrane Pores That Precede Pyroptotic Lysis and Are Blocked by Lanthanides. J Immunol. 197 (4), 1353-1367 (2016).
  24. Evavold, C. L., et al. The Pore-Forming Protein Gasdermin D Regulates Interleukin-1 Secretion from Living Macrophages. Immunity. , (2017).

Tags

Immunologi og infektion spørgsmålet 135 immunologi medfødt immunitet inflammasome caspase-1 ASC NLRP3 pyroptosis nigericin murint knoglemarv-afledte makrofager
Påvisning af Inflammasome aktivering og Pyroptotic celledød i Murine knoglemarv-afledte makrofager
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

den Hartigh, A. B., Fink, S. L.… More

den Hartigh, A. B., Fink, S. L. Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages. J. Vis. Exp. (135), e57463, doi:10.3791/57463 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter