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Immunology and Infection

Détection d’Activation Inflammasome et mort cellulaire de Pyroptotic dans les Macrophages dérivés de la moelle osseuse Murine

Published: May 21, 2018 doi: 10.3791/57463
Automatic Translation
1, 1
1Department of Laboratory Medicine, University of Washington

Summary

Nous décrivons la détection d’activation inflammasome NLRP3 sur base cellulaire à l’aide de la microscopie en fluorescence et coloration pour active caspase-1 et l’adaptateur, ASC. Un test de libération de lactate déshydrogénase est présenté afin de détecter la lyse pyroptotic sur une base de population. Ces techniques peuvent être adaptés afin d’étudier plusieurs aspects de la biologie inflammasome.

Abstract

Inflammasomes sont des plates-formes signalisation immunitaires innés qui sont nécessaires pour la réussite du contrôle de nombreux germes pathogènes, mais aussi promouvoir inflammatoires et maladies auto-inflammatoires. Inflammasomes sont activées par des récepteurs de reconnaissance modèle cytosolique, y compris les membres de la famille des récepteurs (NLR) comme clin de œil. Ces récepteurs oligomerize dès la détection des stimuli microbiennes ou associés aux dommages. Recrutement de la protéine adaptatrice ASC forme un complexe, inflammasome visible au microscope, qui active la caspase-1 à proximité induite par l’activation automatique. Suite à l’activation, caspase-1 Clive pro-IL-1β et pro-IL-18, conduisant à l’activation et la sécrétion de ces cytokines pro-inflammatoires. Caspase-1 intervient aussi dans la forme inflammatoire de la mort cellulaire appelée pyroptosis, qui comprend la perte de la lyse de l’intégrité et la pile à membrane. Caspase-1 Clive gasdermin D, libérant le fragment N-terminal qui forme des pores de la membrane plasmique, conduisant à la lyse osmotique.

In vitro, l’activation de la caspase-1 peut être déterminé par marquage des macrophages dérivés de la moelle osseuse avec la sonde de l’activité de la caspase-1 FAM-YVAD-FMK et par marquage des cellules avec des anticorps dirigés contre la protéine adaptatrice ASC. Cette technique permet l’identification d’inflammasome formation et l’activation de la caspase-1 dans des cellules individuelles à l’aide de la microscopie de fluorescence. Pyroptotic la mort cellulaire peut être détectée en mesurant la libération de lactate-déshydrogénase cytosolique dans le milieu. Cette procédure est simple, rentable et effectué dans un format de plaque à 96 puits, permettant l’adaptation pour le dépistage. Dans ce manuscrit, nous montrons que l’activation de l’inflammasome NLRP3 par nigéricine mène à la co-localisation de la protéine adaptatrice ASC et active caspase-1, menant à pyroptosis.

Introduction

L’inflammation induite par l’inflammasome est un élément essentiel de la défense contre les organismes pathogènes1, mais elle sous-tend également l’étiologie des nombreuses maladies2. La réponse inflammatoire à un large éventail d’infections est déclenchée par la détection cytosolique de profils moléculaires pathogènes associés (PAMPs) ou dommages associated molecular patterns (DAMPs). Récepteurs de reconnaissance de modèle (PRR), y compris les membres de la famille des récepteurs de type NOD (NLR), oligomerize sur la détection de ces PAMPs et DAMPs. Cela déclenche la formation d’un complexe de plusieurs protéine appelé l’inflammasome, qui contient de la PRR, la protéine adaptatrice associées à l’apoptose speck-protéine contenant un domaine de caspase-recrutement C-terminal (carte) (ASC) et la Pro-forme de Caspase-13,4. Ce complexe permet de proximité induite par l’activation automatique de la caspase-1. Caspase-1 active puis conduit à une série d’événements qui sont caractéristiques de la pyroptosis de voie de mort cellulaire inflammatoire. Ces événements incluent : le clivage et la libération des cytokines inflammatoires IL-1β et IL-18, exocytose lysosome avec libération du contenu lysosomial dans l’espace extracellulaire, condensation nucléaire et clivage gasdermin D. Le domaine N-terminal libéré de gasdermin D insère dans la membrane plasmique, formant des pores qui causent la rupture de la membrane plasmique et la libération des matières incendiaires, outre emportant une niche protectrice pour pathogène réplication5, 6 , 7.

Ici, nous nous concentrons sur l’inflammasome NLRP3 bien étudié. L’activation de l’inflammasome NLRP3 s’effectue par un processus de deux étapes8. La première étape de « l’amorçage » se produit grâce à la reconnaissance par les récepteurs Toll-like (TLR) d’un produit microbien. C’est répliquée en laboratoire en utilisant des LPS pour stimuler le TLR4. Cette stimulation augmente NLRP3 et pro-IL-1β, par le biais de signalisation NF-kB. D’amorçage en outre licenses NLRP3 grâce à des mécanismes non-transcription en incitant ses déubiquitination9,10 phosphorylation ou déphosphorylation des résidus spécifiques11,12.

Le deuxième signal d’activation NLRP3 semble impliquer des facteurs mitochondries, espèces réactives de l’oxygène, efflux de potassium et le calcium de signalisation, un processus unificateur pour activation NLRP3 demeure insaisissable8. NLRP3 activés oligomerizes grâce à des interactions entre ses domaines NACHT et recrute ASC via la liaison des domaines pyrine (PYD)13. Dans chaque cellule, ces complexes macromoléculaires forment un seul foyer visible au microscope. NCP a été initialement identifiée comme une protéine de 22 KDa qui forme un « grain » au cours de l’apoptose des cellules leucémiques humaines et nommée associées à l’apoptose speck-protéine contenant une carte14. Il a été déterminé plus tard que l’ASC recrute pro-caspase-1 par le biais de l’interaction de la carte de l’ASC avec la carte de la pro-caspase-1, formant l' inflammasome15.

Pas tous NLRs nécessitent la présence d’ASC d’induire l’activation de la caspase-1. Contrairement à NLRP3, NLRC4 et NLRP1b ont des domaines de carte et peuvent recruter directement de pro-caspase-1 via des interactions de carte-carte d’induire l’activation de la caspase-1. En l’absence d’ASC, caspase-1 active reste diffus dans le cytosol et ne forme pas un seul foyer. Cet actif diffuse caspase-1 est suffisante pour induire la mort des cellules pyroptotic, mais ne peut pas traiter les pro-IL-1β13,16.

Dans ce manuscrit, nous traiterons deux façons d’évaluer inflammasome activation. Le premier utilise l’activité fluorescente probe, FAM-YVAD-FMK, qui lie la famille caspase-1 des protéases. Cette famille comprend caspase-1, mais aussi souris caspase-11 et caspase-4 humain et caspase-5. À l’aide de macrophages de souris déficientes en caspase-1/11 dans toutes les expériences, la spécificité de cette sonde sera abordée. Cette méthode peut être combinée avec l’anticorps étiquetage des composants inflammasome, que nous décrirons également. Visualisation microscopique permet l’identification des cellules individuelles contenant des actifs caspase-1 et CSA oligomerized. En utilisant cette méthode, les chercheurs seront en mesure de déterminer où dans la cascade de formation inflammasome leurs manipulations de la cellule hôte ou de l’organisme pathogène à l’étude ont un effet. Par exemple, on peut distinguer une intervention donnée empêche le recrutement de l’ASC à la NLRP3 complexes ou cible le recrutement et l’activation de la caspase-117. Examen des résultats de l’activation de la caspase-1 comme la sécrétion d’IL-1β ne serait pas en mesure de faire la distinction entre ces deux possibilités. En outre, la sécrétion d’IL-1β pourrait être modifiée sans altérer les cellules permet d’activer la caspase-1 et subir de mort cellulaire pyroptotic16.

La deuxième méthode permet de mesurer la libération de la lactate déshydrogénase (LDH) dans la cellule surnageante, qui se produit lors de la lyse pyroptotic macrophage après l’activation de la caspase-1 tel que décrit ci-dessus. Cette deuxième méthode est une approche axée sur la population, la libération de LDH dans l’ensemble du bien est mesurée. Cette approche simple permet l’analyse rapide (30 min de temps d’incubation) d’échantillons pour déterminer s’il y a la mort cellulaire médiée par caspase-1 et peut être réalisée dans un format de plaque à 96 puits.

Ces méthodes sont complémentaires, chacune avec différents avantages et les deux se prêtent facilement à des modifications. Par exemple, traitement des macrophages avec ciblée de faible poids moléculaire des composés avant inflammasome stimulation permet d’enquêter sur le rôle de certain protéines peuvent avoir sur le contrôle des réactions inflammatoires.

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Protocol

Toutes les procédures d’animaux ont été approuvés et effectuées en vertu de l’Université de Washington animalier institutionnel et Comité de l’utilisation de lignes directrices.

1. récolte de moelle osseuse

  1. Retirer le fémur et le tibia de souris de façon aseptique et nettoyer les os à l’aide d’instruments stériles. Les os nettoyés au moyen d’Eagle modifié Dulbecco (DMEM) + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL, L-glutamine + 0,05 mM 2-mercaptoéthanol + sulfate de gentamicine 50 mg/mL + 10 000 U/mL de pénicilline/streptomycine + 10 % sérum de veau fœtal (SVF, DMEM-10 complète) et incuber le le tube sur la glace pendant 15 minutes.
  2. Retirez les joints à rotule proximal et distal à l’aide de ciseaux. Insérer une aiguille 25 G attachée à une seringue de 10 mL remplie de milieu dans le creux de l’OS. Débusquer la moelle osseuse à l’aide de DMEM-10 complet. Resuspendre tout amas en pipettant également, la moyenne monte et descend doucement.
  3. Centrifuger les cellules pendant 10 min à 300 x g et compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre. À ce stade, soit geler les cellules en utilisant 90 % BF + 10 % de diméthyl sulfoxide (DMSO) ou les cellules dans une boîte de Pétri pour différencier les macrophages à l’aide de support L929 conditionné (étape 2.1) de 15 cm de la plaque.

2. différenciation des dérivés de la moelle osseuse

  1. En utilisant le moyen de différenciation préchauffé (21 mL de DMEM-10 complète et 9 mL de milieu de cellulaire conditionné L929 tel que décrit par Swanson et al. ( 18), mettre des cellules de moelle osseuse dans un 15 cm non-culture de tissus traités Pétri (1,2 à 1,5 x 107 cellules). Incuber les plaques à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 7 jours. Ajouter 30 mL de milieu de différenciation supplémentaire à la plaque au jour 3 ou 4.
    Remarque : Il est important de ne pas utiliser des plaques de culture de tissus traitée, comme les macrophages seront difficiles à détacher et à récolter.
  2. Pour collecter les macrophages, laver la plaque avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et ajouter 20 mL de PBS froid + de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 1 mM. Incuber la plaque à 4 ° C pendant 10 min. récolte des cellules en pipettant également, le PBS + EDTA sur les cellules et laver la plaque avec 10 mL de PBS. Combiner les deux lavages dans deux tubes coniques 15 mL.
  3. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 10 min et remettre en suspension les cellules dans 10 mL de phénol rouge DMEM libre + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL, L-glutamine + 0,05 mM 2-mercaptoéthanol + 5 % SVF (DMEM-5) et compter les cellules en utilisant un hémocytomètre ou un compteur Coulter. Garder les cellules sur la glace lors du comptage.
  4. Les macrophages en culture de tissu enduite plaques à 2 x 105 cellules/mL de graines. Pour des expériences de microscopie, graines 1 mL de cellules sur des lamelles en 24 plaques bien. Pour les tests de libération LDH, graines 100 µL de cellules dans une plaque 96 puits. Pour le dosage LDH, graines 9 puits (3 puits non traités, 3 puits avec des contrôles de la lyse de 100 % et 3 puits pour le stimulus expérimental).
  5. Centrifuger la plaque 96 puits pendant 5 min à 300 g pour s’assurer que les cellules sont également distribués à travers le puits.
  6. Incuber la plaque pendant une nuit à 37 ° C + 5 % CO2 avant de commencer le processus d’amorçage.

3. amorçage

  1. Remplacer le support avec un milieu frais (DMEM-5) contenant 100 ng/mL LPS (500 μl du 24 bien sur plaque ou 50 μL de la 96 bien sur plaque).
    Remarque : Il existe une variété de variations structurales en LPS, qui affectent la capacité de stimuler d’amorçage induite par le TLR419. LPS de Salmonella minnesota R595 (Re) est disponible auprès de fournisseurs multiples et est recommandé.
  2. Incuber les plaques pendant 3 h à 37 ° C et 5 % de CO2.

4. activation de l’Inflammasome NLRP3 avec nigéricine et l’étiquetage avec FAM-YVAD-FMK

  1. Enlever le support et le remplacer par 290 μL de DMEM-5 contenant 5 μM nigéricine et glycine de 5 mM. Glycine est ajouté pour réduire la quantité de la lyse cellulaire qui se produit pendant l’activation de la caspase-15. Incuber pendant 60 min à 37 ° C et 5 % de CO2. Macrophages déficientes tant de type sauvage et caspase-1 permet de s’assurer que l’étiquetage observée est spécifique pour la caspase-1.
  2. Durant les dernières 45 min, ajouter 10 μL de 30 x FAM-YVAD-FMK, préparée selon les instructions du fabricant.
  3. Après 60 min, retirez le support et laver les cellules trois fois de 5 min chacun avec 1 mL de PBS froid.
  4. Ajouter 250 μL de paraformaldéhyde à 2 % à chaque puits et incuber sur glace recouvert de papier aluminium pendant 30 min.
  5. Durant les 5 dernières min, ajouter 4 μL de tache d’acide nucléique fluorescent rouge sombre 0,2 mM pour étiqueter les noyaux. 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ou autres colorants peuvent également servir à étiquette ADN.
  6. Laver les cellules trois fois avec 1 mL de PBS froide et monter les lamelles sur lames de microscope utilisant le milieu de montage fondu contre 7 μL. Durcir le milieu de montage pendant la nuit avant de sceller la lamelle à la lame de microscope à l’aide de vernis à ongles.
  7. Les macrophages d’images en microscopie confocale. Ex / Em pour FAM-YVAD-FMK est 492/520nm et 642/661 pour une coloration rouge sombre fluorescents des acides nucléiques. Assurez-vous de mettre en place le microscope telles que les cellules non traitées ne présentent pas de n’importe quel fond de coloration dans le chenal 488. Sinon, la coloration de fond FAM-YVAD-FMK sera détecté et non réel actif caspase-1.
    Remarque : Installation de Microscope est décrite à l’article 6.

5. anticorps

Remarque : Afin de marquer les cellules avec des anticorps pour détecter les ASC, de graines, amorcer et exposer les cellules à nigéricine identique à la section précédente. Le traitement par la suite se présente comme suit :

  1. Laver les cellules trois fois de 5 min chacun avec 1 mL de PBS froid. Ajouter 250 μL de solution de fixation et permeabilization. Incuber les cellules sur la glace et couvert pendant 30 min.
  2. Laver les macrophages trois fois de 5 min chacun avec 1 mL de tampon de lavage.
  3. Ajouter 250 μL d’anticorps primaire contre ASC dilué à 1/500 dans le tampon de lavage et incuber pendant 1 heure sur la glace. Inclure une lamelle couvre-objet qui n’a pas reçu tout anticorps primaire, mais ne recevra l’image secondaire. Cette lamelle serviront lors de la configuration de microscope pour définir le décalage correct.
  4. Laver les cellules trois fois pour 5 min chacun avec 1 mL de tampon de lavage.
  5. Ajouter 250 μL d’anticorps secondaire (colorant fluorescent conjugués chèvre-anti-souris) dilué à 1/500 dans le tampon de lavage et incuber pendant 1 heure sur la glace. Ajouter 4 μL de tache d’acide nucléique fluorescent rouge sombre 0,2 mM pour les 5 dernières min de cette incubation aux noyaux de l’étiquette.
  6. Laver les cellules 3 x 1 ml de tampon de lavage à froid et les lamelles sur microscope slides utilisant 7 μL anti-fondu Montage support de montage. Durcir le milieu de montage pendant la nuit avant de sceller la lamelle à la lame de microscope à l’aide de vernis à ongles transparent.
  7. Macrophages image par microscopie confocale. Ex / Em pour l’anticorps secondaire est 555/580 nm et 642/661 pour l’acide nucléique fluorescent rouge sombre tachent (comme décrit ci-dessous).
    Remarque : Étiquetage avec FAM-YVAD-FMK et marquage en anticorps peut être combiné pour montrer la co-localisation de caspase-1 active et ASC. Pour ce faire, suivez les conditions pour l’étiquetage de FAM-YVAD-FMK et puis passer à l’anticorps étiquetage protocole pour un traitement ultérieur.

6. l’imagerie des Macrophages marqués par microscopie confocale

Remarque : Les cellules colorées peuvent être consultés après que les lamelles ont été autorisés à les guérir du jour au lendemain et ont été scellés à la lame de microscope avec vernis à ongles. Ici, l’imagerie à l’aide d’un microscope confocal est décrite. Les cellules peuvent également être consultés en microscopie par fluorescence standard.

  1. Placez le chariot avec les cellules témoins non traitées sur la platine du microscope et concentrer le microscope sur les cellules.
  2. En utilisant le microscope Look Up Table (LUT) paramètres, régler le décalage telles qu’il n’y a aucune coloration positive de FAM-YVAD-FMK dans les cellules non traitées. Ce processus peut également être effectué utilisant des macrophages déficients caspase-1.
    Remarque : Le décalage doit être adaptée pour chaque canal utilisé dans l’expérience, mais l’offset correcte est plus critique pour le canal FAM-YVAD-FMK et canaux d’immunofluorescence. Le décalage de la chaîne d’ADN est moins critique. Une fois le décalage a été défini, ne modifiez pas ce paramètre pour le reste de l’expérience.
  3. Passer la lame à l’échantillon nigéricine traité. Trouver un champ qui contient les deux cellules qui sont positifs et négatifs pour la coloration de FAM-YVAD-FMK. Ajuster le plan d’imagerie du canal FAM-YVAD-FMK au plan qui a la plus haute intensité de coloration positive. Il s’agit normalement de l’avion où le centre de la focus inflammasome est imagé.
  4. Ajuster le gain tel que les foyers sont visibles dans les cellules qui contiennent des noyaux condensés. Après le réglage de gain et décalage, conservez ces paramètres pour le reste de la séance d’imagerie.
    Remarque : Un moyen simple de déterminer si une cellule est pyroptotic est en regardant la morphologie nucléaire. Cellules avec active caspase-1 ont arrondi et noyaux condensés, tandis que les nucléoles sont visibles dans les cellules sans activation de la caspase-1 et la morphologie nucléaire est semblable à celle des cellules non traitées.
  5. Collecter les images des 5 champs choisis au hasard à 100 X de grossissement total. Cela entraînera normalement environ 40 cellules par image. Répétez ce processus pour chaque échantillon.
  6. Compter le nombre de cellules dans chaque image à l’aide de logiciels d’analyse image. Puis comptez le nombre de cellules qui ont une coloration positive FAM-YVAD-FMK. Représentent le niveau de l’activation de la caspase-1 comme le pourcentage de cellules positives FAM-YVAD-FMK.

7. test de libération LDH

Remarque : Pour le test de libération LDH, semences et premier les cellules tel que décrit dans la section précédente, sauf utilisent une plaque 96 puits. Ne retirez pas le support après l’amorçage.

  1. Ajouter 50 μL de DMEM-5 contenant 10 μM nigéricine aux puits expérimentales et 50 μL DMEM-5 dans les puits de contrôle de la lyse spontanées et 100 %. N’ajoutez pas de glycine dans cette expérience, puisque l’objectif est de mesurer la lyse cellulaire. Incuber pendant 60 min à 37 ° C et 5 % de CO2.
  2. Après 30 min, ajouter 10 μL de tampon de lyse x 10 dans les puits de contrôle 100 % lyse et ajouter 10 μL de DMEM-5 dans les autres puits. Durant cette incubation, enlever 1 flacon de mélange de substrat (1,5 mL de substrat lyophilisé) et 1 partie aliquote de tampon (~ 12 mL) du congélateur et laissez-les décongeler protégée de la lumière à température ambiante.
    Remarque : Le mélange de substrat contient un sel de tétrazolium (iodonitro-tétrazolium violet), qui se transforme en un produit de formazan rouge.
  3. Après l’incubation de 60 min total, centrifuger la plaque pendant 5 min à 500 x g à 10 ° C. Transférer 50 μL de surnageant dans une plaque de transparent à fond plat. Pendant ce temps, ajouter 12 mL de tampon dans le flacon de mélange de substrat et incuber à température ambiante pendant 5 min avant de l’utiliser.
  4. Ajouter 50 μL de substrat dans chaque puits et incuber pendant 30 minutes dans l’obscurité. Inclure des puits seuls moyens pour les valeurs vides. Vérifier la plaque après 15 min pour s’assurer que le signal ne dépassera pas la limite de détection du lecteur de plaque.
  5. Après 30 min, ajouter 50 μL de solution d’arrêt (1 M d’acide acétique) et mesurer OD490 en utilisant un lecteur de plaque.
  6. Calculer le pourcentage de la lyse cellulaire à l’aide de la formule suivante :
    Cytotoxique % = ((Experimental-Spontaneous) / (Maximum-spontanée)) × 100
    Expérimental : cellules nigéricine traité ; spontanée : n’est pas traité de cellules ; maximale : cellules exposées au tampon de lyse

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Representative Results

Pour détecter l’activation de la caspase-1 suite à l’exposition aux nigéricine, les cellules ont été traitées comme décrit dans la section protocole. Nous avons combiné les FAM-YVAD-FMK et ASC anticorps étiquetage afin de montrer que NCP et caspase-1 active co localiser après l’activation induite par NLRP3 inflammasome. Figure 1 a montre que wild type macrophages exposés à 5 μM nigéricine ayant formation d’un foyer de l’ASC dans la région périnucléaire. Ces foyers contiennent également active caspase-1 comme en témoigne la co-localisation des ASC avec FAM-YVAD-FMK. Les cellules qui sont positifs pour l’actif caspase-1 ont condensation nucléaire montrant que ces cellules subissent des pyroptosis. Figure 1 b montre que, tandis que les macrophages de souris déficientes en caspase-1/11 ont-ils la formation d’un foyer de l’ASC, ils n’ont pas tout actif caspase-1 associée à cet accent comme en témoigne l’absence de coloration de FAM-YVAD-FMK. Les noyaux de ces cellules ne sont pas condensées, indiquant qu’il n’y a aucun pyroptotic décès survenus de cellules. Des images ont été prises à l’aide d’un microscope confocal à balayage avec un 63 X objectif à immersion d’huile. Images ont été enregistrées sous forme de fichiers TIFF sans tout traitement ultérieur.

Afin de déterminer le niveau de mort cellulaire qui est associée à une exposition à nigéricine, nous avons effectué un test de libération LDH sur le surnageant de culture. La figure 2 montre que wild type macrophages subissent une mort cellulaire après l’exposition au nigéricine. En revanche, macrophages déficientes en caspase-1 ne libèrent pas de LDH dans le surnageant de la cellule, ce qui indique que les cellules sont intacts.

Figure 1
Figure 1 : FAM-YVAD-FMK et anti-ASC étiquetage. (A) type de sauvage (WT) et les macrophages de caspase-1/11 déficient (c1/11- / -) (B) ont été exposés à 5 μM nigéricine pendant 1 h et analysées pour active caspase-1 par microscopie confocale utilisant FAM-YVAD-FMK pour détecter les actifs caspase-1 et anti-ASC Anticorps secondaires primaires et chèvre-anti-souris pour détecter l’ASC concentrent la formation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : résultats de titrage pour le communiqué LDH. Type sauvage et caspase-1/11 macrophages déficientes ont été exposés à 5 μM nigéricine pendant 1 h et cellule surnageant a été analysé pour la présence de LDH. Les données sont moyen ± SD de trois répétitions. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Dans ce manuscrit, nous présentons deux techniques pour examiner l’inflammasome activation et la conséquence de l’activation de la caspase-1 après stimulation NLRP3 dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse murines. La première technique permet au chercheur de déterminer le niveau d’activation de la caspase-1 sur une base cellulaire à l’aide de la journaliste fluorescent FAM-YVAD-FMK. Ce journaliste est très spécifique pour la famille de caspase-1 d’enzymes, de liaison, comme en témoigne l’absence de coloration dans les macrophages déficients caspase-1/11. Spécificité a également été montrée par LaRock et al. dans leur manuscrit décrivant le rôle de la protéine de Yersinia YopM lors de l’activation de la caspase-1. Dans son manuscrit, ils montrent que des foyers de FAM-YVAD-FMK chevauche des foyers qui ont été marquées avec des anticorps dirigés contre caspase-117.

Comme c’est le cas avec toute expérience, il y a certaines étapes critiques qui doivent être suivies afin d’éliminer les faux positifs. Tout d’abord, il est impératif d’utiliser des macrophages déficientes tant de type sauvage et caspase-1/11. Grâce à ces deux types de cellules, conditions qui mènent à une coloration non spécifiques peuvent être exclues de l’analyse. Deuxièmement, comme avec n’importe quelle sonde anticorps ou activité étiquetage dosage, il est important de laver soigneusement les cellules après coloration avec FAM-YVAD-FMK. En utilisant trois lavages de 5 min, le niveau du signal de fond est grandement réduit. Une troisième étape critique se produit pendant l’installation de la microscopie confocale. Ici, il est important que non traitées des cellules marquées avec la FAM-YVAD-FMK sont utilisés pour définir le décalage du microscope confocal de telle sorte qu’aucune coloration cytoplasmique positive n’est observée dans les cellules non traitées. Lorsque ces étapes sont suivies, cette technique est un outil utile pour évaluer l’activation de la caspase-1 sur une base cellulaire.

Ce protocole peut être modifié en fonction des besoins des chercheurs. Par exemple, les cellules peuvent être traitées avec des composés de faible poids moléculaire à plusieurs étapes durant tout le processus. Cela permettrait l’identification des voies qui modulent l’oligomérisation de la NLR, le recrutement de NCP ou pro-caspase-1, ou l’activation de la caspase-1 lui-même. Les modifications au présent protocole doivent être tels qu’ils n’activent pas caspase-1 par lui-même. Si cela se produit, une courbe dose-réponse de la drogue en question est nécessaire. Même si nous nous sommes concentrés sur l’activation de l’inflammasome NLRP3, ce protocole permet également d’examiner inflammasomes déclenchée par autre SDRP. Une autre modification que nous avons inclus dans ce manuscrit est la combinaison de FAM-YVAD-FMK coloration avec anticorps étiquetage des composants inflammasome. Nous montrons qu’il n’y a co-localisation de l’adaptateur inflammasome ASC avec active caspase-1. Une limitation de cette méthode comme décrit, est que cela nécessite un accès à un microscope confocal. Toutefois, une stratégie connexe pour détecter la formation focus ASC par cytométrie en flux a été rapporté20,21.

La deuxième technique, que nous avons discuté permet une détection rapide de la lyse cellulaire à l’aide d’un test de libération LDH. Il est important de noter que libération de LDH indique la perte de la lyse de l’intégrité et la cellule membrane plasmique, qui se produit au cours de nombreuses autres formes de la mort cellulaire et n’est pas spécifique à pyroptosis. Cependant, l’utilisation des cellules déficientes caspase-1 peut identifier la lyse cellulaire de caspase-1-dependent, une caractéristique déterminante de la pyroptosis.

Une étape cruciale dans ce protocole (en particulier lors de l’utilisation d’un agent infectieux) est de Centrifuger la plaque après l’ensemencement les cellules dans une plaque 96 puits. Centrifugation de la plaque permet une répartition égale des macrophages sur toute la surface du puits. Avec une distribution égale, chaque macrophage est exposé avec le même nombre de bactéries. Sans centrifugation, l’effet de ménisque du liquide dans le puits conduira à macrophages plus s’accumuler sur le bord du puits. Cela conduirait à plus faible que prévue multiplicité d’infection (MOI) près du mur bien et plus élevé que prévu de MOI dans le centre du puits.

Un inconvénient potentiel d’obtenir un communiqué LDH est qu’il mesure sur une échelle de la population et à un moment unique par dosage de la lyse. Une autre approche consiste à quantifier l’absorption des colorants imperméants cellulaire au microscope, qui identifie la perte d’intégrité de la membrane sur une base de cellule unique. Combiné avec des plates-formes d’imagerie de cellules vivantes, cette approche peut également fournir une évaluation temporelle de pyroptosis22. Petit fluorescentes de liaison à l’ADN colorants comme l’iodure de propidium ou le bromure d’éthidium peut passer à travers les pores gasdermin D, lier des acides nucléiques cellulaires et réagissent en5,22,23. Formation des pores et l’absorption de ces colorants petits précède temporellement lyse de la cellule terminale. Lyse permet l’absorption des colorants plus et perte de grosses protéines cellulaires comme la LDH. L’utilisation de la glycine peut découpler expérimentalement la formation de pores de lyse, glycine ne bloque pas la formation de pores induite par le D gasdermin, absorption de teinture petit ou sécrétion d’IL-1β, mais la glycine n’empêche la lyse rapide et LDH version5,22 , 23 , 24. nous suggérons notamment glycine dans les expériences de coloration de FAM-YAVD-FMK pour prévenir une perte complète de l’intégrité membranaire, mais la glycine doit être omis lors de la mesure de la libération de LDH pyroptotic.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer

Acknowledgments

Microscopie de tous a été fait au W. M. Keck microscopie Centre avec le soutien de Nathaniel Peters et avec le soutien du prix NIH S10OD016240. S.L.F. est pris en charge par les NIH K08AI119142 et R21AI130281. Nous remercions le Dr Richard Flavell et Dr Brad Cookson pour les souris déficientes en caspase-1/11 et Dr. Brad Cookson pour le partage des équipements et des installations de laboratoire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E-MEM ATCC 30-2003 For growing L929 cells
NCRC clone 929 (L929) ATCC CCL-1
Fixation/Permeabilization Kit BD Biosciences 554714 Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer. Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde
Glycine Biorad 161-0718
Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay Fisher Scientific PR-G1780 Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid
FAM-YVAD-FMK Immunocytochemistry Technologies 98
DMEM, high glucose, no glutamine Invitrogen 11960044
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red Invitrogen 31053028
Dulbecco's PBS, no calcium, no magnesium Invitrogen 14190144
Fetal Bovine Serum, qualified, US origin Invitrogen 26140079 Heat inactivated at 55°C for 50 min
Gentamicin Invitrogen 15750060
ProLong Gold Mounting Medium Invitrogen p36934 Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46
goat anti-mouse ALEXA555 Invitrogen A-21422
HEPES (Ultra Pure) Invitrogen 11344041
L-Glutamine Invitrogen 21051024
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
TO-PRO-3 Iodide Invitrogen T3605 far-red fluorescent nucleic acid stain
C57BL/6J mouse Jackson Laboratoy 000664
caspase-1/11-/- mouse Jackson Laboratory 016621
Leica SP8X Confocal Microscope Leica
Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re) List Biologicals 434
anti-ASC clone 2EI-7 Millipore-Sigma 04-417
beta-mercapto-ethanol Millipore-Sigma M6250-10ML
DMSO Millipore-Sigma D2650-5X10ML
EDTA Millipore-Sigma E5391
Spectramax M3 plate reader Molecular Devices 5000414

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References

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Immunologie et Infection numéro 135 immunologie immunité innée inflammasome caspase-1 ASC NLRP3 pyroptosis nigéricine macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris
Détection d’Activation Inflammasome et mort cellulaire de Pyroptotic dans les Macrophages dérivés de la moelle osseuse Murine
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den Hartigh, A. B., Fink, S. L.… More

den Hartigh, A. B., Fink, S. L. Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages. J. Vis. Exp. (135), e57463, doi:10.3791/57463 (2018).

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