Summary
אנו מתארים את הגילוי של הפעלת inflammasome NLRP3 על בסיס הסלולר באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, צביעת עבור קספאז פעיל-1 ואת המתאם, עולה. Assay שחרורו לקטט דהידרוגנאז מוצג כדי לזהות פירוק pyroptotic על בסיס האוכלוסייה. טכניקות אלו ניתן להתאים ללמוד היבטים רבים של ביולוגיה inflammasome.
Abstract
Inflammasomes הם פלטפורמות איתות המערכת החיסונית מולדת אשר נדרשים עבור הפקד מוצלחת של אורגניזמים פתוגניים רבים, אלא גם לקדם דלקתיות ומחלות autoinflammatory. Inflammasomes מופעלים על ידי רצפטורים זיהוי דפוס cytosolic, כולל בני משפחת קולטן (NLR) כמו במנוד ראש. רצפטורים אלו oligomerize על הגילוי של גירויים מיקרוביאלי או נזק-הקשורים. גיוס עוקבות של החלבון מתאם ASC טפסים מורכבים, inflammasome ברמה המיקרוסקופית הגלויים שמפעיל קספאז-1 דרך הפעלה אוטומטית קרבה-induced. לאחר ההפעלה, קספאז-1 cleaves pro-IL-1β ו- pro-IL-18, שמוביל ההפעלה ואת הפרשת ציטוקינים פרו-דלקתיים אלה. קספאז-1 שמתווכת גם הצורה דלקתיות של מוות של תאים הנקרא pyroptosis, אשר כולל האובדן של קרום התא של תקינות פירוק. קספאז-1 cleaves gasdermin D, שחרור השבר N-מסוף המהווה קרום פלזמה נקבוביות, שמוביל osmotic פירוק.
חוץ גופית בתוך, ההפעלה של קספאז-1 יכול להיקבע על ידי תיוג מקרופאגים הנגזרות מח עצם עם החללית קספאז-1 פעילות FAM-YVAD-FMK ועל ידי תיוג התאים עם נוגדנים נגד החלבון מתאם ASC. טכניקה זו מאפשרת זיהוי inflammasome גיבוש והפעלה קספאז-1 בתאים בודדים באמצעות מיקרוסקופ זריחה. מוות של תאים Pyroptotic ניתן להבחין באמצעות מדידת שחרורו של לקטט דהידרוגנאז cytosolic לתוך האמצעי. ההליך זה פשוט, חסכוני, שבוצעו בתבנית צלחת 96-ובכן, ומאפשר הסתגלות להקרנה. כתב יד זה, אנו מראים כי הפעלת inflammasome NLRP3 על ידי nigericin מוביל לוקליזציה שיתוף של מתאם חלבונים ASC ו קספאז פעיל-1, המוביל pyroptosis.
Introduction
דלקת בתיווך Inflammasome הוא מרכיב קריטי של ההגנה נגד אורגניזמים פתוגניים1, אך גם ביסוד האטיולוגיה של מחלות רבות2. התגובה דלקתית למגוון רחב של זיהומים המופעלת על-ידי זיהוי cytosolic של פתוגן הקשורים דפוסי מולקולרית (PAMPs) או נזקים הקשורים דפוסי מולקולרית (DAMPs). דפוס זיהוי קולטנים (PRR), כולל בני משפחת במנוד ראש דמוי קולטן (NLR), oligomerize על הגילוי של אלה PAMPs ו- DAMPs. פעולה זו מפעילה את היווצרות קומפלקס חלבונים מרובה כינה את inflammasome, אשר מכיל את PRR, החלבון מתאם אפופטוזיס-הקשורים כמו גרגר חלבון המכיל תחום גיוס קספאז C-מסוף (כרטיס) (ASC), פרו-בצורת קספאז-1-3,4. מתחם זה מאפשר הפעלה אוטומטית הנוצרות על-ידי קרבה של קספאז-1. קספאז פעיל-1 ואז מוביל ערכה של אירועים האופייניים pyroptosis מסלול מוות תאים דלקתיים. אירועים אלו כוללים: המחשוף ושחרור של ציטוקינים דלקתיים IL-1β ו- IL-18, ליזוזום אקסוציטוזה עם שחרורו של תוכן lysosomal לתוך חלל חוץ-תאית, גרעיני התעבות, gasdermin D המחשוף. תחום N-מסוף המשוחררים של gasdermin D מוסיף לתוך קרום פלזמה, ויוצרים את הנקבוביות לגרום קרע קרום פלזמה ושחרור של תוכן דלקתיות, בנוסף לוקחת משרה מגן על הפתוגן שכפול5, 6 , 7.
כאן, אנו מתמקדים inflammasome למד היטב NLRP3. הפעלת inflammasome NLRP3 מתרחשת דרך תהליך בן שני שלבים8. הצעד הראשון "לקרקע" מתרחשת דרך ההכרה על ידי רצפטורים כמו אגרה (TLR) של מוצר מיקרוביאלי. זה משוכפלת בהגדרת מעבדה באמצעות LPS לעורר TLR4. זה גירוי upregulates NLRP3, פרו-IL-1β באמצעות איתות NF-kB. הטרמה בנוסף רישיונות NLRP3 באמצעות מנגנונים תעתיק על ידי גרימת deubiquitination9,10 , זרחון או dephosphorylation של שאריות ספציפי11,12שלה.
האות השנייה עבור הפעלת NLRP3 נחשב לערב גורמים מיטוכונדריאלי, מינים חמצן תגובתי, בזרימת אשלגן וסידן איתות, למרות מנגנון מגבשת עבור הפעלת NLRP3 נותרת חמקמקה8. NLRP3 שהופעל oligomerizes במהלך האינטראקציות בין תחומים הלילה שלה, ומגייסת ASC באמצעות קשירה של תחומים pyrin (לעונשי)13. בכל תא, קומפלקסים macromolecular אלה יוצרות מוקד ברמה המיקרוסקופית גלוי יחיד. ASC זוהה במקור 22 KDa חלבון המהווה "כתם" במהלך אפופטוזיס של תאי סרטן אנושיים, וחלבון בשם אפופטוזיס-הקשורים כמו גרגר המכילים כרטיס14. מאוחר יותר נקבע כי ASC מגייס pro-קספאז-1 דרך האינטראקציה של הכרטיס של שמ ת עם הכרטיס של pro-קספאז-1, ויוצרים את inflammasome15.
לא כל NLRs דורשים את הנוכחות של שמ ת לזירוז ההפעלה קספאז-1. בניגוד NLRP3, NLRC4 ו- NLRP1b יש כרטיס תחומים, ישירות נגייס pro-קספאז-1 באמצעות כרטיס-כרטיס אינטראקציות לזירוז ההפעלה קספאז-1. בהיעדרו של שמ ת, קספאז פעיל-1 נשאר מפוזר ברחבי ציטוזול ו אינו הטופס מוקד יחיד. זה ' מאטום לשקוף ' פעיל קספאז-1 מספיק כדי לגרום מוות של תאים pyroptotic, אך אינו יכול לעבד pro-IL-1β13,16.
כתב יד זה, נדון בשתי דרכים כדי להעריך את הפעלת inflammasome. הראשון משתמש הפעילות פלורסנט בדיקה, FAM-YVAD-FMK, אשר נקשר משפחת קספאז-1 של פרוטאזות. משפחה זו כוללת קספאז-1, אבל גם העכבר קספאז-11 ו קספאז אנושי-4 וקספאז-5. באמצעות מקרופאגים של עכברים לקוי קספאז-1/11 כל ניסויים, יטופלו יחודיות של המכשיר הזה. בשיטה זו ניתן לשלב עם נוגדן תיוג של רכיבי inflammasome, אשר גם נתאר. ויזואליזציה מיקרוסקופיים מאפשר הזיהוי של תאים בודדים המכיל קספאז פעיל-1 ועולה oligomerized. באמצעות שיטה זו, חוקרים יוכלו לקבוע היכן המפל היווצרות inflammasome שלהם מניפולציות של התא המארח או האורגניזם פתוגניים שנבחנה יש אפקט. לדוגמה, שאפשר להבחין בין אם התערבות נתון מונע הגיוס של שמ ת NLRP3 מורכבים או מטרות את העוקבים גיוס והפעלה של קספאז-117. בחינת תוצאות של קספאז-1 הפעלת כגון הפרשת IL-1β לא יוכל להבחין בין שתי אפשרויות אלה. כמו כן, ההפרשה של IL-1β יכול להשתנות מבלי לשנות את התאים היכולת להפעיל את קספאז-1 ומבצעת pyroptotic תא מוות16.
השיטה השנייה מודד את שחרורו של לקטט דהידרוגנאז (LDH) לתוך התא supernatant, אשר מתרחש במהלך פירוק macrophage pyroptotic בעקבות הפעלת קספאז-1 כפי שתואר לעיל. שיטה שנייה זו היא גישה מבוסס-אוכלוסייה כמו שחרורו של LDH בכל רחבי טוב נמדד. גישה פשוטה זו מאפשרת לניתוח מהיר (30 דקות של זמן הדגירה) של דוגמאות כדי לקבוע אם יש מוות של תאים קספאז 1-בתיווך, יכול להתבצע בתבנית 96-ובכן צלחת.
שיטות אלה הם משלימים, כל אחת עם יתרונות שונים, ושניהם נוטה בקלות שינויים. לדוגמה, טיפול מקרופאג עם תרכובות יישוב משקל מולקולרי קטן לפני inflammasome גירוי יכול לשמש כדי לחקור את תפקיד מסוים חלבונים שיש על השליטה תגובות דלקתיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים היו שאושרו, שנערך תחת אוניברסיטת וושינגטון אכפת חיה המוסדית והוועדה שימוש בהנחיות.
1. הקציר של מח העצם
- גילוח ורחיצה כירורגית הסר את עצם הירך ואת שוקה עכבר ולנקות את העצמות באמצעות מכשירים סטריליים. למקם את העצמות נקי Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) + 5 מ מ HEPES + 0.2 מ"ג/מ"ל-גלוטמין + 0.05 מ"מ מרקפטואתנול + 50 מ"ג/מ"ל גנטמיצין סולפט + 10,000 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין + 10% סרום שור עוברית (FBS, DMEM-10 שלמה), דגירה צינור על קרח למשך 15 דקות.
- הסר את המפרקים לקרע, הכדור באמצעות מספריים. הכנס מחט 25 גרם המצורפת מזרק 10 מ"ל מלא בינוני לחלל של העצמות. לשטוף את מח העצם באמצעות DMEM-10 שלמה. Resuspend גושים כלשהם על-ידי pipetting של המדיום למעלה ולמטה בעדינות.
- Centrifuge התאים 10 דקות ב 300 x g, לספור את מספר תאים באמצעות של hemocytometer. בשלב זה, או להקפיא את התאים באמצעות 90% FBS + 10% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) או צלחת התאים 15 ס מ פטרי להבדיל מקרופאגים באמצעות L929 ממוזגים בינוני (שלב 2.1).
2. בידול של מקרופאגים הנגזרות מח עצם
- באמצעות בידול מראש ומחוממת בינוני (mL 21 של DMEM-10 שלמה ו 9 מ של L929 תאים ממוזגים בינוני כפי שתואר על ידי סוונסון. et al. 18), להכניס תאים במח העצם 15 ס מ ללא-מיקרוביולוגיות מטופלים פטרי (1.2-1.5 x 107 תאים). תקופת דגירה לצלחת-CO 37 ° C ו-5%2 של 7 ימים. להוסיף של 30 מ ל נוספים של בידול בינוני לצלחת בכל יום 3 או 4.
הערה: חשוב לא להשתמש תרביות רקמה מטופלים צלחות, כמו מקרופאגים יהיה קשה לנתק ולקצור. - כדי לאסוף את המקרופאגים, לשטוף את הצלחת בתמיסת באגירה פוספט (PBS) ולהוסיף 20 מ של PBS קר + 1 מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA). דגירה הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות קציר התאים על ידי pipetting על PBS + EDTA מעל התאים, לשטוף את הצלחת עם 10 מ"ל ל- PBS. שילוב שני שוטף לתוך שני צינורות חרוט 15 מ"ל.
- Centrifuge התאים ב 300 גרם x 10 דקות, resuspend התאים 10 מ"ל של פנול אדום DMEM חינם + 5 מ מ HEPES + 0.2 מ"ג/מ"ל-גלוטמין + 0.05 מ"מ מרקפטואתנול + 5% FBS (DMEM-5) ולספור את התאים באמצעות hemocytometer או מונה קולטר. שמור את התאים על קרח במהלך ספירת.
- הזרעים של המקרופאגים בתרביות רקמה מצופה לוחות-עונה 2 פרק 105 תאים/מ ל.... לניסויים מיקרוסקופ, זרע 1 מ"ל של תאים על coverslips ב 24 צלחות היטב. עבור מבחני שחרור LDH, זרע µL 100 של תאים בצלחת טוב 96. עבור וזמינותו LDH, זרע 9 בארות (3 בארות לא מטופל, 3 בארות עם פקדים פירוק 100% ו- 3 בארות הגירוי ניסויית).
- צנטריפוגה 96 לוח טוב עבור 5 דקות ב g 300 x כדי לוודות את התאים מופצים בצורה שווה על פני הבאר.
- דגירה את הצלחת ללון ב- C ° 37 + 5% CO2 לפני התחלת תהליך לקרקע.
3. לקרקע
- החלף את המדיום בינונית טרייה (DMEM-5) המכיל 100 ננוגרם למ"ל LPS (500 μL עבור 24 טוב צלחת או μL 50 עבור 96 צלחת טוב).
הערה: ישנם מגוון וריאציות מבניות LPS, אשר משפיעים על היכולת לעורר לקרקע בתיווך TLR419. התקליטים של סלמונלה מינסוטה R595 (Re) הינו זמין של ספקים מרובים, מומלץ. - דגירה את הצלחת. בשביל 3 h-CO 37 ° C ו-5%2.
4. הפעלת את Inflammasome NLRP3 עם Nigericin ולקרוא עם המשפחה-YVAD-FMK
- להסיר את המדיום ולהחליף אותו עם 290 μL של DMEM-5 המכיל 5 μM nigericin ו 5 מ מ גליצין. גליצין נוספת להפחית את כמות פירוק התא המתרחשת במהלך ההפעלה קספאז-15. תקופת דגירה של 60 דקות-CO 37 ° C ו-5%2. השתמש מקרופאגים לקוי פראי סוג והן קספאז-1 כדי להבטיח תיוג שנצפה הוא ספציפי קספאז-1.
- במהלך האחרון 45 min, להוסיף 10 μL של 30 x FAM-YVAD-FMK, המוכנים לפי הוראות היצרן.
- לאחר 60 דקות, להסיר את המדיום, לשטוף את התאים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל עם 1 מ"ל של PBS קר.
- להוסיף 250 μL של paraformaldehyde 2% מכל קידוח, דגירה על קרח מכוסה בנייר אלומיניום למשך 30 דקות.
- במהלך האחרון 5 דקות, להוסיף 4 μL של 0.2 מ מ כתם מרחיקת אדום חומצות גרעין פלורסנט לתייג את הגרעינים. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) או צבעים אחרים יכולים לשמש גם תווית ה-DNA.
- לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 1 מ"ל של PBS קר והר על coverslips על גבי שקופיות מיקרוסקופ באמצעות 7 μL אנטי-לדעוך הרכבה בינונית. תן המדיום הרכבה להקשיח בלילה לפני נעילת את coverslip אל השקופית מיקרוסקופ באמצעות לק.
- תמונה של המקרופאגים מאת מיקרוסקופיה קונפוקלית. Ex / Em עבור FAM-YVAD-FMK הוא 492/520nm ו- 642/661 על הכתם מרחיקת אדום חומצות גרעין פלורסנט. הקפד להגדיר את המיקרוסקופ כגון תאים שלא טופלו אינם מראים כל רקע מכתים בערוץ 488. אחרת, צביעת הרקע FAM-YVAD-FMK תהיה שזוהו ובפועל לא פעיל קספאז-1.
הערה: הגדרת מיקרוסקופ המתוארת בסעיף 6.
5. נוגדן מכתים
הערה: כדי לסמן את התאים עם נוגדנים כדי לזהות ASC, זרע, פריים ולחשוף לתאים nigericin זהה בסעיף הקודם. העיבוד אחר כך הוא כדלקמן:
- לשטוף את התאים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל עם 1 מ"ל של PBS קר. להוסיף 250 μL של פתרון קיבוע ו- permeabilization. דגירה התאים על קרח, מכוסה למשך 30 דקות.
- לשטוף את המקרופאגים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל עם 1 מ"ל שטיפת המאגר.
- להוסיף 250 μL של נוגדן ראשוני נגד ASC מדולל שבערך במאגר לשטוף, תקופת דגירה של h 1 על קרח. כוללים coverslip אחד לא יקבל כל נוגדן ראשוני, אך הוא יקבל רק המשני. Coverslip הזה ישמש במהלך הגדרת מיקרוסקופ כדי להגדיר את ההיסט הנכון.
- לשטוף את התאים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל עם מאגר שטיפת 1 מ"ל.
- הוסף μL 250 של נוגדנים משניים (הפלורסנט מצומדת עז-נגד-עכבר) מדולל שבערך במאגר לשטוף ואת תקופת דגירה של h 1 על קרח. להוסיף 4 μL של 0.2 מ מ כתם מרחיקת אדום חומצות גרעין פלורסנט עבור 5 דקות האחרונות של דגירה זו תווית גרעינים.
- לשטוף את התאים 3 x עם 1 מ"ל של כביסה קרה מאגר ו הר coverslips על גבי מיקרוסקופ שקופיות באמצעות 7 μL אנטי-לדעוך הרכבה בינונית. תן המדיום הרכבה להקשיח בלילה לפני נעילת את coverslip אל השקופית מיקרוסקופ באמצעות לק ברורה.
- התמונה מקרופאגים מאת מיקרוסקופיה קונפוקלית. Ex / Em עבור הנוגדן המשני הוא 555/580 nm ו 642/661 עבור מרחיקת אדום חומצות גרעין פלורסנט כתם (כמפורט להלן).
הערה: תיוג עם המשפחה-YVAD-FMK, נוגדן תיוג ניתן לשלב להראות שיתוף לוקליזציה של קספאז פעיל-1 ו- ASC. בשביל זה, בצע את התנאים עבור תיוג FAM-YVAD-FMK, ואז תעבור הנוגדן תיוג פרוטוקול עיבוד נוסף.
6. הדמיה של מקרופאגים שכותרתו מאת מיקרוסקופיה קונפוקלית
הערה: התאים מוכתם ניתן לצפות לאחר coverslips מותר כדי לרפא בן לילה ולא נאטמו אל השקופית מיקרוסקופ עם לק. . הנה, הדמיה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי מתואר. ניתן גם להציג תאים על-ידי קרינה פלואורסצנטית רגילה במיקרוסקופ.
- מקום השקופית עם תאי בקרה שלא טופלו על הבמה מיקרוסקופ ולהתמקד המיקרוסקופ על התאים.
- באמצעות המיקרוסקופ נראה את הטבלה (LUT) הגדרות, כוונון ההיסט של כזה כי יש לא מכתים FAM-YVAD-FMK חיובי בתאים אינו מטופל. תהליך זה ניתן גם לבצע באמצעות מקרופאגים לקוי קספאז-1.
הערה: ההיסט יש יותאם לכל ערוץ המשמשים את הניסוי, אבל הגדרת ההיסט הנכון הוא הקריטי ביותר עבור ערוץ FAM-YVAD-FMK וערוצי נוגדן פלורסנט. ערך ההסטה של ערוץ ה-DNA היא פחות קריטית. ברגע ההיסט הוגדר, לא לשנות את ההגדרה עד סוף הניסוי. - לעבור לשקופית הדגימה nigericin מטופלים. למצוא בשדה שמכיל שני תאים שהם חיוביים ושליליים עבור צביעת FAM-YVAD-FMK. התאם את המטוס הדמיה של הערוץ FAM-YVAD-FMK המטוס בעל עוצמת הגבוהה מכתים חיובי. זה יהיה בדרך כלל המטוס שבו הוא המרכז של המוקד inflammasome עם תמונה.
- להתאים את הרווח כזה foci מוצגות בתאים גרעינים מרוכז. לאחר הגדרת רווח והן אופסט, להשאיר הגדרות אלה למשך כל ההפעלה הדמיה.
הערה: אחת דרך קלה כדי לקבוע אם תא pyroptotic היא על ידי הסתכלות על מורפולוגיה גרעינית. תאים עם קספאז פעיל-1 יש מעוגל, גרעינים מרוכז, בעוד nucleoli מוצגות בתאים ללא הפעלת קספאז-1, המורפולוגיה גרעיני דומים לאלה של תאים שלא טופלו. - לאסוף תמונות של 5 שדות שנבחרו באקראי ב- 100 X הגדלה הכולל. בדרך כלל התוצאה תהיה בערך 40 תאים לכל תמונה. חזור על תהליך זה עבור כל דגימה.
- לספור את מספר התאים כל תמונה באמצעות תוכנה ניתוח התמונה. אז לספור את מספר תאי יש מכתים FAM-YVAD-FMK חיובי. לייצג את הרמה של קספאז-1 הפעלת כאחוז של תאים חיוביים FAM-YVAD-FMK.
7. LDH שחרור Assay
הערה: עבור שחרור LDH וזמינותו, זרעים ו ראש הממשלה שהתאים כפי שתואר בסעיף הקודם, אלא להשתמש צלחת טוב 96. אל תסיר את המדיום לאחר לקרקע.
- להוסיף 50 μL של DMEM-5 המכילה 10 nigericin μM לבארות ניסיוני, 50 μL DMEM-5 לבארות שליטה פירוק ספונטני ל- 100%. אל תוסיף את גליצין בניסוי זה, שכן המטרה היא למדוד את פירוק התא. תקופת דגירה של 60 דקות-CO 37 ° C ו-5%2.
- לאחר 30 דקות, להוסיף 10 μL 10 x פירוק מאגר הבארות 100% שליטה פירוק ולהוסיף 10 μL של DMEM-5 הבארות אחרים. במהלך זה דגירה, להסיר 1 בקבוקון המצע מיקס (1.5 מ"ל של מצע הליחה) 1 aliquot assay מאגר (~ 12 mL) מן המקפיא ולתת להם להפשיר מוגנים מפני אור לטמפרטורת החדר.
הערה: התמהיל המצע מכיל מלח tetrazolium (iodonitro-tetrazolium סגול), אשר מומר מוצר formazan אדום. - לאחר 60 דקות הכולל הדגירה, centrifuge את הצלחת. בשביל 5 דקות ב 500 g x-10 מעלות צלזיוס. העברת μL 50 של תגובת שיקוע צלחת ברור שטוח התחתונה. במהלך תקופה זו, להוסיף 12 מ של מאגר assay הבקבוקון של מצע מיקס, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות לפני השימוש.
- להוסיף 50 μL של מצע מכל קידוח, תקופת דגירה של 30 דקות בחושך. כוללים בינוני בארות רק עבור ערכים ריקים. בדוק את הצלחת לאחר 15 דקות כדי לוודא כי האות לא יעלה את מגבלת זיהוי של הקורא צלחת.
- לאחר 30 דקות, להוסיף 50 μL של להפסיק פתרון (חומצה אצטית 1 מ') ומדידת יתר490 שימוש בקורא צלחת.
- לחשב את האחוזים של פירוק התא באמצעות הנוסחה הבאה:
% Cytoxicity = ((Experimental-Spontaneous) / (מרבי-ספונטנית)) × 100
ניסיוני: תאים nigericin טיפול; ספונטני: מטופל תאים; מרבית: תאים נחשפו למאגר פירוק
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לזהות קספאז-1 הפעלת בעקבות החשיפה של nigericin, התאים עובדו כמתואר בסעיף פרוטוקול. שילבנו בין FAM-YVAD-FMK והן ASC נוגדן תיוג על מנת להראות כי ASC ו קספאז פעיל-1 שיתוף לשפה בעקבות הפעלת בתיווך NLRP3 inflammasome. איור 1A מראה פראי סוג מקרופאגים נחשפים 5 μM nigericin יש היווצרות המוקד ASC באזור perinuclear. מוקדים אלה מכילים גם קספאז פעיל-1 כפי שנראה לוקליזציה שיתוף של שמ ת עם המשפחה-YVAD-FMK. התאים הם חיוביים עבור קספאז פעיל-1 יש גרעיני התעבות מראה כי תאים אלה נמצאים בתהליך pyroptosis. איור 1B מראה כי בעוד מקרופאגים של עכברים לקוי קספאז-1/11 יש היווצרות המוקד עולה, שאין להם כל קספאז-1 פעיל המזוהה עם התמקדות זו כפי שמוצג על ידי העדר FAM-YVAD-FMK מכתים. הגרעינים של התאים האלה לא נמצאים מרוכז, המציינת שקיימת אין pyroptotic תא המוות המתרחשים. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סריקה עם 63 X שמן טבילה אובייקטיבי. תמונות נשמרו כקובצי TIFF ללא כל עיבוד נוסף.
על מנת לקבוע את הרמה של מוות תאי המשויך חשיפה nigericin, ביצענו assay שחרור של LDH על תרבות supernatant. איור 2 מראה פראי סוג מקרופאגים עוברים מוות של תאים לאחר החשיפה nigericin. לעומת זאת, מקרופאגים בנכונותם קספאז-1 אל תשחררי LDH לתוך התא תגובת שיקוע, המציין כי התאים נמצאים ללא פגע.
איור 1: אנטי-ASC תיוג והצהרה FAM-YVAD-FMK. (א) פראי סוג (WT) ו- (B) לקויה קספאז-1/11 (c1/11- / -) מקרופאגים היו חשופים nigericin μM 5 עבור 1 h, נותחו עבור קספאז פעיל-1 על ידי שימוש FAM-YVAD-FMK כדי לזהות קספאז פעיל-1 ו- anti-ASC מיקרוסקופיה קונפוקלית נוגדנים משני ראשי, עז-נגד-עכבר כדי לזהות ASC להתמקד היווצרות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: LDH שחרור assay תוצאות. פראי סוג ו מקרופאגים לקוי קספאז-1/11 נחשפו nigericin μM 5 עבור 1 h, תא supernatant נותחו לנוכחות של לקטט דהידרוגנאז. הנתונים הם אמצעי ± SD של משכפל שלוש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כתב יד זה, הוצגו שתי שיטות לבחון inflammasome ההפעלה ואת התוצאה של הפעלת קספאז-1 בעקבות גירוי NLRP3 ב מקרופאגים מאתר הנגזרות מח עצם. הטכניקה הראשונה מאפשרת החוקר לקבוע את רמת ההפעלה קספאז-1 על בסיס הסלולר באמצעות הכתבת פלורסנט FAM-YVAD-FMK. הכתב הוא מאוד ספציפי מחייב את המשפחה קספאז-1 של אנזימים, כפי שניתן לראות בגלל היעדר מכתים ב מקרופאגים לקוי קספאז-1/11. ירידה לפרטים הוצג גם על ידי לה-רוק ואח. בכתב היד שלהם המתאר את התפקיד של החלבון Yersinia YopM על ההפעלה קספאז-1. בכתב היד שלהם, הם מראים כי FAM-YVAD-FMK מוקדים חופף עם מוקדים אשר הודבקו תוויות עם נוגדנים נגד קספאז-117.
כמו במקרה עם כל הניסוי, ישנם כמה צעדים קריטיים צריך להיות אחריו כדי לחסל את תוצאות חיוביות שגויות. קודם כל, זה הכרחי כדי להשתמש מקרופאגים לקוי פראי סוג והן קספאז-1/11. באמצעות אלה סוגי שני תאים, התנאים להוביל שאינם ספציפיים מכתים יכול ייכללו ניתוח נוסף. שנית, כמו עם כל נוגדן או פעילות הגישוש תיוג assay, חשוב לשטוף ביסודיות את התאים לאחר צביעת עם המשפחה-YVAD-FMK. באמצעות שלושה שוטף 5 דקות, הרמה של האות רקע מוקטן מאוד. שלב קריטי השלישי מתרחשת במהלך ההגדרה של מיקרוסקופ קונפוקלי. . כאן, זה חשוב כי תאים שלא טופלו המסומנת FAM-YVAD-FMK משמשים לקביעת ההיסט של מיקרוסקופ קונפוקלי בצורה כזאת, כי לא מכתים cytoplasmic חיובי נצפית בתאי לא מטופל. כאשר השלבים עוקבים, טכניקה זו היא כלי שימושי כדי להעריך את ההפעלה של קספאז-1 על בסיס הסלולר.
פרוטוקול זה יכול להיות שונה בהתאם לצרכים חוקרים. לדוגמה, התאים יכולים להיות מטופלים עם משקל מולקולרי קטן תרכובות-מספר שלבים במהלך התהליך כולו. יכולת זו תאפשר לצורך זיהוי מסלולים זה לווסת את oligomerization של NLR, הגיוס של ASC או פרו-קספאז-1, או את ההפעלה של קספאז-1 עצמה. השינויים שביצעת פרוטוקול זה צריך להיות כזה כי הם לא מפעילים קספאז-1 על ידי עצמו. אם מצב זה מתרחש, עקומת תגובת המינון של התרופה המדוברת נדרש. אף-על-פי התמקדנו הפעלת inflammasome NLRP3, פרוטוקול זה גם ניתן לבדוק inflammasomes המופעלות על-ידי אחרים PRRs. שינוי אחר שיש לנו כלל כתב יד זה הוא השילוב של המשפחה-YVAD-FMK מכתים עם נוגדן תיוג רכיבי inflammasome. אנו מראים שיש כאן שיתוף לוקליזציה של מתאם inflammasome עולה עם קספאז פעיל-1. מגבלה של שיטה זו כפי שמתואר, הוא שזה דורש גישה מיקרוסקופ קונפוקלי. עם זאת, אסטרטגיה הקשורות לזהות ASC המוקד צורה על-ידי cytometry זרימה כבר דווח על20,21.
הטכניקה השנייה דנו מאפשר איתור מהיר של פירוק התא שימוש assay שחרור של לקטט דהידרוגנאז. חשוב לציין כי LDH שחרור מצביע על אובדן של קרום פלזמה שלמות ותא פירוק, אשר גם מתרחשת במהלך צורות רבות אחרות של מוות של תאים, אינה ספציפית כדי pyroptosis. עם זאת, השימוש של תאים לקוי קספאז-1 ניתן לזהות פירוק התא קספאז-1-תלוי, תכונה המכונן של pyroptosis.
שלב קריטי ב פרוטוקול זה (במיוחד בעת שימוש סוכן זיהומיות) היא centrifuge את הצלחת לאחר זריעת תאי צלחת טוב 96. צנטריפוגה של הצלחת מאפשר חלוקה שוויונית של מקרופאגים על פני כל היטב. עם חלוקה שוויונית, יהיו חשופים לכל מקרופאג מספר זהה של חיידקים. בלי צנטריפוגה, השפעת מניסקוס הנוזל בתוך הבאר יוביל מקרופאגים נוספים צבירת בקצה הבאר. זה להוביל נמוכה יותר ריבוי המיועד של זיהום (MOI) קרוב לקיר טוב ומעלה מאשר מיועד MOI במרכז של הבאר...
חיסרון פוטנציאלי של LDH שחרור וזמינותו היא כי זה מודד פירוק ברמת האוכלוסייה, בנקודת זמן אחת לכל וזמינותו. גישה חלופית היא לכמת ספיגת של צבעי impermeant התא על ידי מיקרוסקופ, אשר מזהה אובדן הקרומיות על בסיס לתא בודד. בשילוב עם תא חי הדמיה פלטפורמות, גישה זו יכול גם לספק הערכה הטמפורלי של pyroptosis22. צבעי פלורסנט מחייב DNA קטנות כגון propidium יודיד או אתידיום ברומיד יכול לעבור דרך הנקבובית gasdermin D, לאגד חומצות גרעין הסלולר ו לזרוח5,22,23. הנקבוביות היווצרות, ספיגת של צבע קטנים אלה חנותם מקדים פירוק התא מסוף. פירוק מאפשר קליטת צבעים גדול יותר ואובדן של החלבונים גדולים כגון LDH. השימוש של גליצין השפעול יכולים לנתק נקבובית היווצרות של פירוק, גליצין אינה חוסמת היווצרות נקבובית בתיווך D gasdermin, ספיגת צבע קטנים או הפרשת IL-1β, אך גליצין למנוע פירוק מהיר ו- LDH שחרור5,22 , 23 , 24. אנו מציעים כולל גליצין בניסויים מכתימים FAM-YAVD-FMK, כדי למנוע אובדן מוחלט של הקרומיות, אבל חייב להיות מושמט גליצין כאשר מודדים את שחרור LDH pyroptotic.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף
Acknowledgments
מיקרוסקופ כל נעשה במרכז וו מ קק מיקרוסקופ עם תמיכה של נתנאל פיטרס, עם תמיכה של NIH פרס S10OD016240. S.L.F. נתמך על ידי NIH K08AI119142 ו- R21AI130281. אנו מודים ד ר ריצ'רד קיבל ד ר קוקסון בראד עבור עכברים לקוי קספאז-1/11, ואת ד ר קוקסון בראד לשיתוף מעבדה מתקנים וציוד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E-MEM | ATCC | 30-2003 | For growing L929 cells |
| NCRC clone 929 (L929) | ATCC | CCL-1 | |
| Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer. Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde |
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay | Fisher Scientific | PR-G1780 | Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid |
| FAM-YVAD-FMK | Immunocytochemistry Technologies | 98 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Invitrogen | 11960044 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Dulbecco's PBS, no calcium, no magnesium | Invitrogen | 14190144 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin | Invitrogen | 26140079 | Heat inactivated at 55°C for 50 min |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750060 | |
| ProLong Gold Mounting Medium | Invitrogen | p36934 | Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46 |
| goat anti-mouse ALEXA555 | Invitrogen | A-21422 | |
| HEPES (Ultra Pure) | Invitrogen | 11344041 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| TO-PRO-3 Iodide | Invitrogen | T3605 | far-red fluorescent nucleic acid stain |
| C57BL/6J mouse | Jackson Laboratoy | 000664 | |
| caspase-1/11-/- mouse | Jackson Laboratory | 016621 | |
| Leica SP8X Confocal Microscope | Leica | ||
| Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re) | List Biologicals | 434 | |
| anti-ASC clone 2EI-7 | Millipore-Sigma | 04-417 | |
| beta-mercapto-ethanol | Millipore-Sigma | M6250-10ML | |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650-5X10ML | |
| EDTA | Millipore-Sigma | E5391 | |
| Spectramax M3 plate reader | Molecular Devices | 5000414 |
References
- Jorgensen, I., Miao, E. A. Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens. Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).
- Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics. Nat Med. 21 (7), 677-687 (2015).
- Bergsbaken, T., Fink, S. L., Cookson, B. T. Pyroptosis: host cell death and inflammation. Nat Rev Microbiol. 7 (2), 99-109 (2009).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cell Microbiol. 8 (11), 1812-1825 (2006).
- Bergsbaken, T., Fink, S. L., den Hartigh, A. B., Loomis, W. P., Cookson, B. T. Coordinated host responses during pyroptosis: caspase-1-dependent lysosome exocytosis and inflammatory cytokine maturation. J Immunol. 187 (5), 2748-2754 (2011).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Sutterwala, F. S., Haasken, S., Cassel, S. L. Mechanism of NLRP3 inflammasome activation. Ann N Y Acad Sci. 1319, 82-95 (2014).
- Juliana, C., et al. Non-transcriptional priming and deubiquitination regulate NLRP3 inflammasome activation. J Biol Chem. 287 (43), 36617-36622 (2012).
- Py, B. F., Kim, M. S., Vakifahmetoglu-Norberg, H., Yuan, J. Deubiquitination of NLRP3 by BRCC3 critically regulates inflammasome activity. Mol Cell. 49 (2), 331-338 (2013).
- Song, N., et al. NLRP3 Phosphorylation Is an Essential Priming Event for Inflammasome Activation. Mol Cell. 68 (1), 185-197 (2017).
- Stutz, A., et al. NLRP3 inflammasome assembly is regulated by phosphorylation of the pyrin domain. J Exp Med. 214 (6), 1725-1736 (2017).
- Broz, P., Dixit, V. M. Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling. Nat Rev Immunol. 16 (7), 407-420 (2016).
- Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. J Biol Chem. 274 (48), 33835-33838 (1999).
- Yamamoto, M., et al. ASC is essential for LPS-induced activation of procaspase-1 independently of TLR-associated signal adaptor molecules. Genes Cells. 9 (11), 1055-1067 (2004).
- Miao, E. A., Rajan, J. V., Aderem, A. Caspase-1-induced pyroptotic cell death. Immunol Rev. 243 (1), 206-214 (2011).
- LaRock, C. N., Cookson, B. T. The Yersinia virulence effector YopM binds caspase-1 to arrest inflammasome assembly and processing. Cell Host Microbe. 12 (6), 799-805 (2012).
- Swanson, M. S., Isberg, R. R. Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum. Infect Immun. 63 (9), 3609-3620 (1995).
- Miller, S. I., Ernst, R. K., Bader, M. W. LPS, TLR4 and infectious disease diversity. Nat Rev Microbiol. 3 (1), 36-46 (2005).
- Sester, D. P., et al. A novel flow cytometric method to assess inflammasome formation. J Immunol. 194 (1), 455-462 (2015).
- Sester, D. P., et al. Assessment of Inflammasome Formation by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2016).
- DiPeso, L., Ji, D. X., Vance, R. E., Price, J. V. Cell death and cell lysis are separable events during pyroptosis. Cell Death Discov. , (2017).
- Russo, H. M., et al. Active Caspase-1 Induces Plasma Membrane Pores That Precede Pyroptotic Lysis and Are Blocked by Lanthanides. J Immunol. 197 (4), 1353-1367 (2016).
- Evavold, C. L., et al. The Pore-Forming Protein Gasdermin D Regulates Interleukin-1 Secretion from Living Macrophages. Immunity. , (2017).
