Summary
في هذه الورقة، ونحن مناقشة الاستعدادات المخ الثلاثة المستخدمة لتسجيل المشبك التصحيح خلية كله للدراسة على حلبة ريتينوتيكتال من الضفادع الصغيرة ليفيس النمو . ويساهم كل إعداد، بمزاياه الخاصة، المقاييس التجريبية من شرغوف النمو كنموذج لدراسة وظيفة الدوائر العصبية.
Abstract
حلبة ريتينوتيكتال شرغوف النمو ، تتألف من خلايا العقدة الشبكية (رجكس) في العين التي تشكل synapses مباشرة على الخلايا العصبية في الألياف البصرية تيكتوم، نموذج شعبية لدراسة الدوائر العصبية كيفية تجميع ذاتي. القدرة على القيام بكل خلية تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا العصبية تيكتال، وتسجيل الاستجابات التي أثارت حكومة كمبوديا الملكية، أما في فيفو أو استخدام إعداد كامل للعقل، وقد ولدت مجموعة كبيرة من البيانات العالية الاستبانة حول الآليات الكامنة وراء العادي ، وغير طبيعي، تشكيل الدائرة والدالة. هنا ونحن تصف كيفية تنفيذ في فيفو الإعداد، إعداد كامل الدماغ الأصلي، وأكثر مؤخرا بوضع إعداد شريحة الدماغ الأفقية للحصول على تسجيلات المشبك التصحيح كل خلية من الخلايا العصبية تيكتال. إعداد كل مزايا فريدة من نوعها التجريبية. ويمكن الإعداد في فيفو تسجيل استجابة الخلايا العصبية تيكتال المباشر للمنبهات البصرية المسقطة على العين. إعداد كامل الدماغ تسمح لحكومة كمبوديا الملكية محاور عصبية لتفعيلها على نحو شديد، وإعداد شريحة الدماغ الأفقي يسمح التسجيل من عبر كل الطبقات تكتم.
Introduction
حلبة ريتينوتيكتال هو العنصر الرئيسي في النظام المرئي البرمائية. أنها تتألف من رجكس في العين، والمشروع على محاور عصبية تكتم الألياف البصرية حيث تشكل الاتصالات متشابك مع الخلايا العصبية تيكتال بوستسينابتيك. حلبة ريتينوتيكتال شرغوف النمو نموذج إنمائي شعبية لدراسة تشكيل الدوائر العصبية ووظيفة. وهناك العديد من سمات هذا شرغوف ريتينوتيكتال الدائرة التي تجعل من نموذج تجريبي قوية1،2،3. سمة رئيسية واحدة، والتركيز في هذه المقالة، هو القدرة على القيام بتسجيلات المشبك التصحيح كل خلية من الخلايا العصبية تيكتال، في فيفو أو استخدام إعداد كامل للعقل. مع منصة الكهربية لتجهيزه مع مكبر للصوت التي تدعم الجهد والحالية-المشبك تسجيل وسائط، تسمح تسجيلات المشبك تصحيح كامل الخلية الكهربية العصبية تتسم بدقة عالية. نتيجة لذلك قدمت تسجيلات المشبك التصحيح كل خلية من الخلايا العصبية تيكتال عبر المراحل الرئيسية لتشكيل الدائرة ريتينوتيكتال فهم مفصل وشامل لتنمية واللدونه الجوهرية4،5 , 6 , 7 و متشابك8،9،،من1011 خصائص. الجمع بين الخلية كله التصحيح المشبك العصبية تيكتال التسجيلات، يعزز القدرة على التعبير عن الجينات أو مورفولينوس من الفائدة في هذه الخلايا العصبية12، وأسلوب لتقييم سلوك الإرشادية البصرية عن طريق اختبار إبطال بصرية ثابتة13 تحديد الصلات بين الجزيئات، ووظيفة الدائرة، والسلوك.
من المهم ملاحظة أن نوع عالية الدقة البيانات التي يحصل عليها من تسجيلات المشبك التصحيح خلية كاملة لا يمكن استخدام أحدث النهج التصوير مثل مؤشر الكالسيوم الوراثية GCaMP6، لأنه على الرغم من أن استخدام مؤشرات الكالسيوم تصاريح التصوير الكالسيوم ديناميات عبر عدد كبير من السكان من الخلايا العصبية في نفس الوقت، هناك لا مباشرة أو طريقة واضحة أن المعلمات الكهربائية محددة يمكن الحصول على قياس fluorescence دلتا في سوماتى، ولا توجد طريقة للجهد المشبك العصبية لقياس علاقات الجهد الحالي. وضوح هذه نهجين متميزين والتسجيلات الكهربية وتصوير الكالسيوم، تمتلك القوة غير متداخلة وتوليد أنواع مختلفة من البيانات. هكذا فإن أفضل نهج يعتمد على مسألة تجريبية محددة يجري تناولها.
هنا، يمكننا وصف لدينا طريقة للحصول على تسجيلات المشبك التصحيح خلية كاملة من الخلايا العصبية تكتم الألياف البصرية شرغوف استخدام في فيفو إعداد، الإعداد الكامل للعقل، وأحدث تعديل لإعداد كامل الدماغ التي تم تطويرها في لدينا مختبر14 . في مقطع النتائج الممثل، نبدي مزايا التجريبية لكل إعداد وأنواع مختلفة من البيانات التي يمكن الحصول عليها. حدود ونقاط القوة في التحضيرات المختلفة، فضلا عن نصائح لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها، يتم تضمين في جزء المناقشة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة وايومنغ. وتنفذ جميع الإجراءات، بما في ذلك التسجيلات الكهربية، في درجة حرارة الغرفة، حوالي 23 درجة مئوية. جميع الأساليب الموصوفة هنا هي الأمثل لتسجيل تيكتال الخلايا العصبية من الضفادع الصغيرة بين مرحلة النمو 42 و 49 (نظموا وفقا نيووكوب وإبر15).
1. إعداد في فيفو
- تخدير شرغوف.
- ضع شرغوف في طبق بتري صغيرة التي تحتوي على الحل شتاينبرغ بنسبة 0.01 في المائة MS-222 لمدة 5 دقائق تقريبا.
ملاحظة: هو مرض التصلب العصبي المتعدد-222 الملقب "تريكايني" الأسماك والبرمائيات مخدر المشتركة. الضفادع الصغيرة تربى في الحل شتاينبرغ في ملم: 0.067 بوكل، 0.034 Ca (لا3)2•4H2س،4•7H مجسو 0.0832س، 5.8 كلوريد الصوديوم، حبيس 4.9. - ضمان شرغوف شدة فظاعتها (غير المستجيبة ولم يعد سباحة) قبل المتابعة إلى الخطوة 2.
- ضع شرغوف في طبق بتري صغيرة التي تحتوي على الحل شتاينبرغ بنسبة 0.01 في المائة MS-222 لمدة 5 دقائق تقريبا.
- تأمين شرغوف أنيسثيتيزيد إلى كتلة سيليكون مغمورة في الطابق طبق تشريح/تسجيل.
- استخدام ماصة نقل المتاح لنقل شرغوف أنايسثيتيزيد إلى طبق تشريح/تسجيل الذي يحتوي على تسجيل خارجية حل (115 مم لكلوريد الصوديوم، 2 مم بوكل، 3 مم من كاكل2، 3 مم من مجكل2، 5 ملم حبيس، 1 مم جلوكوز؛ ضبط الأس الهيدروجيني باستخدام 7.25 10 N من هيدروكسيد الصوديوم، موسم الاسموليه 255).
- للتقليل من العضلات العفوية الاختلاجة، إضافة مانع مستقبلات أستيل، توبوكوراريني (100 ميكرومتر) إلى الحل الخارجي. (عادة ما يتم ذلك باستخدام ماصة ميليلتر 200 لإضافة 100 ميليلتر من مخزون tubocurarine 10 ملم إلى 10 مل من محلول خارجي).
- باستخدام دبابيس الحشرات، تأمين شرغوف، الجانب الظهرية، إلى كتلة مغمورة من سيليكون الاستومر (مثل سيلجارد 184، انظر الجدول المواد لمزيد من التفاصيل)، التي قد تم لصقها على الكلمة طبق تشريح.
ملاحظة: وضع الدبابيس الحرجة: وضعها على أي من جانبي الدماغ، والذيلية بما فيه الكفاية لتجنب التخوزق محاور عصبية حكومة كمبوديا الملكية الزبائ هذا المشروع من العين وأدخل في الدماغ فقط عرفت تكتم الألياف البصرية (الشكل 1أ).
- استخدام ماصة نقل المتاح لنقل شرغوف أنايسثيتيزيد إلى طبق تشريح/تسجيل الذي يحتوي على تسجيل خارجية حل (115 مم لكلوريد الصوديوم، 2 مم بوكل، 3 مم من كاكل2، 3 مم من مجكل2، 5 ملم حبيس، 1 مم جلوكوز؛ ضبط الأس الهيدروجيني باستخدام 7.25 10 N من هيدروكسيد الصوديوم، موسم الاسموليه 255).
- فيليه الدماغ على طول خط الوسط.
- للحصول على رؤية واضحة للمخ، إزالة الجلد تغمر الدماغ بجعل شق سطحية على طول خط الوسط باستخدام إبرة معقمة 25-ز.
- فيليه الدماغ على طول نفس المحور خط الوسط بإدخال الإبرة في الأنبوب العصبي وسحب بلطف إلى الأعلى (دورسالي) مثل هذا أن هو نظيفة قص الجزء الظهرية من الأنبوب (قطعت) مع ترك الكلمة لوحة سليمة (الشكل 1ب).
ملاحظة: من المهم أن تترك لوحة الكلمة للأنبوب العصبي سليمة لأن المدخلات الحسية الزبائ أدخل تيكتوم عن طريق لوحة الكلمة.
- إزالة الغشاء البطين الشفاف الذي يغطي الخلايا العصبية تيكتال.
- تحريك الطبق تسجيل لتلاعب الكهربية واستخدام تلميح ماصة زجاج المكسور لإزالة الغشاء البطين تغمر الهيئات الخلايا العصبية تيكتال. كسر التلميح باستخفاف سحبه عبر ممسحة مهمة حساسة.
- المسمار الماصة في حامل ماصة وخفضه وصولاً إلى تكتم الألياف البصرية عبر ميكرومانيبولاتور.
- استخدام ماصة كسر قشر الغشاء البطين بعيداً عن تكتم.
ملاحظة: ليس من الضروري إزالة الغشاء من تكتم كامل؛ نافذة صغيرة سوف تكفي وتوفير إمكانية الوصول إلى الكثير من الخلايا العصبية.
- الحصول على خلية كاملة تسجيلات المشبك التصحيح.
ملاحظة: هذا النهج من هذه النقطة إلى الأمام مماثل للقيام بتسجيلات المشبك التصحيح خلية كاملة من شرائح المخ الماوس كما هو موضح في سيغيف، et al. 16 (الشكل 1ج). - تسجيل الاستجابات العصبية تيكتال لفلاش كامل مجال الضوء المسقط على شبكية العين.
- للمشروع ومضة حقل بكامل من الضوء على شبكية العين، ضع ألياف بصرية المجاورة للعين شرغوف. في الجانب الآخر من الألياف البصرية هو الصمام تمشيا مع مقاوم متغير الذي يسمح للإنارة الخفيفة السيطرة عليها. تشغيل الصمام بإخراج مكبر للصوت الرقمي. وبهذه الطريقة، سجلت ومضات من كثافات مختلفة من الضوء يمكن أن يكون الحقل بالكامل (الشكل 4أ).
2-الجامعة الدماغ إعداد
- نفذ الخطوات 1.1 إلى 1.3.
ملاحظة: ليست هناك حاجة توبوكوراريني في حل خارجي لهذا الإعداد. - عزل في الدماغ.
- استخدام إبرة 25-ز بقطع hindbrain (الشكل 2أ).
- لعزل الدماغ كله من شرغوف، بلطف تشغيل الإبرة تحت الدماغ، وفي اتجاه والذيلية إلى روسترال قطع جميع الأنسجة الضامة الأفقي والبطني والألياف العصبية.
- تأمين الدماغ لكتلة من سيليكون الاستومر.
- بمجرد إطلاق سراح تماما، تأمين الدماغ لكتلة من سيليكون الاستومر بوضع دبوس واحد عن طريق واحد من المصابيح شمي وطرف آخر عن طريق hindbrain (الشكل 2ب). هذا هو التكوين الأمثل لتسجيل من الخلايا العصبية تيكتال.
- تحريك الطبق يحتوي على إعداد الدماغ كله المثبتة من نطاق تشريح لتلاعب الكهربية. إزالة الغشاء البطين استخدام ماصة زجاج المكسور كما هو موضح في الخطوة 1، 4.
- مكان قطبين قطب تحفيز على chiasm البصرية (حيث عبر مساحات إكسون من كل عين في midbrain) لتفعيل محاور عصبية حكومة كمبوديا الملكية مباشرة.
- ضع ثنائي القطب الكهربائي محفزة روسترال، وتقريبا المتاخمة، البطين المتوسطة الكبيرة. ويقع chiasm البصرية روسترال فورا إلى البطين المتوسطة الكبيرة (الشكل 2ب).
- بلطف أقل مسرى حفز إلى أسفل إلى chiasm البصرية مثل أن يتم تشكيل دنت صغيرة في الأنسجة. ثنائي القطب الكهربائي تحركها مشجعا نبض الذي يسمح لقوة التحفيز للتحكم بدقة.
- ضع ثنائي القطب الكهربائي محفزة روسترال، وتقريبا المتاخمة، البطين المتوسطة الكبيرة. ويقع chiasm البصرية روسترال فورا إلى البطين المتوسطة الكبيرة (الشكل 2ب).
- إجراء تسجيل المشبك تصحيح كامل الخلية (الشكل 2ج) كما وصفها سيغيف، et al. 16
3-إعداد شريحة الدماغ أفقي
- تنفيذ الخطوات من 2.1 إلى 2.3.
- استخدام شفرة حلاقة للمكوس الرابع الأكثر الأفقي (أي في فيفو يتوافق مع الرابعة الأكثر الظهرية) من جانب واحد لواحد تكتم الألياف البصرية. يتم إجراء هذا الخفض موازية للطائرة روسترال والذيلية كما هو موضح في الشكل 3ألف.
- إعادة تثبيت الدماغ إلى جانب الاستومر السيليكون مع شرائح الجانب مواجهة (حيث أنه يمكن يمكن الوصول إليها مباشرة سوماتى ونيوروبيل للتسجيل) وسطح البطين من الدماغ التي تواجه بعيداً عن كتلة سيليكون الاستومر (الشكل 3 ب) (حيث أنه يمكن وضعها قطب كهربائي بين قطبين على chiasm البصرية).
- تنفيذ المشبك التصحيح خلية كامل أو تسجيل المحتملة قدم محلي (الشكل 3ج) كما هو موضح سيغيف، et al. 16
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتسجيل استجابات أثارت الضوء المسقط ومضة حقل بكامل من الضوء على شبكية العين بينما يتم تسجيل الاستجابة الناتجة من الخلايا العصبية تيكتال الفردية (الشكل 4أ). هذا البروتوكول خاص مصمم لقياس كل رد من العصبية على ضوء تحول على ("على" استجابة) وثم إيقاف تشغيل 15 ثانية في وقت لاحق لقياس "إيقاف الاستجابة." عادة ما يحمل الخلايا العصبية تيكتال قوية وإيقاف الردود (وضع المشبك هو موضح هنا الجهد مسجل في، مع الخلايا العصبية فرضت على-60mV لقياس التيار متشابك (الشكل 4ب)). يمكن تحديده كمياً مقدار متشابك السيارة تلقاها أي العصبية واحد عن طريق تسجيل الأحداث متشابك عفوية (الشكل 4ج). يمكن تولدها من العصبية نفسه يخطو العصبية لإمكانات متزايدة depolarized العلاقات الحالية الفولت (منحنيات-V) وتسجيل الناتجة عن تنشيط الجهد نا+ والتيارات ك+ ، يشار إلى "المختلطة الحالية تسجيلات "(الشكل 4د، ه). فقد كان راسخة لهذه الخلايا العصبية البرمائية، ذروة غ+ والتيارات ك+ يمكن قياسها كمياً عن طريق التسجيلات الحالية مختلطة لأن القمم لا وقتيا تتراكب مع بعضها البعض4،7.
المباشر تفعيل محاور عصبية حكومة كمبوديا الملكية في chiasm البصرية ويتجاوز كل حساب المنبع ومعالجة المحفزات البصرية التي تحدث في العين، ويسمح لدراسة انتقال متشابك بين محاور عصبية حكومة كمبوديا الملكية presynaptic والخلايا العصبية تيكتال بوستسينابتيك في ما آخر شكل نقي وانخفاض. الاستجابات العصبية تيكتال لتفعيل حكومة كمبوديا الملكية يتم إنشاؤها من رجكس تحفزها على الضوء أو مباشرة باستخدام قطب حفز قطبين يتكون من عنصرين: عنصر مونوسينابتيك (الإدخال المباشر متشابك من رجكس المنشط) وبوليسينابتيك مكون (الشبكة المحلية المتكررة نشاط تغذية يعيدوه العصبية يجري تسجيلها). في حالة الردود مقولة الخفيفة، تتداخل مكونات مونوسينابتيك وبوليسينابتيك مع بعضها البعض بمقدار أونديتيرمينابل بعض. ويحد هذا التداخل الزمني ما يمكن استنتاج حول انتقال متشابك بين الشبكية والألياف البصرية تيكتوم. استخدام إعداد كامل للعقل وتنشيط المسالك إكسون حكومة كمبوديا الملكية مباشرة عن طريق قطب كهربائي وضعها على chiasm البصرية (الشكل 5ألف)، ومع ذلك، تنتج مونو-والعنصر بوليسينابتيك التي أساسا غير متداخلة في الوقت المناسب. ويمكن تعديل قوة محفزة لثنائي القطب الكهربائي. كما يتم زيادة قوة محفزة، وهناك عدد أكبر من حكومة كمبوديا الملكية محاور عصبية المنشط (الشكل 5ب). يحدد بروتوكول تحفيز الحد أدنى قوة متشابك إكسون حكومة كمبوديا الملكية الفردية على العصبية تيكتال فردية؛ ويعكس بروتوكول تحفيز قصوى الإجمالية، أو إدخال الحد الأقصى، ومتشابك من جميع حكومة كمبوديا الملكية محاور عصبية جنبا إلى جنب (الشكل 5ج). الصحيح نسبة المدخلات متشابك ضادات المثبطة (E: أنا نسبة) تلقاها فرد العصبية تيكتال أمر حاسم لوظيفة بصرية طبيعية18. الشكل 5 د يبين مثالاً لأثارت حكومة كمبوديا الملكية عليه والمثبطة الحالية آثار مسجل من العصبية تيكتال فردية. احتمال الإفراج عن الإرسال من محطات إكسون presynaptic حكومة كمبوديا الملكية يقاس بتسجيلات نبض المزدوجة. لهذا، يتم تسجيل العصبية تيكتال بوستسينابتيك في وضع المشبك الجهد لقياس التيارات متشابك، في حين يتم تنشيط محاور عصبية حكومة كمبوديا الملكية تباعا، مفصولة بفاصل زمني 50 مللي ثانية (الشكل 5ه).
يمكن أن تنفذ تسجيلات المشبك التصحيح كله خلية من الخلايا العصبية تيكتال المقيمين في أي طبقة جسدية. مماثلة لإعداد كامل الدماغ، يمكن تفعيل محاور عصبية حكومة كمبوديا الملكية بوضع قطب تسجيل قطبين على chiasm البصرية (الشكل 6A). يمكن أيضا إجراء كافة التسجيلات المضطلع بها في إعداد كامل الدماغ باستخدام هذا الإعداد شريحة الدماغ الأفقي. الرقم 6 ب يبين تتبع مثال استجابة أثارت حكومة كمبوديا الملكية المسجلة من خلية في الطبقة السطحية. كما يسمح هذا الإعداد لنمط الإدخال متشابك حكومة كمبوديا الملكية على dendrites تيكتال المكانية تقاس. لهذا، يتم تسجيل الإمكانات الميدانية أثارت حكومة كمبوديا الملكية كل 10 ميكرون على طول محور الجانبي الآنسي (أي، على محور القاصي الدانية) نيوروبيل (الشكل 6ج). يقوم هذا بإنشاء ملف تعريف الاستبانة من نمط الإدخال حكومة كمبوديا الملكية الفنية. إمكانات الحقل ثم يمكن أن تتحول إلى كثافة المصدر الحالي عن طريق حساب المشتقة المكانية الثانية14 وكثافات المصدر الحالي بدوره يمكن أن تتحول إلى مؤامرة صورة. وارسم صورة في الشكل 6ج يبين أن مساهمة حكومة كمبوديا الملكية أقوى يستهدف منطقة القاصي أكثر من نيوروبيل.
الشكل 1. في فيفو إجراءات إعداد- تمركزها على قطعة من سيليكون الاستومر شرغوف (A). يتم الإشارة إلى دبابيس بالأسهم البيضاء. ملاحظة وضع دبوس أكثر والذيلية لتجنب التخوزق مساحات الألياف البصرية. خط متقطع الأبيض يشير إلى خط الوسط. (ب) زوميد في عرض للكامل الدماغ بعد قطع على طول خط الوسط الظهرية وإزالة الجلد تتراكب. (ج) تسجيل التصحيح-المشبك كامل الخلية في الجسم الحي. (L: الجانبي. م: الآنسي. ص: روسترال. C: والذيلية. دال: الظهرية. خامسا: البطني. OB: شمي لمبة. أوراسكوم تليكوم: تكتم الألياف البصرية. غبطة: Hindbrain). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . الدماغ كله إجراءات إعداد- (A) بعد هو شرائح المخ على طول خط الوسط، هيندبرين هو فصل. (ب) الكامل الدماغ تشريح خارج وتمركزها إلى الاستومر السيليكون. النجمة البيضاء تشير إلى رقم pin في لمبة شمي الأيسر. يشير المربع الأحمر إلى الثالث المتوسط تكتم، أي، والمنطقة المستهدفة لتسجيل. (ج) كل خلية تسجيل المشبك التصحيح باستخدام الإعداد الكامل للعقل. العلامة النجمية الأسود يشير إلى مجال الأمم المتحدة كشط الغشاء البطين حيث لا يمكن الوصول إلى الخلايا للتسجيل. حيث تمت إزالة الغشاء بنجاح، تظهر سوماتى متميزة ومحددة أكثر. يشير السهم إلى العصبية غير صحية. (PZ: منطقة التكاثري. مركبة: البطين وسطى كبيرة. OB: شمي لمبة. أوراسكوم تليكوم: تكتم الألياف البصرية. غبطة: هيندبرين. L: الوحشي. م: الآنسي. ص: روسترال. C: والذيلية. دال: الظهرية. خامسا: البطني). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . إجراءات إعداد شريحة الدماغ الأفقي. (أ) الجزء الجانبي الأكثر من جانب واحد من تكتم الألياف البصرية سوف تكون شرائح (المشار إليه بواسطة خط متقطع) بعد التحضير الكامل للعقل. (ب) إعداد شريحة الدماغ الأفقي بعد تمركزها إلى جانب الاستومر السيليكون. تمثل خطوط بيضاء مزدوجة قطب محفزة على chiasm البصرية. (ج) عرض Zoomed في طبقات سوما ونيوروبيل باستخدام إعداد شريحة الدماغ أفقي. متقطع من منحنى يشير إلى الحدود بين الطبقات سوما ونيوروبيل. وقد تم تعديل هذا الرقم من حمدي, et al. 14 (l: الجانبي. م: الآنسي. ص: روسترال. C: والذيلية. دال: الظهرية. خامسا: البطني. OB: شمي لمبة. OC: Chiasm البصرية. أوراسكوم تليكوم: تكتم الألياف البصرية. غبطة: Hindbrain). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . تسجيلات من إعداد في فيفو . عرض التكوين النموذجي التسجيل في فيفو التخطيطي (A). الضوء (ب) أثارت الردود بما في ذلك الضوء والضوء قبالة الردود. آثار اقحم يتم التكبير في طريقة عرض من على وقبالة-الاستجابة، على التوالي. (ج) عفوية ضادات بوستسينابتيك التيارات المسجلة. (د) نا+ والتيارات ك+ استجابة للجهد المشبك الخطوات من-60 أم 30 أم من خلية واحدة. (ﻫ) رابعا المؤامرات التي تم إنشاؤها من آثار في (د). أجريت جميع التسجيلات مع الخلايا العصبية في-60 أم إلا في (د) توليد رابعا-المؤامرات؛ الخلايا العصبية التي صعدت إلى إمكانات متزايدة أكثر ديبولاريزيد، 10 mV زيادات، تنشيط التيارات المعتمدة على الجهد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 . تسجيلات من إعداد الدماغ كله. التخطيطي (أ) عرض نموذجي تكوين تسجيل كامل الدماغ بما في ذلك قطب محفزة كاهل chiasm البصرية (الخطوط الخضراء والحمراء تمثل محاور عصبية حكومة كمبوديا الملكية). (ب) تتراكب يتتبع ردود حكومة كمبوديا الملكية للتغييرات لحكومة كمبوديا الملكية قوة التحفيز. (ج) كحد أقصى استجابة التحفيز (يسار) واستجابة حفز الحد الأدنى (على اليمين). (د) الرد عليه والمثبطة أثارت "حكومة كمبوديا الملكية" على خلية واحدة. نبض الزوجي (ﻫ) تيسير استجابة أثارت حكومة كمبوديا الملكية الخلايا العصبية الفردية. (OB: لمبة شمي. OC: Chiasm البصرية. أوراسكوم تليكوم: تكتم الألياف البصرية). أجريت جميع التسجيلات مع الخلايا العصبية في-60 mV ما عدا في (د) لقياس المدخلات ضادات والمثبطة: يتم تسجيل الإدخال ضادات بعقد العصبية إزاء احتمال عكس حمض γ-أمينوبوتيريك (GABA)-بوساطة كلوريد التيارات (أم-45)؛ الإدخال المثبطة بعقد العصبية إزاء احتمال انعكاس لحمض α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (امبا)-بوساطة تيارات (أم + 5). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 . تسجيلات من دماغ أفقي شريحة إعداد- عرض تكوين إعداد شريحة الدماغ الأفقي التخطيطي (A). ملاحظة أنه على الرغم من أن يبقى مسرى محفزة في chiasm البصرية، ماصة تسجيل المتمركزة الآن للوصول إلى الخلايا عبر جميع الطبقات تيكتال كشفها بواسطة إعداد شريحة الدماغ الأفقي. (ب) استجابة حكومة كمبوديا الملكية من خلية المقيمين في طبقة سطحية من تكتم. (ج) سجلت الإمكانات الميدانية عبر كثافة المصدر الحالي (كسدس) المحولة سيظهر بالصورة ارسم خرائط الحرارة ونيوروبيل. (OC: Chiasm البصرية. أوراسكوم تليكوم: تكتم الألياف البصرية. غبطة: Hindbrain). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
جميع الأساليب الموصوفة في هذا العمل هي الأمثل لتسجيل تيكتال الخلايا العصبية من الضفادع الصغيرة بين مرحلة النمو 42 و 49 (نظموا وفقا نيووكوب وإبر15). بمرحلة 42، الضفادع الصغيرة كبيرة بما فيه الكفاية والمتقدمة بما فيه الكفاية حتى أنه يمكن وضع دبابيس الحشرات على أي من جانبي الدماغ للتسجيلات في فيفو والقيام بتشريح الدماغ كله. في المراحل المبكرة، عند الضفادع الصغيرة أساسا ثنائي الأبعاد (أي، شقة)، النهج الوارد وصفها هنا ليست مثلى.
نظراً للسهولة التي يمكن الوصول إلى الخلايا العصبية تيكتال وسجلت في تكوين خلية كاملة، كانت هذه الدارة نموذج مرتعا للاكتشافات الأساسية حول شكل الدوائر العصبية كيف أثناء سير-ووظيفة أثناء تشكيل19. هنا لقد قمنا بوصف كيفية الحصول على تسجيلات المشبك التصحيح كل خلية من الخلايا العصبية تيكتال، بما في ذلك كيفية أداء شرغوف في فيفو والتحضير الكامل للعقل، وتكوينات تسجيل مختلفة، وأمثلة لأنواع مختلفة من البيانات. ما يلي هو مناقشة مواطن القوة والقيود لكل إعداد، متبوعاً بنصائح لتحقيق تسجيلات خلية كاملة عالية الجودة.
النمو الضفادع الصغيرة البدء في عرض سلوكيات الأبطال البصرية المرحلة 47/48، حوالي 7-8 أيام الإخصاب بعد3،13. وهذا يعني أنه حتى في هذه المراحل المبكرة نسبيا من التنمية، على حلبة ريتينوتيكتال عاملة وقادرة على معالجة المحفزات البصرية. وتم تناول المسائل الأساسية المتعلقة بالتنمية واللدونه للدائرة ريتينوتيكتال مباشرة باستخدام الإعداد في فيفو لتسجيل الاستجابات العصبية تيكتال للمنبهات البصرية المسقطة على شبكية العين. في فيفو التسجيلات في شرغوف واضحة نسبيا بالمقارنة إلى تكوين تسجيل ما يعادل في الثدييات بسبب البساطة النسبية للجهاز العصبي وانعدام الجمجمة. لأنه يمكن أن تكون اتفاقات فردية العصبية تيكتال تصور في فيفو، ختم على خلية معينة وتحقيق كامل الخلية التصحيح المشبك تسجيل التكوين يكافئ أساسا للاضطلاع بالمشبك التصحيح كله خلية تسجيل في شريحة القوارض الأعمال التحضيرية. عادة ما تعيش الضفادع الصغيرة لعدة ساعات على جهاز الحفر (التي يمكن أن يسهل تقييمها عن طريق رصد ضربات القلب). واحد الحد المتأصلة في فيفو شرغوف إعداد هي فقط تيكتال الخلايا العصبية المقيمين في طبقة عميقة جسدية من تكتم الألياف البصرية، الطبقة المجاورة مباشرة البطين المتوسطة الكبيرة، موجوداً لتسجيل (الرقم 1 ). وهذا يعني أن الخلايا العصبية تيكتال المقيمين في طبقات تكتم جسدية الخارجي كانت غير مستكشفة إلى حد كبير في المجراة.
ميزة تجريبية من إعداد كامل الدماغ أن يعزل الدماغ من المستقبلات الحسية الطرفية في العينين والجلد، والقضاء على كل نشاط يحركها الحسية زائفة. بينما لم تعد قادرة على طردهم من المحفزات البصرية، مدخلات محواري حكومة كمبوديا الملكية التي تستهدف تكتم لا تزال موجودة في الإعداد الكامل للعقل، ويمكن تفعيلها مباشرة على نحو شديد عبر قطب حفز قطبين (FHC) على حيث أدخل المجموعتين من حكومة كمبوديا الملكية إكسون مساحات الدماغ chiasm البصرية. كان أول استخدام المبلغ عنها لإعداد الدماغ كله في عام 1996، في دراسة هامة من وو et al. 8، في محاور عصبية حكومة كمبوديا الملكية التي تم تنشيطها باستخدام قطبين قطب تحفيز مثل الكتاب يمكن قياس قوة محاور عصبية حكومة كمبوديا الملكية الفردية على الخلايا العصبية تيكتال بوستسينابتيك، وهي تقوم بذلك تقدم الاكتشافات الأساسية حول تطور نضوج المشبك. كما هو الحال مع إعداد في فيفو ، يسمح بالتحضير الكامل للعقل الوصول إلى فقط تلك الخلايا العصبية المقيمين في طبقة عميقة، المتاخمة للغشاء البطين.
على الرغم من أن تكتم الألياف البصرية يتألف من حوالي تسع خلايا الجسم طبقات17، جميع الدراسات السابقة الكهربية قد ركزت على عمق طبقة الخلايا العصبية تيكتال نظراً للدماغ كله التقليدية و في فيفو الأعمال التحضيرية (وصف أعلاه) تسمح بالوصول فقط إلى الخلايا العصبية طبقة عميقة. من أجل الوصول إلى الخلايا العصبية تيكتال عبر جميع الطبقات جسدية، من أعمق للأكثر سطحية فضلا عن الكامل نيوروبيل التي تشكل فيها حكومة كمبوديا الملكية محاور عصبية اتصالات متشابك مع dendrites العصبية تيكتال، قمنا بتطوير إعداد تعديل كامل الدماغ، يشار إليه بوصفه " إعداد شريحة الدماغ الأفقي "(الشكل 314). وتقيم إعداد شريحة الدماغ الأفقي مع إعداد كامل الدماغ، محاور عصبية حكومة كمبوديا الملكية داخل المخ، وأنها يمكن التحكم بوضع قطبين قطب تحفيز على chiasm البصرية.
عموما، صممت الأعمال التحضيرية للتصور والوصول إلى سوماتى تيكتال العصبية القيام بتسجيل المشبك التصحيح خلية كله على النحو الأمثل. مباشرة الوصول إلى سوما ضروري لتسجيلات المشبك التصحيح خلية كاملة الجودة: يتطلب الوصول إلى داخل الخلايا العصبية تشكيل قوي جداً (> 1 Ω9 × 10) ختم بين الماصة والبلازما الغشاء العصبية، الأمر الذي يتطلب مباشرة اتصال طرف الماصة على هذا الغشاء. ومن ثم إزالة كافية للغشاء البطين هو المفتاح لنجاح التسجيل. أيضا، هو المفتاح لنجاح التسجيلات أثارت حكومة كمبوديا الملكية الموضع الصحيح من القطبين الكهربائي محفزة على chiasm البصرية. أساسا جميع الخلايا العصبية تيكتال تلقي مدخلات متشابك مباشرة من محاور عصبية حكومة كمبوديا الملكية. إذا كان يتم ملاحظة أي رد أثارت حكومة كمبوديا الملكية، ثم هذا الأكثر احتمالاً بسبب الموضع غير صحيحة لثنائي القطب الكهربائي أن ليس في chiasm البصرية والاتصال لا الأعصاب البصرية. يمكن تصحيح هذا ببساطة إعادة وضع مسرى محفزة. عدم مراعاة الردود أثارت حكومة كمبوديا الملكية بعد إعادة تحديد المواقع ثنائي القطب الكهربائي يمكن أن يعني أن الإسقاط إكسون حكومة كمبوديا الملكية فصلت بطريق الخطأ أثناء التشريح. وفي هذه الحالة، من الضروري البدء بإعداد جديد. أخيرا، يمكن أن يكون عدم التقيد برد فعل أثارت حكومة كمبوديا الملكية بسبب تسجيل من خلية غير خلية تيكتال مشتركة. على سبيل المثال، إطلاق عادة عدم عرض عادي أثارت حكومة كمبوديا الملكية مونوسينابتيك استجابة المعروضة بواسطة الخلايا العصبية تيكتال، ولا كبيرة ميسينسيفاليك الخلايا العصبية التي تم العثور عليها، أن كان ذلك في أرقام منخفضة للغاية، الذين يقيمون في تكتم الألياف البصرية20. احتمال تسجيل من إحدى هذه الخلايا غير تيكتال منخفض جداً بسبب العدد الهائل من الخلايا العصبية تيكتال. وبطبيعة الحال، تتطلب جودة التسجيلات أيضا الخلايا العصبية تيكتال التمتع بصحة جيدة. خصائص خلية تيكتال صحية هي سوما مستديرة أو بيضاوية الشكل مضغوط ذات الألوان الفاتحة ودون العيوب. وبمجرد تكوين تسجيل خلية كله قد تحقق، صحة الخلايا العصبية يمكن تقييمها كذلك على مستوى الكهربية بقياس الخواص الكهربائية الأساسية مثل يستريح إمكانات غشاء وإدخال المقاومة والسعة . هو يستريح إمكانات غشاء الخلايا العصبية تيكتال صحية بين مراحل النمو 42 و 49-ما يقرب من 45 بالسيارات، بمتوسط مقاومة إدخال من GΩ حوالي 1، وسعه من 10-12 الجبهة الوطنية3،،من45. حتما سوف يكون معطوباً صغيراً من الخلايا العصبية نتيجة لإزالة الغشاء البطين. سوماتى الخلايا العصبية التالفة أو غير صحية تبدو مشوشة، المتضخمة، أو ذبلت. يتم عرض مثال من العصبية غير صحية الشكل 2ج. إذا كان يبدو أن غالبية الخلايا العصبية غير صحية، وهذا يمكن أن يكون انعكاس أن هناك شيء خاطئ مع الحل تسجيل خارجي، حيث يوصي بجعل حل تسجيل خارجي جديد. بالإضافة إلى ظهور صحية، الخلايا العصبية أفضل للتسجيل المقترنة عادة مع عدد كبير من الخلايا العصبية الأخرى، بدلاً من العزلة. أيضا، اختيار الخلايا التي يمكن الوصول إليها بسهولة. على سبيل المثال، عدم دفع الأنسجة من الصعب جداً الوصول إلى خلية لأن هذا قد تلحق الضرر الأنسجة أو نقل الأنسجة وهكذا تحول مسرى تحفيز الخروج من المكان. وأخيراً، تسجيلات ينبغي أن يقتصر على الثلث الأوسط من تكتم (الشكل 2ب) لتجنب الاختلافات المحتملة بسبب التدرج التنموي القائم عبر4،rostro-والذيلية المحور8، ما لم يكن، بطبيعة الحال، هو محور التجربة التدرج الإنمائية المذكورة آنفا. تكتم السليم هو منطقة روسترال منطقة التكاثري ووالذيليه إلى حافة والذيلية البطين المتوسطة الكبيرة.
المشبك التصحيح كله خلية تسجيل تقنية لا يخلو من أوجه القصور. وبصفة عامة، يشمل هذا النمط من تسجيل تسجيل العصبية واحد في وقت واحد. هذا هو على النقيض من النهج التي تشمل التصوير بالجيل الجديد من GCaMP6 الكالسيوم المؤشرات التي تسمح بالنشاط لإعداد كبيرة من السكان من الخلايا العصبية تصويرها في نفس الوقت في إعداد شريحة و في فيفو.
عيب آخر الملازمة لتسجيلات المشبك الجهد كله خلية هو الخطأ المشبك الفضاء (عدم القدرة على التحكم في الجهد أبعد بكثير بعد سوما)، مما يحد من التحكم الزمني للجهد4. وعموما، هذه القضايا المشبك الجهد الحد الأدنى عند تسجيل من الخلايا العصبية تيكتال ولكن بسبب حجمها الصغير نسبيا، أربوريزيشنز الجذعية متواضعة، والتيارات الصغيرة وبطيء نسبيا بالمقارنة مع الخلايا العصبية الثدييات. خصائص هذه الخلايا العصبية تيكتال تجعلها خاصة قابلة للجهد المشبك تسجيل وقياس العديد من المعلمات، وبناء التشكيلات الجانبية للخلايا العصبية الفردية5،6.
وتشمل الاتجاهات المستقبلية الأمثل في فيفو الدماغ أفقي شريحة إعداد لتوصيف وظيفة الطبقة الخارجية من الخلايا العصبية في معالجة المحفزات البصرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يدعم منح المعاهد الوطنية للصحة أمانة اتفاقية بازل نحاس 1P20GM121310-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Dissecting microscope |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Amphibian general anesthetic |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Used to prepare Stienberg's solution |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare Steinberg's solution |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Used to prepare external recording solution |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Used to prepare external recording solution |
| D-glucose Anhydrous | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare external recording solution |
| Tubocurarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379 | Nicotinic acetylcholine receptor antagonist |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm diameter stainless steel pins |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761028 | Preweighed monomer and curing agent kit |
| Sterile Polystyrene Petri Dish - 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Small petri dishes |
| PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | 305122 | Syringe needles |
| 1mL Slip Tip Tuberculin Syringe | BD | 309659 | Disposable, sterile syringes |
| Borosilicate pipette glass | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Pulled to desired specifications using pipette pulling machine |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Fabricates micropipettes for electrophysiology recording |
| Kimwipes Kimtech wipes | Kimberly-Clark | 34120 | Delicate task lint-free wipers |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Current clamp and voltage clamp headstage |
| MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller | Sutter Instrument | MP-285/T | Control for headstage on electrophysiology rig |
| Fiber-Coupled LED (Green) | Thorlabs | M530F2 | Fiber optic cable paired with green LED |
| Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter) | FHC | 30207 | Bipolar stimulating electrode |
| ISO-Flex Stimulator | A.M.P.I. (Israel) | Contact manufacturer | Flexible stimulus isolator |
| Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplifier for voltage- and current-clamp recording |
| Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | 2500-135 | Data acquisition system for electrophysiology recording |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Microscope for electrophysiology |
| Micro-g Lab Table | TMC | 63-533 | Air table for electrophysiology microscope |
| Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit | Dell | D06D001 | Computer running electrophysiology software |
| c2400 CCD camera | Hamamatsu | 70826-5 | Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging |
| 7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades | Gillette | CMM01049 | Platinum-coated stainless razor blades |
| Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-711-7M | Disposable Polyethylene transfer pipets |
References
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
- Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
- Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit. Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole. J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit. J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).
- Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity. Elife. 4, 11351 (2015).
- Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).
- Wu, G., Malinow, R. Cline H.T. of a central glutamatergic synapse. Science. , 972-976 (1996).
- Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism. Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).
- Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development. Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), e705 (2008).
- Dong, W., et al. Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum. J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum. J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland. New York. (1994).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J. Vis. Exp. (112), e54024 (2016).
- Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure. Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).
- Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles. Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).
- Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function. Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles. J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).
