Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Deteksjon av Inflammasome aktivisering og Pyroptotic celle død i Murine Ben margtransplantasjon-avledet makrofager

Published: May 21, 2018 doi: 10.3791/57463
Automatic Translation
1, 1
1Department of Laboratory Medicine, University of Washington

Summary

Vi beskriver gjenkjenning av NLRP3 inflammasome aktivisering på cellular basis benytter fluorescens mikroskopi og flekker for aktive caspase-1 og adapteren, ASC. En laktat dehydrogenase utgivelsen analysen er presentert for å oppdage pyroptotic lyse på befolkningen basis. Disse teknikkene kan tilpasses for å studere mange aspekter av inflammasome biologi.

Abstract

Inflammasomes er medfødte immunsystemet signalnettverk plattformer som kreves for vellykket kontroll av mange sykdomsfremkallende organismer, men også fremme provoserende og autoinflammatory sykdommer. Inflammasomes aktiveres ved cytosolic mønster anerkjennelse reseptorer, inkludert medlemmer av NOD-lignende reseptor (Review) familien. Disse reseptorene oligomerize ved påvisning av mikrobiell- eller skader-assosiert stimuli. Påfølgende rekruttering av adapter protein ASC danner en mikroskopisk synlig inflammasome komplekset, som aktiverer caspase-1 til nærhet-indusert Autoaktivering. Etter aktivisering kløyver caspase-1 pro-IL-1β og pro-IL-18, fører til aktivering og sekresjon av disse pro-inflammatoriske cytokiner. Caspase-1 formidler også inflammatorisk form av celledød kalt pyroptosis, som har tapet av membran integritet og celle lysis. Caspase-1 kløyver gasdermin D, slippe N-terminal fragmentet som plasma membranen porene, fører til osmotisk lysis.

I vitro, aktivering av caspase-1 kan bestemmes ved merking Ben margtransplantasjon-avledet makrofager med caspase-1 aktivitet sonden FAM-YVAD-FMK og merking cellene med antistoffer mot adapter protein ASC. Denne teknikken tillater identifisering av inflammasome formasjon og caspase-1 aktivering i enkeltceller bruker fluorescens mikroskopi. Pyroptotic celledød kan oppdages ved å måle utgivelsen av cytosolic laktat dehydrogenase til medium. Denne fremgangsmåten er enkel, kostnadseffektiv og utført i 96-brønnen plate format, slik at tilpasning for screening. I dette manuskriptet viser vi at aktivering av NLRP3 inflammasome av nigericin fører co oversetting av adapter protein ASC og aktive caspase-1, fører til pyroptosis.

Introduction

Inflammasome-mediert betennelse er en kritisk komponent i forsvaret mot sykdomsfremkallende organismer1, men også ligger under etiologien for mange sykdommer2. Inflammatorisk reaksjon på en rekke infeksjoner utløses av cytosolic påvisning av patogen-forbundet molekylær mønster (PAMPs) eller skade forbundet molekylær mønster (DAMPs). Mønster gjenkjennelse reseptorer (PRR), inkludert medlemmer av NOD-lignende reseptor (Review) familien, oligomerize ved påvisning av disse PAMPs og DAMPs. Dette utløser dannelsen av et multi protein kompleks kalt inflammasome, som inneholder PRR, adapter protein apoptose-assosiert flekk som protein inneholder et C-terminalen caspase-rekruttering domene (kort) (ASC) og Pro form av caspase-13,4. Dette gir nærhet-indusert auto-aktivering av caspase-1. Aktive caspase-1 da fører til et sett med hendelser som er karakteristiske for inflammatorisk celle død veien pyroptosis. Disse hendelsene inkluderer: cleavage og utgivelsen av inflammatoriske cytokiner IL 1β og IL-18, lysosome exocytosis med utgivelsen av lysosomale innholdet i ekstracellulære plass, kjernefysiske kondens og gasdermin D cleavage. Utgitt N-terminal domenet gasdermin D setter inn i plasma membranen, danne porer at plasma membranen brudd og frigjøring av inflammatoriske innholdet, i tillegg til å ta bort en beskyttende nisje for patogen replikering5, 6 , 7.

Her fokusere vi på godt studert NLRP3 inflammasome. Aktivering av NLRP3-inflammasome skjer via en totrinns prosess8. Steg 1 "grunning" skjer gjennom erkjennelsen av Toll-like reseptorer (TLR) mikrobiell produktet. Dette er replikert i innstillingen laboratorium ved hjelp av LPS for å stimulere TLR4. Dette stimulering upregulates NLRP3 og pro-IL-1β gjennom NF-kB signalering. Grunning i tillegg lisenser NLRP3 gjennom ikke-transcriptional mekanismer ved å indusere sin deubiquitination9,10 og fosforylering eller dephosphorylation bestemt rester11,12.

Andre signalet for NLRP3 aktivisering antas å involverer Mitokondrielt faktorer, reaktive oksygen arter, kalium middelklasseinnbyggere og kalsium signalnettverk, selv om en samlende mekanisme for NLRP3 aktivisering forblir unnvikende8. Aktivert NLRP3 oligomerizes gjennom interaksjoner mellom sin NACHT domener, og rekrutterer ASC via binding av pyrin (PYD) domener13. I hver celle danner disse macromolecular komplekser enkelt mikroskopisk synlig fokus. ASC ble opprinnelig identifisert som en 22 KDa protein som danner en "prikk" under apoptose menneskers leukemi celler og navngitt apoptose-assosiert flekk som protein inneholder en kort14. Det ble senere fastslått at ASC rekrutterer pro-caspase-1 til samspillet av kortet av ASC kortet pro-caspase-1, danner de inflammasome15.

Ikke alle NLRs krever ASC å indusere caspase-1 aktivisering. I motsetning til NLRP3, NLRC4 og NLRP1b har kort domener og kan direkte rekruttere pro-caspase-1 via kort-kort interaksjoner å indusere caspase-1 aktivisering. I fravær av ASC, aktive caspase-1 forblir diffus gjennom stoffer og utgjør ikke en enkelt fokus. Denne diffuse aktive caspase-1 er tilstrekkelig til å indusere pyroptotic celledød, men kan ikke behandle pro-IL-1β13,16.

I dette manuskriptet vil vi diskutere to måter å vurdere inflammasome aktivisering. Først bruker fluorescerende aktiviteten sondere, FAM-YVAD-FMK, som binder caspase-1 familie proteaser. Denne serien inkluderer caspase-1, men også musen caspase-11 og menneskelig caspase-4 og caspase-5. Ved hjelp av makrofager fra caspase-1/11 mangelfull mus i alle eksperimentene, sendes spesielle ved denne sonde. Denne metoden kan kombineres med antistoff merking av inflammasome komponenter, som vi også beskriver. Mikroskopiske visualisering tillater identifikasjon av individuelle celler som inneholder aktive caspase-1 og oligomerized ASC. Bruker denne metoden, vil forskere kunne finne ut hvor i inflammasome formasjon kaskade deres manipulering av verten cellen eller den sykdomsfremkallende organismen under studien har en effekt. For eksempel kan man skille om en gitt intervensjon forhindrer rekruttering av ASC NLRP3 komplekse eller mål påfølgende rekruttering og aktivering av caspase-117. Undersøke resultatene av caspase-1 aktivisering som IL-1β sekresjon kunne ikke skille mellom disse to muligheter. Utskillelsen av IL-1β kan også endres uten å endre celler muligheten til å aktivere caspase-1 og gjennomgå pyroptotic celle død16.

Den andre metoden måler utgivelsen av laktat dehydrogenase (LDH) inn i cellen supernatant, som oppstår under pyroptotic macrophage lysis etter caspase-1 aktivisering som beskrevet ovenfor. Denne andre metoden er en populasjon basert tilnærming utgivelsen av LDH i hele godt er målt. Denne enkle tilnærming tillater rask analyse (30 min incubation tid) av prøver å avgjøre om det er caspase-1-mediert celledød og kan utføres i 96-brønnen plate format.

Disse metodene er komplementære, hver med forskjellige fordeler, og begge er lett mottakelig for endringer. Macrophage behandling med målrettet små molekylvekt forbindelser før inflammasome stimulering kan for eksempel brukes til å undersøke hvilken rolle visse proteiner kan ha på kontrollere inflammatorisk svar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr prosedyrer ble godkjent og utført under University of Washington institusjonelle Animal Care og bruk komiteen retningslinjer.

1. innhøstingen av benmarg

  1. Tas aseptisk Fjern femur og tibia fra mus og rengjør bein sterilt instrumenter. Plasser renset bein i Dulbecco endret Eagle Medium (DMEM) + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL L-glutamin + 0.05 mM 2-mercaptoethanol + 50 mg/mL gentamicin sulfate + 10.000 U/mL penicillin/streptomycin + 10% fosterets bovin serum (FBS, DMEM-10 komplett) og ruge den rør på isen i 15 min.
  2. Fjerne proksimale og distale ball leddene med saks. Sett inn en 25 G nål knyttet til 10 mL sprøyte fylt med medium til hule bein. Tømme ut benmargen bruker DMEM-10 fullstendig. Resuspend noen klumper av pipettering mediet opp og ned forsiktig.
  3. Sentrifuge celler for 10 min 300 x g og telle antall celler ved hjelp av en hemocytometer. På dette punktet, enten fryse cellene med 90% FBS + 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) eller plate cellene i en 15 cm Petriskål å skille makrofager ved hjelp av L929 betinget medium (trinn 2.1).

2. differensiering av Ben margtransplantasjon-avledet makrofager

  1. Ved hjelp av forvarmes differensiering medium (21 mL av DMEM-10 komplett og 9 mL av L929 celle betinget medium som beskrevet av Swanson et al. 18), sette bein margtransplantasjon celler i en 15 cm vev kultur behandlet Petriskål (1.2-1.5 x 107 celler). Inkuber platen på 37 ° C og 5% CO2 i 7 dager. Legge en ytterligere 30 mL av differensiering medium til platen på dag 3 eller 4.
    Merk: Det er viktig ikke å bruke vev kultur behandlet plater, som makrofager vil være vanskelig å løsne og høste.
  2. Samle makrofager, vaske platen med fosfat-bufret saltvann (PBS) og legge til 20 mL kaldt PBS + 1 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA). Inkuber platen ved 4 ° C i 10 min. Harvest cellene av pipettering PBS + EDTA over cellene og vaske platen med 10 mL PBS. Kombinere begge vasker i to 15 mL konisk rør.
  3. Sentrifuge cellene på 300 x g i 10 min og resuspend cellene i 10 mL av fenol-rød gratis DMEM + 5 mM HEPES 0,2 mg/mL L-glutamin + 0.05 mM 2-mercaptoethanol ++ 5% FBS (DMEM-5) og telle celler ved hjelp av en hemocytometer eller en Coulter teller. Holde cellene på is under telling.
  4. Frø makrofager i vev kultur belagt plater på 2 x 105 celler/mL. Til mikroskopi eksperimenter, frø 1 mL av celler i coverslips i 24 bra plater. For LDH utgivelsen analyser, frø 100 µL av celler i en 96 godt plate. For LDH analysen, frø 9 brønner (3 brønner ubehandlet, 3 med 100% lysis kontroller og 3 førte for eksperimentell stimulans).
  5. Sentrifuge 96 godt platen i 5 min på 300 x g å gjøre visse cellene fordeles likt mellom brønnen.
  6. Inkuber platen overnatting på 37 ° C + 5% CO2 før du starter primerprosessen.

3. priming

  1. Erstatt medium med fersk medium (DMEM-5) som inneholder 100 ng/mL LPS (500 μL for 24 godt plate eller 50 μL for 96 godt plate).
    Merk: Det er en rekke strukturelle variasjoner i LPS, som påvirker evnen til å stimulere TLR4-mediert grunning19. LPS fra Salmonella minnesota R595 (Re) er tilgjengelig fra flere leverandører og anbefales.
  2. Inkuber platen i 3 h 37 ° C og 5% CO2.

4. aktivering av NLRP3 Inflammasome med Nigericin og merking med FAM-YVAD-FMK

  1. Fjern mediet og erstatte den med 290 μL DMEM-5 inneholder 5 μM nigericin og 5 mM glysin. Glysin legges til redusere celle lysis som oppstår under caspase-1 aktivering5. Inkuber for 60 min på 37 ° C og 5% CO2. Bruke både wild type og caspase-1 mangelfull makrofager for å sikre at observert merking er spesifikk for caspase-1.
  2. I løpet av de siste 45 minutter, tilsett 10 μL av 30 x FAM-YVAD-FMK, utarbeidet i henhold til produsentens instruksjoner.
  3. 60 min., fjerne mediet og vaskes cellene tre ganger i 5 min hver med 1 mL av kaldt PBS.
  4. Legg til 250 μL 2% paraformaldehyde i hver brønn og ruge på is dekket med aluminiumsfolie for 30 min.
  5. I løpet av de siste 5 min, legger du til 4 μL 0.2 mM langt rødt fluorescerende nukleinsyre flekken merke kjerner. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) eller andre fargestoffer kan også brukes til etiketten DNA.
  6. Vask cellene tre ganger med 1 mL kaldt PBS og montere coverslips på objektglass ved hjelp av 7 μL anti-fade montering medium. La montering mediet stivne over natten før forsegle dekkglassvæske til mikroskopet lysbilde bruker neglelakk.
  7. Bilde av makrofager av AC confocal mikroskopi. Ex / dem til FAM-YVAD-FMK er 492/520nm og 642/661 for langt rødt fluorescerende nukleinsyre flekken. Pass på å definere mikroskopet slik at ubehandlet celler ikke viser noen bakgrunn flekker i 488 kanalen. Ellers blir bakgrunn FAM-YVAD-FMK flekker oppdaget og ikke faktisk aktive caspase-1.
    Merk: Mikroskop oppsett er beskrevet i delen 6.

5. antistoff flekker

Merk: Hvis du vil merke cellene med antistoffer å oppdage ASC, frø prime og avsløre cellene nigericin identisk til forrige avsnitt. Behandlingen etterpå er som følger:

  1. Vask cellene tre ganger i 5 min hver med 1 mL av kaldt PBS. Legge til 250 μL fiksering og permeabilization løsning. Inkuber cellene på is, og dekket i 30 min.
  2. Vask makrofager tre ganger i 5 min hver med 1 mL av vaskebuffer.
  3. Legg til 250 μL primære antistoff mot ASC fortynnet 1:500 i vaskebuffer og ruge 1t på is. Inkluder en dekkglassvæske som ikke får noen primære antistoff, men får bare videregående. Denne dekkglassvæske brukes under mikroskopet setup for å angi riktig forskyvningen.
  4. Vask cellene tre ganger i 5 min hver med 1 mL vaskebuffer.
  5. Legge til 250 μL sekundære antistoff (fluorescerende fargestoff konjugert geit-anti-mus) fortynnet 1:500 i vaskebuffer og ruge 1t på is. Legge til 4 μL 0.2 mM langt rødt fluorescerende nukleinsyre flekken i de siste 5 min med dette inkubering etiketten kjerner.
  6. Vask cellene 3 x med 1 mL kaldt vaskebuffer og mount coverslips på mikroskopet lysbilder ved hjelp av 7 μL anti-fade montering medium. La montering mediet stivne over natten før forsegle dekkglassvæske til mikroskopet lysbilde med klart neglelakk.
  7. Bildet makrofager av AC confocal mikroskopi. Ex / Em sekundære antistoffer er 555/580 nm og 642/661 for langt rødt fluorescerende nukleinsyre flekker (som beskrevet nedenfor).
    Merk: Merking med FAM-YVAD-FMK og antistoff merking kan kombineres for å vise co lokalisering av aktive caspase-1 og ASC. For dette, følg vilkårene for FAM-YVAD-FMK merking og deretter bytte til antistoffer merking protokollen for videre behandling.

6. avbilding av merket makrofager av AC Confocal mikroskopi

Merk: Farget cellene kan vises etter coverslips har fått lov til å kurere over natten og er blitt forseglet på mikroskopet lysbildet med neglelakk. Her, er bildebehandling ved hjelp av en AC confocal mikroskop beskrevet. Cellene kan også sees av standard fluorescens mikroskopi.

  1. Plasser lysbildet med ubehandlet kontroll cellene på mikroskopet scenen og fokusere mikroskopet på cellene.
  2. Bruk av mikroskopet ser opp tabellen (LUT) justere innstillinger, forskyvningen slik at det er ingen positive FAM-YVAD-FMK flekker i ubehandlet cellene. Denne prosessen kan også utføres ved hjelp av caspase-1 mangelfull makrofager.
    Merk: Forskyvningen må justeres for hver kanal som brukes i eksperimentet, men sette riktig forskyvningen er mest kritiske for FAM-YVAD-FMK kanal og fluorescerende antistoff kanaler. Forskyvningen for DNA kanalen er mindre viktig. Når forskyvningen er angitt, Juster ikke denne innstillingen for resten av eksperimentet.
  3. Bytte lysbildet til nigericin behandlet prøven. Finne et felt som inneholder både positive og negative til FAM-YVAD-FMK farging celler. Justere tenkelig flyet FAM-YVAD-FMK kanalen flyet som har høyest intensiteten av positiv flekker. Dette vil vanligvis være flyet hvor midten av inflammasome fokus er fotografert.
  4. Justere forsterkningen slik at foci vises i celler som har kondensert kjerner. Når både gevinst og forskyvning, la disse innstillingene for resten av tenkelig økten.
    Merk: En lett vei å avgjøre hvis en celle er pyroptotic er ved å se på kjernefysiske morfologi. Celler med aktive caspase-1 har avrundede og kondensert kjerner, mens nucleoli vises i celler uten caspase-1 aktivisering og kjernefysiske morfologi ligner de av ubehandlet celler.
  5. Samle bilder av 5 tilfeldig valgt felt på 100 X totale forstørrelse. Dette vil vanligvis resultere i 40 celler per bilde. Gjenta denne prosessen for hvert utvalg.
  6. Tell antall celler i hvert bilde ved hjelp av analyseprogramvare. Deretter telle antall celler som har positive FAM-YVAD-FMK flekker. Representere nivået på caspase-1 aktivisering som prosent FAM-YVAD-FMK positive celler.

7. LDH utgivelsen analysen

Merk: For LDH utgivelsen analysen, frø og prime cellene som beskrevet i forrige avsnitt, bortsett fra bruker en 96 godt plate. Fjern ikke mediet etter grunningen.

  1. Tilsett 50 μL av DMEM-5 inneholder 10 μM nigericin eksperimentelle fordelt og 50 μL DMEM-5 spontan og 100% lysis kontroll fordelt. Ikke Legg glysin i dette eksperimentet siden målet er å måle celle lysis. Inkuber for 60 min på 37 ° C og 5% CO2.
  2. Etter 30 min, tilsett 10 μL μL 10 x 100% lysis kontroll brønnene og tilsett 10 μL av DMEM-5 andre brønnene. Under denne inkubasjonen, fjerne 1 hetteglass med underlaget blanding (1,5 mL av fryse-tørket substrat) og 1 aliquot av analysebuffer (~ 12 mL) fra fryseren og la dem tine beskyttet fra lys til romtemperatur.
    Merk: Substrat blandingen inneholder en tetrazolium salt (iodonitro-tetrazolium fiolett), som er konvertert til en rød formazan produktet.
  3. Etter inkubasjon totalt 60 min sentrifuge platen i 5 min på 500 x g på 10 ° C. Overføre 50 μL nedbryting av en klar flat Bunn platen. Samtidig legge til 12 mL av analysebuffer i ampullen substrat mix og ruge ved romtemperatur for 5 minutter før du bruker.
  4. Tilsett 50 μL av underlaget i hver brønn og ruge i 30 min i mørket. Inkluder middels bare brønner for tomme verdier. Kontroller platen etter 15 minutter for å sørge for at signalet ikke vil overstige oppdagelsen grensen på plate leseren.
  5. Etter 30 min, tilsett 50 μL av stopp løsning (1 M eddiksyre) og måle OD490 likner en plate.
  6. Beregning av cellen lysis bruker følgende formel:
    % Cytoxicity = ((Experimental-Spontaneous) / (maksimal-spontan)) × 100
    Eksperimentell: nigericin behandlet celler. spontan: ubehandlet celler. maksimal: celler utsatt for lyseringsbuffer

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å oppdage caspase-1 aktivisering etter eksponering nigericin, ble cellene behandlet som beskrevet i delen protokollen. Vi kombinerte både FAM-YVAD-FMK og ASC antistoff merking for å vise at ASC og aktive caspase-1 co lokalisere etter NLRP3-mediert inflammasome aktivisering. Figur 1A viser at wild type makrofager utsatt for 5 μM nigericin har dannelsen av en ASC fokus i regionen perinuclear. Disse foci også inneholde aktive caspase-1 sett av den co lokaliseringen av ASC med FAM-YVAD-FMK. Cellene som er positivt for aktive caspase-1 har kjernefysiske kondens viser at disse cellene er under pyroptosis. Figur 1B viser at mens makrofager av caspase-1/11 mangelfull mus har dannelsen av en ASC fokus, de ikke har noen aktiv caspase-1 forbundet med dette fokuset som vist ved fravær av FAM-YVAD-FMK flekker. Kjerner i disse cellene er ikke kondensert, som angir at det er ingen pyroptotic celle death forekommende. Bildene ble tatt med en 63 X nedsenking oljeobjektiv skanning AC confocal mikroskop. Bilder ble lagret som TIFF-filer uten videre behandling.

For å bestemme nivået av celledød som er knyttet til eksponering for nigericin, utført vi LDH utgivelsen analysen på kultur supernatant. Figur 2 viser at wild type makrofager gjennomgå celledød etter eksponering for nigericin. Derimot slipp makrofager mangelfull i caspase-1 ikke LDH i cellen nedbryting, indikerer at cellene er intakt.

Figure 1
Figur 1: FAM-YVAD-FMK og anti-ASC merking. (A) Wild type (WT) og (B) caspase-1/11 mangelfull (c1/11- / -) makrofager ble utsatt for 5 μM nigericin 1t og analysert for aktive caspase-1 av AC confocal mikroskopi bruker FAM-YVAD-FMK for å oppdage aktive caspase-1 og anti-ASC primære og geit-anti-mus sekundære antistoffer å oppdage ASC fokusere formasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: LDH utgivelsen analyseresultatene. Wild type og caspase-1/11 mangelfull makrofager ble utsatt for 5 μM nigericin 1t og celle supernatant ble analysert for tilstedeværelsen av LDH. Dataene er betyr ± SD av tre replikat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette manuskriptet har vi presentert to teknikker for å undersøke inflammasome aktivisering og konsekvensen av caspase-1 aktivisering etter NLRP3 stimulering i murine Ben margtransplantasjon-avledet makrofager. Den første teknikken gjør forskeren å bestemme nivået av caspase-1 aktivisering på cellular basis med fluorescerende reporteren FAM-YVAD-FMK. Denne reporteren er svært spesifikke for bindende caspase-1 familien av enzymer som sett av fraværet av farging i caspase-1/11 mangelfull makrofager. Spesifisitet ble også vist av LaRock et al. i sitt manuskript som beskriver rollen Yersinia protein YopM på caspase-1 aktivisering. I sitt manuskript viser de at FAM-YVAD-FMK foci overlapper med fokus som ble merket med antistoffer rettet mot caspase-117.

Som tilfellet er med noen forsøk, finnes det noen avgjørende skritt som må følges for å eliminere falske positive resultater. Først av alt, er det viktig å bruke både wild type og caspase-1/11 mangelfull makrofager. Ved å bruke disse to celletyper, kan forhold som fører til ikke-spesifikk farging bli ekskludert fra videre analyse. Andre, som med alle antistoff eller aktivitet sonde merking analysen, er det viktig å grundig vaske cellene etter farging med FAM-YVAD-FMK. Ved hjelp av tre 5 min vasker, er nivået på bakgrunn signal sterkt redusert. En tredje kritiske trinnet oppstår under installasjonen av AC confocal mikroskop. Her er det viktig at ubehandlet celler merket med FAM-YVAD-FMK brukes til å angi forskyvningen av AC confocal mikroskopet slik at ingen positive cytoplasma flekker er observert i ubehandlet cellene. Når disse trinnene er fulgt, er denne teknikken en nyttig verktøyet å vurdere aktivering av caspase-1 på cellular basis.

Denne protokollen kan endres behovene forskere. For eksempel kan cellene behandles med små molekylvekt forbindelser på flere trinn under hele prosessen. Dette ville tillate for identifikasjon av veier som modulerer oligomerization av Review, rekruttering av ASC eller pro-caspase-1, eller aktivering av caspase-1 selv. Endringer i denne protokollen må være slik at de ikke aktiverer caspase-1 av seg selv. Hvis dette skjer, kreves en dose respons kurve av stoffet i spørsmålet. Selv om vi fokusert på aktivering av NLRP3 inflammasome, kan denne protokollen også brukes til å undersøke inflammasomes utløst av andre PRRs. En annen endring har vi inkludert i dette manuskriptet er kombinasjonen av FAM-YVAD-FMK flekker med antistoff merking av inflammasome komponenter. Vi viser at det er co lokalisering av inflammasome adapteren ASC aktive caspase-1. En begrensning av denne metoden er som beskrevet, at det krever tilgang til AC confocal mikroskop. En relatert strategi å oppdage ASC fokus dannelsen av flowcytometri har imidlertid vært rapportert20,21.

Den andre metoden vi diskuterte tillater for rask påvisning av cellen lysis bruker LDH utgivelsen analysen. Det er viktig å merke seg at LDH utgivelsen viser tap av plasma membranen integritet og celle lysis, som også oppstår under mange andre former for celledød, og er ikke spesifikke for pyroptosis. Bruk av caspase-1 mangelfull celler kan imidlertid identifisere caspase-1-avhengig celle lysis, et definerende trekk ved pyroptosis.

Et viktig skritt i denne protokollen (spesielt når du bruker en smittsomme agent) er å sentrifuge platen etter seeding cellene i en 96 godt plate. Sentrifugering av platen gir lik fordeling av makrofager over hele overflaten av brønnen. Med lik fordeling, vil hver macrophage bli utsatt for samme antall bakterier. Uten sentrifugering, vil menisk effekten av væske i brønnen føre til mer makrofager samler på kanten av brønnen. Dette vil føre til lavere enn beregnet mangfold av infeksjon (MOI) nær godt veggen og høyere enn beregnet MOI midt i brønnen.

En potensiell ulempe av LDH utgivelsen analysen er at den måler lysis på befolkningsnivå og på et enkelt punkt per analysen. En alternativ tilnærming er å tallfeste opptak av celle impermeant fargestoffer av mikroskopi, som identifiserer tap av membran integritet på en enkelt celle-basis. Kombinert med levende celle imaging plattformer, kan denne tilnærmingen også gi en timelig vurdering av pyroptosis22. Liten DNA-bindende fluorescerende fargestoffer som propidium iodide eller ethidium bromide kan passere gjennom gasdermin D pore, binder mobilnettet nukleinsyrer og fluoresce5,22,23. Pore dannelse og opptak av disse små fargestoffer foran timelig terminal celle lysis. Lysis gjør opptak av større fargestoffer og tap av store mobilnettet proteiner som LDH. Bruk av glysin kan eksperimentelt uncouple pore formasjon fra lyse, glysin blokkerer ikke gasdermin D-mediert pore formasjon, lite fargestoff opptak eller IL-1β sekresjon, men glysin hindrer rask lyse og LDH release5,22 , 23 , 24. vi foreslå inkludert glysin FAM-YAVD-FMK flekker eksperimenter å hindre fullstendig tap av membran integritet, men glysin må utelates når du måler pyroptotic LDH utgivelsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre

Acknowledgments

Alle mikroskopi ble gjort på W. M. Keck mikroskopi Center med støtte av Nathaniel Peters og med støtte av NIH award S10OD016240. S.L.F. støttes av NIH K08AI119142 og R21AI130281. Vi takker Dr. Richard Flavell og Dr. Brad Cookson for caspase-1/11 mangelfull mus, og Dr. Brad Cookson for deling laboratoriefasiliteter og utstyr.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E-MEM ATCC 30-2003 For growing L929 cells
NCRC clone 929 (L929) ATCC CCL-1
Fixation/Permeabilization Kit BD Biosciences 554714 Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer. Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde
Glycine Biorad 161-0718
Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay Fisher Scientific PR-G1780 Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid
FAM-YVAD-FMK Immunocytochemistry Technologies 98
DMEM, high glucose, no glutamine Invitrogen 11960044
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red Invitrogen 31053028
Dulbecco's PBS, no calcium, no magnesium Invitrogen 14190144
Fetal Bovine Serum, qualified, US origin Invitrogen 26140079 Heat inactivated at 55°C for 50 min
Gentamicin Invitrogen 15750060
ProLong Gold Mounting Medium Invitrogen p36934 Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46
goat anti-mouse ALEXA555 Invitrogen A-21422
HEPES (Ultra Pure) Invitrogen 11344041
L-Glutamine Invitrogen 21051024
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
TO-PRO-3 Iodide Invitrogen T3605 far-red fluorescent nucleic acid stain
C57BL/6J mouse Jackson Laboratoy 000664
caspase-1/11-/- mouse Jackson Laboratory 016621
Leica SP8X Confocal Microscope Leica
Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re) List Biologicals 434
anti-ASC clone 2EI-7 Millipore-Sigma 04-417
beta-mercapto-ethanol Millipore-Sigma M6250-10ML
DMSO Millipore-Sigma D2650-5X10ML
EDTA Millipore-Sigma E5391
Spectramax M3 plate reader Molecular Devices 5000414

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jorgensen, I., Miao, E. A. Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens. Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).
  2. Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics. Nat Med. 21 (7), 677-687 (2015).
  3. Bergsbaken, T., Fink, S. L., Cookson, B. T. Pyroptosis: host cell death and inflammation. Nat Rev Microbiol. 7 (2), 99-109 (2009).
  4. Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
  5. Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cell Microbiol. 8 (11), 1812-1825 (2006).
  6. Bergsbaken, T., Fink, S. L., den Hartigh, A. B., Loomis, W. P., Cookson, B. T. Coordinated host responses during pyroptosis: caspase-1-dependent lysosome exocytosis and inflammatory cytokine maturation. J Immunol. 187 (5), 2748-2754 (2011).
  7. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  8. Sutterwala, F. S., Haasken, S., Cassel, S. L. Mechanism of NLRP3 inflammasome activation. Ann N Y Acad Sci. 1319, 82-95 (2014).
  9. Juliana, C., et al. Non-transcriptional priming and deubiquitination regulate NLRP3 inflammasome activation. J Biol Chem. 287 (43), 36617-36622 (2012).
  10. Py, B. F., Kim, M. S., Vakifahmetoglu-Norberg, H., Yuan, J. Deubiquitination of NLRP3 by BRCC3 critically regulates inflammasome activity. Mol Cell. 49 (2), 331-338 (2013).
  11. Song, N., et al. NLRP3 Phosphorylation Is an Essential Priming Event for Inflammasome Activation. Mol Cell. 68 (1), 185-197 (2017).
  12. Stutz, A., et al. NLRP3 inflammasome assembly is regulated by phosphorylation of the pyrin domain. J Exp Med. 214 (6), 1725-1736 (2017).
  13. Broz, P., Dixit, V. M. Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling. Nat Rev Immunol. 16 (7), 407-420 (2016).
  14. Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. J Biol Chem. 274 (48), 33835-33838 (1999).
  15. Yamamoto, M., et al. ASC is essential for LPS-induced activation of procaspase-1 independently of TLR-associated signal adaptor molecules. Genes Cells. 9 (11), 1055-1067 (2004).
  16. Miao, E. A., Rajan, J. V., Aderem, A. Caspase-1-induced pyroptotic cell death. Immunol Rev. 243 (1), 206-214 (2011).
  17. LaRock, C. N., Cookson, B. T. The Yersinia virulence effector YopM binds caspase-1 to arrest inflammasome assembly and processing. Cell Host Microbe. 12 (6), 799-805 (2012).
  18. Swanson, M. S., Isberg, R. R. Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum. Infect Immun. 63 (9), 3609-3620 (1995).
  19. Miller, S. I., Ernst, R. K., Bader, M. W. LPS, TLR4 and infectious disease diversity. Nat Rev Microbiol. 3 (1), 36-46 (2005).
  20. Sester, D. P., et al. A novel flow cytometric method to assess inflammasome formation. J Immunol. 194 (1), 455-462 (2015).
  21. Sester, D. P., et al. Assessment of Inflammasome Formation by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2016).
  22. DiPeso, L., Ji, D. X., Vance, R. E., Price, J. V. Cell death and cell lysis are separable events during pyroptosis. Cell Death Discov. , (2017).
  23. Russo, H. M., et al. Active Caspase-1 Induces Plasma Membrane Pores That Precede Pyroptotic Lysis and Are Blocked by Lanthanides. J Immunol. 197 (4), 1353-1367 (2016).
  24. Evavold, C. L., et al. The Pore-Forming Protein Gasdermin D Regulates Interleukin-1 Secretion from Living Macrophages. Immunity. , (2017).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 135 immunologi medfødt immunitet inflammasome caspase-1 ASC NLRP3 pyroptosis nigericin murine Ben margtransplantasjon-avledet makrofager
Deteksjon av Inflammasome aktivisering og Pyroptotic celle død i Murine Ben margtransplantasjon-avledet makrofager
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

den Hartigh, A. B., Fink, S. L.… More

den Hartigh, A. B., Fink, S. L. Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages. J. Vis. Exp. (135), e57463, doi:10.3791/57463 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter