Summary
Vi beskriver påvisande av NLRP3 inflammasome aktiveringen på cellulära basis använda fluorescensmikroskopi och färgning för aktiva kaspas-1 och adapter, ASC. En laktatdehydrogenas release assay presenteras för att upptäcka pyroptotic Lys på basis av befolkningen. Dessa tekniker kan anpassas för att studera många aspekter av inflammasome biologi.
Abstract
Inflammasomes är medfödd immun signalering plattformar som krävs för framgångsrik bekämpning av många patogena organismer, men också främja inflammatoriska och autoinflammatoriska sjukdomar. Inflammasomes aktiveras av cytosoliska mönster erkännande receptorer, inklusive medlemmar av familjen nicka-like receptor (NLR). Dessa receptorer oligomerize vid detektion av mikrobiell eller skada-associerade stimuli. Efterföljande rekrytering av proteinet adapter ASC bildar ett mikroskopiskt synlig inflammasome komplex, som aktiverar kaspas-1 genom närhet-inducerad auto-aktivering. Efter aktiveringen klyver kaspas-1 pro-IL-1β och pro-IL-18, vilket leder till aktivering och utsöndring av dessa pro-inflammatoriska cytokiner. Kaspas-1 förmedlar också inflammatoriska form av celldöd kallas pyroptosis, vilken dragen förlusten av membran integritet och cell lysis. Kaspas-1 klyver gasdermin D, släppa den N-terminala fragment som bildar plasmamembranet porer, vilket leder till osmotisk Lys.
In vitro, aktivering av kaspas-1 kan bestämmas genom märkning benmärg-derived makrofager med sonden kaspas-1-aktiviteten FAM-YVAD-FMK och märkning cellerna med antikroppar mot proteinet adapter ASC. Denna teknik möjliggör identifiering av inflammasome bildning och kaspas-1 aktivering i enskilda celler med fluorescensmikroskopi. Pyroptotic celldöd kan upptäckas genom att mäta utsläpp av cytosoliska laktatdehydrogenas i mediet. Proceduren är enkel, kostnadseffektiv och utförda i en plattan med 96 brunnar format, tillåter anpassning för screening. I detta manuskript visar vi att aktivering av den NLRP3-inflammasome av nigericin leder till samtidig localizationen av adapter protein ASC och aktiva kaspas-1, vilket leder till pyroptosis.
Introduction
Inflammasome-medierad inflammation är en viktig del av försvaret mot patogena organismer1, men ligger också bakom etiologi av många sjukdomar2. Den inflammatoriska reaktionen till en rad infektioner utlöses av cytosoliska upptäckt av patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs) eller skador associerade molekylära mönster (dämpar). Mönster erkännande receptorer (PRR), däribland medlemmar av familjen nicka-like receptor (NLR), oligomerize vid påvisande av dessa PAMPs och dämpar. Detta utlöser bildandet av flera proteinkomplex som kallas den inflammasome, som innehåller PRR, proteinet adapter apoptos-associerade speck-liknande protein som innehåller en C-terminal kaspas-rekrytering domän (kort) (ASC) och Pro form av kaspas-13,4. Detta komplex tillåter närhet-inducerad auto-aktivering av kaspas-1. Aktiva kaspas-1 leder sedan till en uppsättning händelser som är karakteristiska för den inflammatoriska celler död väg pyroptosis. Dessa händelser inkluderar: den klyvning och lanseringen av den inflammatoriska cytokiner IL-1β och IL-18, Lysosomen exocytos med utsättning av lysosomala innehållet i den extracellulära, nukleär kondensation och gasdermin D klyvning. Släppta N-terminala domänen för gasdermin D infogar i plasmamembranet, bildar porer som orsakar plasmamembranet bristning och frisättning av inflammatoriska innehållet, förutom att ta bort en skyddande nisch för patogen replikering5, 6 , 7.
Här fokuserar vi på de väl studerat NLRP3-inflammasome. Aktivering av den NLRP3-inflammasome sker genom en två-stegs process8. Det första ”priming” steget sker genom erkännande av Toll-liknande receptorer (TLR) av en mikrobiell produkt. Detta replikeras i inställningen laboratorium med hjälp av LPS för att stimulera TLR4. Denna stimulering uppreglerar NLRP3 och pro-IL-1β genom NF-kB signalering. Grundning dessutom licenser NLRP3 genom icke-transkriptionell mekanismer genom att inducera dess deubiquitination9,10 och fosforylering eller Defosforylering av specifika rester11,12.
Den andra signalen för NLRP3 aktivering tros innebära mitokondriell faktorer, reaktiva syreradikaler, kalium efflux och calcium signalering, även om en enande mekanism för NLRP3 aktivering fortfarande gäckande8. Aktiverade NLRP3 oligomerizes genom samverkan mellan dess NACHT domäner och rekryterar ASC via bindning av pyrin (PYD) domäner13. I varje cell bildar dessa makromolekylärt komplex en enda mikroskopiskt synlig fokus. ASC identifierades ursprungligen som ett 22 KDa-protein som bildar en ”speck” under apoptos mänskliga leukemiceller och namngivna apoptos-associerade speck-liknande protein som innehåller en kort14. Det fastställdes senare att ASC rekryterar pro-kaspas-1 genom samverkan mellan kortet i ASC med kortet för pro-kaspas-1, bildar de inflammasome15.
Inte alla NLR kräver närvaro av ASC inducera kaspas-1 aktivering. Till skillnad från NLRP3, NLRC4 och NLRP1b har kort domäner och direkt kan rekrytera pro-kaspas-1 via kort-kort interaktioner att inducera kaspas-1 aktivering. I avsaknad av ASC, aktiva kaspas-1 fortfarande diffust i hela cytosolen och utgör inte en enda fokus. Denna diffusa aktiva kaspas-1 är tillräcklig för att framkalla pyroptotic celldöd, men inte behandla pro-IL-1β13,16.
I detta manuskript, kommer vi att diskutera två sätt att bedöma inflammasome aktivering. Först använder aktiviteten fluorescerande sond, FAM-YVAD-FMK, som binder kaspas-1 familjen av proteaser. Denna familj omfattar kaspas-1, men även mus kaspas-11 och mänskliga kaspas-4 och kaspas-5. Med hjälp av makrofager från kaspas-1/11 bristfällig möss i alla experiment, behandlas specificiteten av denna sond. Denna metod kan kombineras med antikropp märkning av inflammasome komponenter, som vi också kommer att beskriva. Mikroskopiska visualisering möjliggör identifiering av enskilda celler som innehåller aktiva kaspas-1 och oligomerized ASC. Med den här metoden kommer forskare att kunna avgöra var i inflammasome formation kaskad sina manipulationer av värdcellen eller den patogena organismen under studien har en effekt. Man kan till exempel skilja oavsett om en viss intervention förhindrar rekrytering av ASC till den komplexa NLRP3 eller de efterföljande rekrytering och aktivering av kaspas-117. Granskar resultat av kaspas-1 aktivering såsom IL-1β sekretion skulle inte kunna skilja mellan dessa två möjligheter. Utsöndring av IL-1β kan också ändras utan att ändra celler förmågan att aktivera kaspas-1 och genomgå pyroptotic cell död16.
Den andra metoden mäter utsläpp av laktatdehydrogenas (LDH) i cellen supernatanten, som inträffar under pyroptotic makrofag lysis efter kaspas-1 aktivering som beskrivs ovan. Denna andra metod är ett populationsbaserat tillvägagångssätt som lanseringen av LDH i hela väl mäts. Denna enkla metod tillåter snabb analys (30 min av inkubationstiden) av prover för att avgöra om det finns kaspas-1-medierad celldöd och kan utföras i ett format som plattan med 96 brunnar.
Dessa metoder är kompletterande, alla med olika fördelar, och båda är lätt bli föremål för ändringar. Makrofag behandling med riktade liten molekylvikt föreningar före inflammasome stimulering kan exempelvis användas för att undersöka rollen vissa proteiner kan ha på att kontrollera inflammatoriskt svar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur förfaranden godkändes och genomfördes enligt University of Washington institutionella djur vård och användning kommittén riktlinjer.
1. skörden av benmärg
- Aseptiskt bort lårben och skenben från en mus och rengör ben med hjälp av sterila instrument. Placera de rengjorda ben i Dulbecco modifierade Eagle Medium (DMEM) + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL L-glutamin + 0,05 mM 2-merkaptoetanol + 50 mg/mL gentamicin sulfat + 10.000 U/mL penicillin/streptomycin + 10% fetalt bovint serum (FBS, DMEM-10 komplett) och inkubera i röret på is i 15 min.
- Ta bort de proximala och distala kulleder med sax. Infoga en 25 G injektionsnål till en 10 mL spruta fylld med medium i fördjupningen av ben. Spola ut benmärgen med DMEM-10 komplett. Återsuspendera alla klumpar av pipettering mediet upp och ner försiktigt.
- Centrifugera cellerna för 10 min vid 300 x g och räkna antalet celler med hjälp av en hemocytometer. Vid denna punkt, antingen frysa cellerna använder 90% FBS + 10% dimetyl sulfoxid (DMSO) eller platta celler i en 15 cm petriskål att särskilja makrofager använder L929 luftkonditionerade medium (steg 2.1).
2. differentiering av benmärgen-derived makrofager
- På förhand värmde differentiering medium (21 mL DMEM-10 komplett och 9 mL av L929 cell luftkonditionerade medium som beskrivs av Swanson et al. ( 18), icke-vävnadskultur sätta benmärgsceller i en 15 cm och behandlade petriskål (1,2-1,5 x 107 celler). Inkubera plattan vid 37 ° C och 5% CO2 i 7 dagar. Lägga till ytterligare 30 mL av differentiering medium till plattan på dag 3 eller 4.
Obs: Det är viktigt att inte använda vävnadsodling behandlade plattor, som makrofager kommer att bli svårt att lossa och skörda. - Att samla makrofager, tvätta plattan med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och tillsätt 20 mL kall PBS + 1 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA). Inkubera plattan vid 4 ° C i 10 min. skörd cellerna genom pipettering av PBS + EDTA över cellerna och tvätta plattan med 10 mL PBS. Kombinera båda tvättar till två 15 mL koniska rör.
- Centrifugera cellerna vid 300 x g i 10 min och resuspendera cellerna i 10 mL fenol-röd Gratis DMEM + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL L-glutamin + 0,05 mM 2-merkaptoetanol + 5% FBS (DMEM-5) och räkna cellerna med antingen en hemocytometer eller en Coulter räknare. Hålla cellerna på is under räkna.
- Frö makrofager i vävnadsodling belagda plattor på 2 x 105 celler/mL. För mikroskopi experiment, utsäde 1 mL celler på coverslips i 24 plattor. För LDH release analyser, utsäde 100 µL av celler i en 96 väl platta. För LDH analysen, utsäde 9 wells (3 brunnar obehandlad, 3 brunnar med 100% lysis kontroller och 3 brunnar för den experimentella stimulansen).
- Centrifugera 96 väl plattan för 5 min vid 300 x g att göra vissa celler fördelas lika över brunnen.
- Inkubera plattan över natten vid 37 ° C + 5% CO2 innan grundlackeringsprocessen.
3. priming
- Ersätta mediet med färska medium (DMEM-5) innehållande 100 ng/mL LPS (500 μL för 24 väl plåt eller 50 μl för 96 väl plåt).
Obs: Det finns en mängd olika strukturella variationer i LPS, som påverkar förmågan att stimulera TLR4-medierad priming19. LPS från Salmonella minnesota R595 (Re) är tillgänglig från flera leverantörer och rekommenderas. - Inkubera plattan för 3 h vid 37 ° C och 5% CO2.
4. aktivering av den NLRP3-Inflammasome med Nigericin och märkning med FAM-YVAD-FMK
- Ta bort mediet och ersätta det med 290 μL av DMEM-5 innehållande 5 μM nigericin och 5 mM glycin. Glycin läggs till minska mängden cellys som uppstår under kaspas-1 aktivering5. Inkubera under 60 minuter vid 37 ° C och 5% CO2. Använd både vildtyp och kaspas-1 bristfällig makrofager för att säkerställa att den observerade märkning är specifika för kaspas-1.
- Under de sista 45 min, tillsätt 10 μL av 30 x FAM-YVAD-FMK, beredd enligt tillverkarens anvisningar.
- Efter 60 min, ta bort mediet och tvätta cellerna tre gånger för 5 min varje med 1 mL kall PBS.
- Tillsätt 250 μL av 2% PARAFORMALDEHYD till varje brunn och inkubera på is täckt med aluminiumfolie i 30 min.
- Under de sista 5 min, tillsätt 4 μL av 0,2 mM mån fluorescerande nukleinsyra fläcken att märka atomkärnor. 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) eller andra färgämnen kan också användas till etiketten DNA.
- Tvätta cellerna tre gånger med 1 mL kall PBS och montera coverslips på objektglas med 7 μl anti fade monteringsmedium. Låt den monteringsmedium härda över natten innan tätning på täckglas till Mikroskop bild använder nagellack.
- Bild makrofager av konfokalmikroskopi. Ex / Em för FAM-YVAD-FMK är 492/520nm och 642/661 för mån fluorescerande nukleinsyra fläcken. Se till att ange mikroskopet så att obehandlad celler inte visar någon bakgrund färgning i kanalen 488. Annars blir bakgrundsfärgning FAM-YVAD-FMK upptäckta och inte faktiska aktiva kaspas-1.
Obs: Mikroskop set-up beskrivs i avsnitt 6.
5. antikropp färgning
Obs: Etikett cellerna med antikroppar att upptäcka ASC, utsäde, prime och exponera cellerna till nigericin identisk med föregående avsnitt. Behandling därefter är följande:
- Tvätta cellerna tre gånger för 5 min varje med 1 mL kall PBS. Tillsätt 250 μL av fixering och permeabilisering lösning. Inkubera cellerna på is, och täckt i 30 min.
- Tvätta makrofager tre gånger för 5 min varje med 1 mL av tvättbuffert.
- Tillsätt 250 μL av primär antikropp mot ASC utspädd 1: 500 i tvättbuffert och inkubera i 1 h på is. Inkludera ett täckglas som inte får någon primär antikropp, men får bara sekundärt. Detta täckglas används under installationen av mikroskopet ställa rätt offset.
- Tvätta cellerna tre gånger för 5 min varje med 1 mL tvättbuffert.
- Lägga till 250 μL av sekundär antikropp (fluorescerande färgämne-konjugerade get-anti-mus) utspädd 1: 500 i tvättbuffert och inkubera i 1 h på is. Tillsätt 4 μL av 0,2 mM mån fluorescerande nukleinsyra fläcken för de sista 5 min i denna inkubation till etikett kärnor.
- Tvätta cellerna 3 x med 1 mL kall tvättbuffert och montera coverslips på mikroskopet glider med 7 μl anti fade monteringsmedium. Låt den monteringsmedium härda över natten innan tätning på täckglas till Mikroskop bild med genomskinligt nagellack.
- Bild makrofager av konfokalmikroskopi. Ex / Em för den sekundära antikroppen är 555/580 nm och 642/661 för mån fluorescerande nukleinsyra fläcken (som beskrivs nedan).
Obs: Märkning med FAM-YVAD-FMK och antikropp märkning kan kombineras för att Visa samtidig lokalisering av aktiva kaspas-1 och ASC. För detta följer villkoren för FAM-YVAD-FMK märkning och växla sedan till antikroppen märkning protokollet för vidare bearbetning.
6. avbildning av märkt makrofager av konfokalmikroskopi
Obs: De färgade cellerna kan ses efter coverslips har tillåtits att bota över natten och har förseglats till Mikroskop bild med nagellack. Här beskrivs imaging med confocal Mikroskop. Cellerna kan också ses genom standard fluorescensmikroskopi.
- Placera bilden med kontrollgrupp celler på Mikroskop scenen och fokusera mikroskopet på cellerna.
- Använda mikroskopet leta upp tabellen (LUT) justera inställningar, förskjutningen för sådan att det finns ingen positiv FAM-YVAD-FMK färgning i obehandlad cellerna. Denna process kan också utföras med kaspas-1 bristfällig makrofager.
Obs: Offset måste justeras för varje kanal som används i experimentet, men ställa rätt offset är mest kritiska för FAM-YVAD-FMK kanal och fluorescerande antikropp kanaler. Förskjutningen för kanalen DNA är mindre kritiska. När förskjutningen har ställts in, inte justera inställningen för resten av experimentet. - Växla bilden till nigericin behandlas provet. Hitta ett fält som innehåller båda cellerna som är positiva och negativa för FAM-YVAD-FMK färgning. Justera med FAM-YVAD-FMK kanalen till planet som har den högsta intensiteten av positiv färgning imaging plan. Detta kommer normalt att planet där stadens inflammasome fokus är avbildade.
- Justera känsligheten så att foki är synliga i celler som har kondenserad atomkärnor. Efter inställning både gain och offset, lämna dessa inställningar för resten av bildsession.
Obs: Ett enkelt sätt att avgöra om en cell är pyroptotic är genom att titta på nukleära morfologi. Celler med aktiva kaspas-1 har rundade och kondenserade kärnor, medan nukleolerna är synliga i celler utan kaspas-1 aktivering och nukleära morfologi är liknande dem i obehandlad celler. - Samla bilder av 5 slumpmässigt utvalda fält på 100 X total förstoring. Detta medför normalt ca 40 celler per bild. Upprepa processen för varje prov.
- Räkna antalet celler i varje bild med bild analys programvara. Sedan räkna antalet celler som har positiva FAM-YVAD-FMK färgning. Representera nivån på kaspas-1 aktivering som procentuella andelen FAM-YVAD-FMK positiva celler.
7. LDH Release Assay
Obs: För LDH release analysen, utsäde och prime cellerna som beskrivs i föregående avsnitt, utom använda en 96 väl platta. Ta inte bort mediet efter grundningen.
- Tillsätt 50 μL av DMEM-5 innehållande 10 μM nigericin till experimentella brunnarna och 50 μL DMEM-5 till spontana och 100% Lys-kontrollbrunnarna. Lägg inte till glycin i detta experiment eftersom målet är att mäta cell Lys. Inkubera under 60 minuter vid 37 ° C och 5% CO2.
- Efter 30 min, tillsätt 10 μL 10 x lyseringsbuffert till 100% lysis kontrollbrunnarna och tillsätt 10 μL av DMEM-5 till de andra brunnarna. Under denna inkubation, ta 1 injektionsflaska av substrat mix (1,5 mL frystorkat substrat) och 1 alikvot av analysbuffert (~ 12 mL) från frysen och låt dem Tina skyddade från ljus till rumstemperatur.
Obs: Substrat mixen innehåller ett tetrazolium salt (iodonitro-tetrazolium violet), som omvandlas till en röd formazan produkt. - Efter 60 min totala ruvning, Centrifugera plattan för 5 min vid 500 x g vid 10 ° C. Överför 50 μL av supernatanten till en tydlig platt-bottenplatta. Under denna tid tillsätt 12 mL analysbuffert till injektionsflaskan med substrat mix och odla i rumstemperatur i 5 min innan du använder.
- Tillsätt 50 μL av substrat till varje brunn och inkubera i 30 min i mörker. Innehåller medlet bara brunnar för tomma värden. Kolla plåten efter 15 min att se till att signalen inte kommer att överstiga gränsen för upptäckt av plattan läsaren.
- Efter 30 min, tillsätt 50 μL stopplösning (1 M ättiksyra) och mäta OD490 med hjälp av en tallrik-läsare.
- Beräkna procentandelen av cellen lysis med följande formel:
% Cytotoxicitet = ((Experimental-Spontaneous) / (maximal-spontana)) × 100
Experimentell: nigericin behandlade celler; spontan: obehandlad celler; högsta: celler utsätts för lyseringsbuffert
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att upptäcka kaspas-1 aktivering efter exponering för nigericin, bearbetades cellerna enligt beskrivningen i avsnittet protokoll. Vi kombinerat både FAM-YVAD-FMK och ASC antikropp märkning för att visa att ASC och aktiva kaspas-1 Co lokalisera efter NLRP3-medierad inflammasome aktivering. Figur 1A visar att vildtyp makrofager utsätts för 5 μM nigericin har bildandet av ett ASC fokus i regionen perinukleära. Dessa foci även innehålla aktiva kaspas-1 som ses av samtidig localizationen av ASC med FAM-YVAD-FMK. De celler som är positiva för aktiva kaspas-1 har nukleär kondensation visar att dessa celler genomgår pyroptosis. Figur 1B visar att medan makrofager kaspas-1/11 bristfällig möss har bildandet av ett ASC fokus, de inte har någon aktiv kaspas-1 är associerad med detta fokus som visas av avsaknaden av FAM-YVAD-FMK färgning. Atomkärnor av dessa celler inte kondenseras, som anger att det finns ingen pyroptotic cell döden inträffar. Bilder är tagna med skanning confocal Mikroskop med en 63 X oljeimmersionsobjektivet. Bilder har sparats som TIFF-filer utan vidare bearbetning.
För att bestämma nivån på celldöd som är associerade med exponering för nigericin, utfört vi en LDH release assay på kulturen supernatant. Figur 2 visar att vildtyp makrofager undergår celldöd efter exponering för nigericin. Makrofager bristfällig i kaspas-1 däremot inte släppa LDH i cell supernatanten, tyder på att cellerna är intakt.
Figur 1: FAM-YVAD-FMK och anti-ASC märkning. (A) Wild type (WT) och (B) kaspas-1/11 deficient (c1/11- / -) makrofager var utsatt för 5 μM nigericin för 1 h och analyseras för aktiva kaspas-1 av konfokalmikroskopi med FAM-YVAD-FMK för att upptäcka aktiv kaspas-1 och anti-ASC primär- och get-anti-mus sekundära antikroppar att upptäcka ASC fokusera bildandet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: LDH release assay resultat. Vildtyp och kaspas-1/11 bristfällig makrofager utsattes för 5 μM nigericin för 1 h och cell supernatant var analyseras för förekomst av LDH. Uppgifterna är medel ± SD för tre replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta manuskript, har vi presenterat två tekniker för att undersöka inflammasome aktivering och följden av kaspas-1 aktivering NLRP3 stimulering i murina benmärg-derived makrofager. Den första tekniken gör det möjligt för forskaren att bestämma nivån på kaspas-1 aktivering på en cellulär grundval fluorescerande reportern FAM-YVAD-FMK. Denna reporter är mycket specifika för bindande kaspas-1 familjen av enzymer, som ses av avsaknad av färgning i kaspas-1/11 bristfällig makrofager. Specificitet visades också av LaRock et al. i deras manuskript som beskriver rollen av proteinet Yersinia YopM på kaspas-1 aktivering. I deras manuskript visar de att FAM-YVAD-FMK foci överlappar foci som var märkt med antikroppar riktade mot kaspas-117.
Som är fallet med alla experiment, finns det några viktiga steg som måste följas för att eliminera falska positiva resultat. Först av allt, är det absolut nödvändigt att använda både vildtyp och kaspas-1/11 bristfällig makrofager. Genom att använda dessa två celltyper, kan villkor som leder till icke-specifik färgning undantas från ytterligare analys. Andra, som med någon antikropp eller aktivitet probe märkning assay, det är viktigt att tvätta cellerna efter färgning med FAM-YVAD-FMK. Genom att använda tre 5 min tvättar, minskas bakgrunden signalnivå avsevärt. En tredje kritiska steget uppstår under installationen av mikroskopet confocal. Här är det viktigt att obehandlad celler märkta med FAM-YVAD-FMK används till att ange förskjutningen av mikroskopet confocal på ett sådant sätt att ingen positiv cytoplasmisk färgning iakttas i obehandlad cellerna. När dessa steg följs, är denna teknik ett användbart verktyg för att bedöma aktivering av kaspas-1 på grundval av cellulära.
Detta protokoll kan ändras så att de passar forskare. Cellerna kan till exempel behandlas med små molekylvikt föreningar i flera steg under hela processen. Detta skulle möjliggöra identifiering av vägar som modulerar oligomerisering av NLR, rekrytering av antingen ASC eller pro-kaspas-1, eller aktiveringen av kaspas-1 själv. Ändringarna i detta protokoll måste vara sådana att de inte aktiverar kaspas-1 själv. Om detta inträffar, krävs en dos-responskurva av läkemedlet i fråga. Även om vi fokuserar på aktivering av den NLRP3-inflammasome, kan detta protokoll också användas att undersöka inflammasomes utlöses av andra PRRs. En annan ändring har vi inkluderat i detta manuskript är kombinationen av FAM-YVAD-FMK färgning med antikropp märkning av inflammasome komponenter. Vi visar att det finns samtidig lokalisering av inflammasome adaptern ASC med aktiva kaspas-1. En begränsning med denna metod är som beskrivs, att den kräver tillgång till en confocal mikroskopet. En relaterad strategi att upptäcka ASC fokus bildandet av flödescytometri har dock varit rapporterade20,21.
Den andra tekniken vi diskuterade möjliggör snabb påvisande av cellys använder en LDH release assay. Det är viktigt att notera att LDH release indikerar förlust av plasmamembranet integritet och cell lysis, vilket också sker vid många andra former av celldöd, och är inte specifika för pyroptosis. Användning av kaspas-1 bristfällig celler kan dock identifiera kaspas-1-beroende cellys, ett avgörande inslag i pyroptosis.
Ett avgörande steg i detta protokoll (särskilt när ett smittämne) är att Centrifugera plattan efter sådd cellerna i en 96 väl platta. Centrifugering av plattan möjliggör jämn fördelning av makrofager över hela ytan av brunnen. Med lika fördelning, kommer varje makrofag att utsättas för samma antal bakterier. Utan centrifugering, kommer att menisken effekten av vätskan i brunnen leda till fler makrofager ansamlas vid kanten av brunnen. Detta skulle leda till lägre än avsedda multiplicity av infektion (MOI) nära väl väggen och högre än avsett MOI i mitten av brunnen.
En potentiell nackdel med LDH release analysen är att den mäter Lys på befolkningsnivå och vid en enda tidpunkt per analys. En alternativ metod är att kvantifiera upptag av cell impermeant färgämnen genom mikroskopi, som identifierar förlust av membran integritet på basis av enstaka cell. Kombinerat med levande cell imaging plattformar, kan detta synsätt också ge en temporal bedömning av pyroptosis22. Litet DNA-bindande fluorescerande färgämnen såsom propidium jodid eller etidiumbromid kan passera genom gasdermin D pore, binda cellular nucleic syror och fluorescerar i5,22,23. Pore bildandet och upptag av dessa små färgämnen föregår temporally terminal cellys. Lysis tillåter upptag av större färgämnen och förlust av stora cellulära proteiner såsom LDH. Användning av glycin kan försöksvis uncouple pore formation från Lys, glycin blockerar inte gasdermin D-medierad pore bildandet, små dye upptag eller IL-1β sekretion, men glycin hindrar snabb Lys och LDH release5,22 , 23 , 24. vi föreslår inklusive glycin i FAM-YAVD-FMK färgning experiment att förhindra total förlust av membran integritet, men glycin måste utelämnas när man mäter pyroptotic LDH release.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter avslöja
Acknowledgments
Alla mikroskopi gjordes på W. M. Keck mikroskopi Center med stöd av Nathaniel Peters och med stöd av NIH award S10OD016240. S.L.F. stöds av NIH K08AI119142 och R21AI130281. Vi tackar Dr. Richard Flavell och Dr Brad Cookson för kaspas-1/11 bristfällig möss, och Dr Brad Cookson för att dela laboratorier och utrustning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E-MEM | ATCC | 30-2003 | For growing L929 cells |
| NCRC clone 929 (L929) | ATCC | CCL-1 | |
| Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer. Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde |
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay | Fisher Scientific | PR-G1780 | Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid |
| FAM-YVAD-FMK | Immunocytochemistry Technologies | 98 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Invitrogen | 11960044 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Dulbecco's PBS, no calcium, no magnesium | Invitrogen | 14190144 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin | Invitrogen | 26140079 | Heat inactivated at 55°C for 50 min |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750060 | |
| ProLong Gold Mounting Medium | Invitrogen | p36934 | Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46 |
| goat anti-mouse ALEXA555 | Invitrogen | A-21422 | |
| HEPES (Ultra Pure) | Invitrogen | 11344041 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| TO-PRO-3 Iodide | Invitrogen | T3605 | far-red fluorescent nucleic acid stain |
| C57BL/6J mouse | Jackson Laboratoy | 000664 | |
| caspase-1/11-/- mouse | Jackson Laboratory | 016621 | |
| Leica SP8X Confocal Microscope | Leica | ||
| Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re) | List Biologicals | 434 | |
| anti-ASC clone 2EI-7 | Millipore-Sigma | 04-417 | |
| beta-mercapto-ethanol | Millipore-Sigma | M6250-10ML | |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650-5X10ML | |
| EDTA | Millipore-Sigma | E5391 | |
| Spectramax M3 plate reader | Molecular Devices | 5000414 |
References
- Jorgensen, I., Miao, E. A. Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens. Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).
- Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics. Nat Med. 21 (7), 677-687 (2015).
- Bergsbaken, T., Fink, S. L., Cookson, B. T. Pyroptosis: host cell death and inflammation. Nat Rev Microbiol. 7 (2), 99-109 (2009).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cell Microbiol. 8 (11), 1812-1825 (2006).
- Bergsbaken, T., Fink, S. L., den Hartigh, A. B., Loomis, W. P., Cookson, B. T. Coordinated host responses during pyroptosis: caspase-1-dependent lysosome exocytosis and inflammatory cytokine maturation. J Immunol. 187 (5), 2748-2754 (2011).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Sutterwala, F. S., Haasken, S., Cassel, S. L. Mechanism of NLRP3 inflammasome activation. Ann N Y Acad Sci. 1319, 82-95 (2014).
- Juliana, C., et al. Non-transcriptional priming and deubiquitination regulate NLRP3 inflammasome activation. J Biol Chem. 287 (43), 36617-36622 (2012).
- Py, B. F., Kim, M. S., Vakifahmetoglu-Norberg, H., Yuan, J. Deubiquitination of NLRP3 by BRCC3 critically regulates inflammasome activity. Mol Cell. 49 (2), 331-338 (2013).
- Song, N., et al. NLRP3 Phosphorylation Is an Essential Priming Event for Inflammasome Activation. Mol Cell. 68 (1), 185-197 (2017).
- Stutz, A., et al. NLRP3 inflammasome assembly is regulated by phosphorylation of the pyrin domain. J Exp Med. 214 (6), 1725-1736 (2017).
- Broz, P., Dixit, V. M. Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling. Nat Rev Immunol. 16 (7), 407-420 (2016).
- Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. J Biol Chem. 274 (48), 33835-33838 (1999).
- Yamamoto, M., et al. ASC is essential for LPS-induced activation of procaspase-1 independently of TLR-associated signal adaptor molecules. Genes Cells. 9 (11), 1055-1067 (2004).
- Miao, E. A., Rajan, J. V., Aderem, A. Caspase-1-induced pyroptotic cell death. Immunol Rev. 243 (1), 206-214 (2011).
- LaRock, C. N., Cookson, B. T. The Yersinia virulence effector YopM binds caspase-1 to arrest inflammasome assembly and processing. Cell Host Microbe. 12 (6), 799-805 (2012).
- Swanson, M. S., Isberg, R. R. Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum. Infect Immun. 63 (9), 3609-3620 (1995).
- Miller, S. I., Ernst, R. K., Bader, M. W. LPS, TLR4 and infectious disease diversity. Nat Rev Microbiol. 3 (1), 36-46 (2005).
- Sester, D. P., et al. A novel flow cytometric method to assess inflammasome formation. J Immunol. 194 (1), 455-462 (2015).
- Sester, D. P., et al. Assessment of Inflammasome Formation by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2016).
- DiPeso, L., Ji, D. X., Vance, R. E., Price, J. V. Cell death and cell lysis are separable events during pyroptosis. Cell Death Discov. , (2017).
- Russo, H. M., et al. Active Caspase-1 Induces Plasma Membrane Pores That Precede Pyroptotic Lysis and Are Blocked by Lanthanides. J Immunol. 197 (4), 1353-1367 (2016).
- Evavold, C. L., et al. The Pore-Forming Protein Gasdermin D Regulates Interleukin-1 Secretion from Living Macrophages. Immunity. , (2017).
