Summary
Dans cet article, nous discutons trois préparations de cerveau utilisées pour l’enregistrement de germes entiers patch clamp pour étudier le circuit rétino des têtards de Xenopus laevis . Chaque préparation, avec ses propres avantages spécifiques, contribue à la traçabilité expérimentale du têtard de Xenopus comme modèle pour étudier la fonction des circuits neuronaux.
Abstract
Le circuit de rétino têtard Xenopus , composé des cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) dans le œil qui font synapses directement sur les neurones dans le tectum optique, est un modèle populaire pour l’étude des circuits neuronaux comment s’auto-assembler. La capacité à réaliser ensemble patch clamp enregistrements de neurones tectal record réponses évoquée par le CJR, soit in vivo de cellules ou en utilisant une préparation de tout le cerveau, a généré un grand nombre de données à haute résolution sur les mécanismes sous-jacents normaux et la formation des circuits anormal et la fonction. Nous décrivons ici comment effectuer la préparation in vivo , la préparation originale de tout le cerveau, et plus récemment développé préparation de tranches de cerveau horizontale pour obtenir des enregistrements de germes entiers patch clamp de neurones opposantes. Chaque préparation a des avantages uniques expérimentales. La préparation in vivo permet l’enregistrement de la réponse directe des neurones opposantes à des stimuli visuels projetés sur le œil. La préparation de tout le cerveau permet les axones RGC être activé de façon très contrôlée, et la préparation de tranches de cerveau horizontal permet l’enregistrement de travers toutes les couches du tectum.
Introduction
Le circuit de rétino est le composant principal du système visuel amphibiens. Il est composé des CGR dans l’oeil, qui projettent leurs axones vers le tectum optique où ils forment des connexions synaptiques avec les neurones post-synaptiques opposantes. Le circuit de rétino têtard Xenopus est un modèle de développement populaire pour étudier la fonction et la formation des circuits neuronaux. Il y a beaucoup d’attributs du circuit rétino de ce têtard qui rendre un puissant modèle expérimental1,2,3. Un attribut important et la mise au point du présent article, est la capacité de mener des cellules entières patch clamp enregistrements de neurones opposantes, in vivo ou en utilisant une préparation de tout le cerveau. Avec une plate-forme d’électrophysiologie équipée d’un amplificateur qui prend en charge et de courant-potentiel imposé modes d’enregistrement, enregistrements de germes entiers patch clamp permettent électrophysiologie un neurone se caractériser à haute résolution. Ainsi, les cellules entières patch clamp enregistrements de neurones générés à travers les étapes clés de la formation des circuits rétino ont fourni une compréhension détaillée et complète du développement et la plasticité intrinsèque4,,5 , 6 , 7 et synaptique8,9,10,11 propriétés. Combinant des enregistrements de neurone tectal germes entiers patch clamp, la capacité d’exprimer des gènes ou des morpholinos d’intérêt dans ces neurones12et une méthode pour évaluer le comportement visuel de guidée par un évitement visuel établi essai13 favorise la identification des liens entre les molécules, fonction du circuit et le comportement.
Il est important de noter que le type de haute résolution données acquises à partir d’enregistrements de pince pour le patch à germes entiers ne sont pas possibles à l’aide de nouvelles approches d’imagerie tels que l’indicateur de calcium génétique GCaMP6, car bien qu’en utilisant des indicateurs de calcium permet l’imagerie de calcium dynamique à travers de grandes populations de neurones en même temps, il est non directe ou pince de manière évidente que les paramètres électriques spécifiques peuvent être obtenues en mesurant la fluorescence delta dans les corps cellulaires et n’a aucun moyen de tension le neurone pour mesurer relations courant-tension. Clairement, ces deux approches distinctes, d’enregistrements électrophysiologiques et imagerie calcique, possèdent des atouts sans chevauchement et générer différents types de données. Ainsi, la meilleure approche dépend de la question expérimentale spécifique abordée.
Ici, nous décrivons notre méthode d’acquisition des cellules entières patch clamp enregistrements des neurones du tectum optique tadpole à l’aide d’une préparation en vivo , préparation de tout le cerveau, et une version plus récente modification préparation de tout le cerveau qui a été mis au point dans notre laboratoire14 . Dans la section résultats de représentant, nous démontrer les avantages expérimentales de chaque préparation et les différents types de données qui peuvent être obtenues. Les limites et les points forts de les différentes préparations, ainsi que des conseils pour le dépannage, sont inclus dans la section « Discussion ».
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université du Wyoming. Toutes les procédures, y compris les enregistrements électrophysiologiques, sont réalisées à température ambiante, environ 23 ° C. Toutes les méthodes décrites ici sont optimisés pour l’enregistrement des neurones tectal des têtards entre le stade de développement 42 et 49 (mise en scène selon Neiuwkoop et Faber15).
1. préparation de in Vivo
- Anesthésier le têtard.
- Placer le têtard dans une petite boîte de Pétri contenant une solution de Steinberg avec 0,01 % MS-222 pendant environ 5 min.
NOTE : MS-222 aka « Tricaine » est une commune poissons et des amphibiens anesthésique. Les têtards sont déclenchés dans une solution de Steinberg en mM : 0,067 KCl, 0,034 Ca (NO3)2•4H2O, 0,083 MgSO4•7H2O, 5,8 NaCl, 4,9 HEPES. - Assurez-vous que le têtard est profondément anesthésié (baignade non recevable et non plu) avant de passer à l’étape 2.
- Placer le têtard dans une petite boîte de Pétri contenant une solution de Steinberg avec 0,01 % MS-222 pendant environ 5 min.
- Fixez le têtard anesthésié à un bloc de silicone submergées sur le plancher du plat dissection/enregistrement.
- Utiliser une pipette de transfert jetable pour déplacer le têtard anesthésié pour un plat de dissection/enregistrement contenant la solution d’enregistrement externe (115 mM de NaCl, KCl, 2 mM 3 mM CaCl2, 3 mM MgCl2, 5 mM de HEPES, 1 mM de glucose ; ajuster le pH à 7.25 à l’aide 10 N de NaOH, osmolarité 255 mOsm).
- Pour minimiser le muscle spontané TICs, ajouter le bloqueur des récepteurs acétylcholine, tubocurarine (100 µM) à la solution externe. (En général, cela se fait en utilisant une pipette µL 200 pour ajouter 100 µL d’un stock de tubocurarine 10 mM pour 10 mL de solution externe).
- À l’aide d’épingles à insectes, sécuriser le têtard, la face dorsale vers le haut, à un bloc submergé d’élastomère de silicone (comme le Sylgard 184, voir Table des matières pour plus de détails), qui a été collé au plancher plat dissection.
Remarque : L’emplacement des broches est crucial : Placez-les de chaque côté du cerveau, suffisamment caudale pour éviter d’empaler les axones afférents de la CJR, ce projet de le œil et de pénétrer dans le cerveau juste en avant du tectum optique (Figure 1A).
- Utiliser une pipette de transfert jetable pour déplacer le têtard anesthésié pour un plat de dissection/enregistrement contenant la solution d’enregistrement externe (115 mM de NaCl, KCl, 2 mM 3 mM CaCl2, 3 mM MgCl2, 5 mM de HEPES, 1 mM de glucose ; ajuster le pH à 7.25 à l’aide 10 N de NaOH, osmolarité 255 mOsm).
- Filet du cerveau le long de la ligne médiane.
- Pour une vision claire du cerveau, enlever la peau recouvrant le cerveau en faisant une incision superficielle le long de la ligne médiane à l’aide d’une aiguille stérile de 25 G.
- Filet du cerveau le long du même axe de la ligne médiane en insérant l’aiguille dans le tube neural et tirer doucement vers le haut (sur le dos) telle que la partie dorsale du tube est proprement coupée (coupée) tout en laissant intacte la plaque de plancher (Figure 1B).
Remarque : Il est important que la plaque de sol du tube neural laissée intacte parce que les entrées sensorielles afférentes dans le tectum via la plaque de sol.
- Retirer la membrane transparente ventriculaire qui couvre les neurones opposantes.
- Déplacer le plat d’enregistrement au banc d’essai électrophysiologie et utiliser un embout de pipette de verre brisé pour enlever la membrane ventriculaire recouvrant les corps cellulaires de neurones tectal. Casser la pointe en le faisant glisser légèrement à travers un essuie-glace de tâche délicate.
- Visser la pipette dans le support de pipette et faites-la glisser vers le bas pour le tectum optique via le micromanipulateur.
- Utiliser la pipette cassée à éplucher la membrane ventriculaire de tectum.
Remarque : Il n’est pas nécessaire d’enlever la membrane sur le tectum ensemble ; une petite fenêtre va suffire et donnent accès à l’abondance des neurones.
- Obtenir la cellule entière enregistrements de patch clamp.
Remarque : L’approche à partir de ce moment est similaire à effectuer des enregistrements de germes entiers patch clamp de coupes de cerveau de souris comme décrit dans Segev, et al. 16 (Figure 1C). - Enregistrer les réponses de neurone opposantes à un flash de tout le domaine de la lumière projetée sur la rétine.
- Pour projeter un éclair tout le champ de lumière sur la rétine, placez une fibre optique à côté de l’oeil du têtard. À l’autre extrémité de la fibre optique est une LED en ligne avec une résistance variable qui permet de la luminance lumineuse à télécommander. Déclencher la LED de la sortie numérique de l’amplificateur. De cette façon, tout le champ des flashs de différentes intensités de lumière peuvent être enregistré (Figure 4A).
2. tout le cerveau préparation
- Effectuez les étapes 1.1 à 1.3.
Remarque : Il est inutile pour la tubocurarine dans la solution externe pour cette préparation. - Isoler le cerveau.
- Utiliser une aiguille 25 G pour rompre le cerveau postérieur (Figure 2A).
- Pour isoler le cerveau entier du têtard, doucement courir l’aiguille sous le cerveau, en direction caudale-à-rostrale de rompre tous les ventral et latéral du tissu conjonctif et fibres nerveuses.
- Fixez le cerveau à un bloc d’élastomère de silicone.
- Une fois complètement libéré, fixez le cerveau à un bloc d’élastomère de silicone en plaçant une broche par l’intermédiaire de l’un des bulbes olfactifs et une autre tige dans le cerveau postérieur (Figure 2B). Il s’agit de la configuration optimale pour l’enregistrement de neurones opposantes.
- Placez le plat contenant la préparation épinglés cerveau entier de la dissection portée au banc d’essai électrophysiologie. Enlever la membrane ventriculaire à l’aide d’une pipette de verre brisé comme indiqué au point 1.4.
- Placer une électrode de stimulation bipolaire sur le chiasma optique (où les tracts de l’axone de chaque œil traversent au mésencéphale) pour activer directement les axones RGC.
- Placer l’électrode de stimulation bipolaire rostral et presque près, le grand ventricule moyen. Le chiasma optique est situé immédiatement rostral au grand ventricule moyen (Figure 2B).
- Doucement abaissez l’électrode de stimulation sur le chiasma optique telle qu’une petite bosse se forme dans les tissus. L’électrode bipolaire est entraînée par un stimulateur d’impulsion qui permet à la force de stimulation à être contrôlée avec précision.
- Placer l’électrode de stimulation bipolaire rostral et presque près, le grand ventricule moyen. Le chiasma optique est situé immédiatement rostral au grand ventricule moyen (Figure 2B).
- Effectuez l’enregistrement de pince de patch de germes entiers (Figure 2C) tel que décrit par Segev, et al. 16
3. préparation de tranches de cerveau horizontal
- Effectuez les étapes 2.1 à 2.3.
- Utilisez une lame de rasoir pour exciser la quatrième plus latérale (qui en vivo correspond à la quatrième dorsale plus) d’un côté du tectum optique un. Cette coupe est faite en parallèle au plan rostral caudal, comme illustré à la Figure 3A.
- Re-goupille le cerveau du côté de l’élastomère de silicone avec les tranches côté vers le haut (de sorte que les corps cellulaires et la neuropile sont directement accessibles pour l’enregistrement) et la surface ventriculaire du cerveau à l’opposé du bloc élastomère de silicone (Figure 3 B) (de sorte qu’une électrode bipolaire peut être placée sur le chiasma optique).
- Exécuter le patch clamp de la cellule entière ou enregistrement potentiel classé local (Figure 3C) qu’il décrit par Segev, et al. 16
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Representative Results
Pour enregistrer les réponses évoquée par la lumière, un flash tout le champ de la lumière est projeté sur la rétine tandis que la réponse obtenue est enregistrée de différents neurones tectal (Figure 4A). Ce protocole particulier est conçu pour mesurer les deux la réponse du neurone à la lumière allumer (« On » réponse) et ensuite éteindre le 15 s plus tard pour mesurer la « réponse Off ». Neurones tectal pièce généralement robuste sur et en dehors des réponses (mode de pince illustré ici tension enregistrée dans, avec le neurone agrafée au - 60mV pour mesurer le courant synaptique (Figure 4B)). Le montant du lecteur synaptique reçue par tout un neurone peut être quantifié en enregistrant des événements synaptiques spontanées (Figure 4C). Relations courant-tension (courbes I-V) peuvent être générées du même neurone en accentuant le neurone à potentiels de plus en plus dépolarisées et enregistrer les voix qui en résulte activé par tension Na+ et courants K+ , dénommées « mixte actuel Recordings » (Figure 4D, E). Il est bien établi que, pour ces neurones amphibiens, pic Na+ et K+ courants peuvent être quantifiées mixte Recordings actuel car les sommets ne chevauchent pas temporellement entre eux4,7.
Direct activation des axones RGC au chiasma contourne tous les calculs en amont et le traitement des stimuli visuels qui se déroulent dans le œil et permet d’étudier la transmission synaptique entre les axones présynaptiques RGC et neurones post-synaptiques tectal sa forme la plus pure et réduite. Réponses de neurone opposantes à l’activation de la CJR sont générés à partir de CGR stimulés par la lumière ou directement à l’aide d’une électrode bipolaire stimulante, constitué de deux composantes : une composante monosynaptique (l’entrée synaptique directe de CGR activés) et un polysynaptiques composant (le réseau récurrent local activité alimentation arrière sur le neurone en cours d’enregistrement). Dans le cas des clair réponses évoquées, les composantes monosynaptiques et polysynaptiques se chevauchent entre eux en proportion indéterminable. Ce chevauchement temporel limite ce qui peut être conclu sur la transmission synaptique entre la rétine et le tectum optique. En utilisant une préparation de tout le cerveau et en activant le tractus d’axon RGC directement via une électrode placée sur le chiasma optique (Figure 5A), cependant, produit un mono - et polysynaptiques composant qui sont essentiellement sans chevauchement dans le temps. La force stimulante de l’électrode bipolaire peut être ajustée. Lorsque l’intensité de stimulation augmente, il y a un plus grand nombre d’axones RGC activés (Figure 5B). Un protocole de stimulation minimale détermine la force synaptique d’un axone RGC individuel sur un neurone tectal individuel ; un protocole de stimulation maximale reflète le total ou des entrées maximum, synaptique tous les RGC axones combinés (Figure 5C). Le ratio approprié d’entrées synaptiques excitateurs à inhibitrice (E : J’ai ratio) reçue par un individu tectal neurone est critique pour la fonction visuelle normale18. Figure 5 D présente un exemple des évoquée par le CJR excitatrices et inhibitrices actuels traces enregistrées d’un neurone tectal individuel. La probabilité de la sortie de l’émetteur de terminaisons des axones présynaptiques RGC est mesurée par enregistrements impulsion appariés. Pour ce faire, le neurone postsynaptique tectal est enregistré dans le mode de pince de tension pour mesurer des courants synaptiques, alors que les axones de la CJR sont activés successivement, séparés par un intervalle de temps de 50 ms (Figure 5E).
Enregistrements de germes entiers patch clamp est réalisable de neurones tectal résidant dans n’importe quelle couche somatique. Similaire à la préparation de tout le cerveau, les axones RGC peuvent être activés en plaçant une électrode bipolaire enregistrement sur le chiasma optique (Figure 6A). Tous les enregistrements effectués dans la préparation de tout le cerveau aussi est possible à l’aide de cette préparation de tranches de cerveau horizontale. Figure 6 B montre une trace de l’exemple d’une réponse évoquée par le CJR a enregistré d’un neurone dans la couche superficielle. Cette préparation permet également de la répartition spatiale des entrées synaptiques RGC sur les dendrites opposantes à mesurer. Pour ce faire, les potentiels de champ induite par le CJR sont enregistrées chaque 10 µm dans l’axe de medial bilatérales (c.-à-d., l’axe proximale-distale) de la neuropile (Figure 6C). Cette opération génère un profil à haute résolution du modèle d’entrée RGC fonctionnelle. Les potentiels de champ peuvent ensuite être transformés en des densités de source actuelle en calculant la deuxième dérivée spatiale14 et les densités de source actuel peuvent à son tour se transformer en une parcelle de l’image. Le tracé de l’image dans la Figure 6C montre que la plus forte entrée RGC cible la zone plus distale de la neuropile.
La figure 1. In vivo procédures de préparation de. Têtard (A) coincé sur un morceau d’élastomère de silicone. Goupilles sont indiqués par les flèches blanches. Notez le positionnement de broches plus caudal pour éviter d’empaler le tractus optique. La ligne pointillée blanche indique la ligne médiane. (B) Zoomed-compte tenu de l’ensemble du cerveau après la coupe le long de la ligne médiane dorsale et enlever la peau de superposition. (C) enregistrement de patch-clamp de la cellule entière en vivo. (L: latérale. M: médiale. R : rostrale. C: caudale. D: dorsale. V: ventrale. OB : bulbe olfactif. OT : Tectum optique. HB : Cerveau postérieur). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Tout cerveau procédures de préparation de. (A) après le cerveau est en filets le long de la ligne médiane, le cerveau postérieur est rompu. (B), l’ensemble du cerveau est disséqué sur et cloué à l’élastomère de silicone. L’astérisque blanche indique la goupille dans le bulbe olfactif gauche. La zone rouge indique le tiers médian du tectum, c'est-à-dire, la zone cible pour l’enregistrement. (C) cellules entières pince enregistrement patch en utilisant la préparation de tout le cerveau. L’astérisque noir indique la zone de non gratté membrane ventriculaire où les cellules ne sont pas accessibles pour l’enregistrement. Lorsque la membrane a été supprimée, les corps cellulaires semblent plus distincts et définis. La flèche indique un neurone malsain. (PZ : Zone proliférative. LMV : Grand ventricule médial. OB : bulbe olfactif. OT : Tectum optique. HB : cerveau postérieur. L: latérale. M: médiale. R : rostrale. C: caudale. D: dorsale. V: ventrale). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Procédures de préparation de tranche horizontale cerveau. (A) la partie la plus latérale d’un côté du tectum optique va être tranchés (indiqué par la ligne pointillée) après une préparation tout le cerveau. Préparation de tranches de cerveau horizontale (B) après avoir été repoussés vers le côté de l’élastomère de silicone. Des lignes blanches doubles représentent une électrode de stimulation placée sur le chiasma optique. (C) Zoomed-en vue des couches de soma et neuropile utilisant une préparation de tranches de cerveau horizontale. Courbe en pointillé indique la limite entre les couches de soma et neuropile. Ce chiffre a été modifié par harach, et al. 14 (L: latérale. M: médiale. R : rostrale. C: caudale. D: dorsale. V: ventrale. OB : bulbe olfactif. OC : chiasma. OT : Tectum optique. HB : Cerveau postérieur). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Enregistrements à partir d’une préparation en vivo . (A) schéma montrant la configuration typique d’un enregistrement in vivo . Lumière (B) a évoqué notamment la lumière sur les réponses et la lumière s’éteint les réponses. Traces de médaillon sont zoomé dans vue de sur - et hors-réponse, respectivement. (C) spontanée courants postsynaptiques excitateurs enregistrement. Na (D)+ et K+ courants en réponse à voltage clamp étapes de -60 mV à 30 mV d’un seul neurone. (E) IV parcelles produits des traces au point D. Tous les enregistrements ont été réalisés avec le neurone qui s’est tenu à -60 mV sauf en (ré) pour générer des IV-emplacements ; les neurones sont a fait un pas de plus en plus plus dépolarisées potentiels, par incréments de 10 mV, pour activer des courants de voltage-dépendants. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 . Enregistrements à partir d’une préparation de cerveau entier. (A) schéma montrant la configuration typique des enregistrement de cerveau entier, y compris une électrode de stimulation placé sur le chiasma optique (lignes vertes et rouges représentent les axones RGC). (B) superposition retrace des réponses aux changements d’intensité de stimulation RGC RGC. (C) Maximum stimulation réponse (à gauche) et une stimulation minimale (à droite). (D) évoquée par le CJR une réponse excitatrice et inhibitrice sur un seul neurone. Facilitation de la réponse induite par le CJR d’un neurone individuel d’impulsions jumelés (E). (OB : bulbe olfactif. OC : chiasma. OT : Tectum optique). Tous les enregistrements ont été réalisés avec le neurone qui s’est tenu à -60 mV sauf en (D) pour mesurer les entrées excitatrices et inhibitrices : l’entrée excitatrice est enregistrée en organisant le neurone dans le potentiel d’inversion de l’acide γ-aminobutyrique (GABA)-mediated chlorure courants (mv-45) ; l’entrée inhibitrice en organisant le neurone dans le potentiel d’inversion de l’acide α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (AMPA)-mediated courants (+ 5 mv). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 . Enregistrements de l’encéphale horizontal tranche préparation. (A) schéma montrant la configuration d’une préparation de tranches de cerveau horizontale. Notez que bien que l’électrode de stimulation reste au chiasma optique, la pipette d’enregistrement est maintenant positionné aux cellules de l’accès à travers toutes les couches tectal exposés par la préparation de tranches de cerveau horizontale. (B) une réponse de la GRC d’un neurone qui résident dans la couche superficielle du tectum. (C) enregistrés potentiels de champ à travers le neuropile et les densités source actuelle converti (CSDs) illustrées par image intrigue cartes de chaleur. (OC : chiasma. OT : Tectum optique. HB : Cerveau postérieur). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Toutes les méthodes décrites dans cet ouvrage sont optimisés pour l’enregistrement des neurones tectal des têtards entre le stade de développement 42 et 49 (mise en scène selon Neiuwkoop et Faber15). Par étape 42, les têtards sont suffisamment vaste et suffisamment développée pour que les insectes broches peuvent être placés sur chaque côté du cerveau in vivo enregistrements et pour mener à bien la dissection du cerveau entier. Aux premiers stades, lorsque les têtards sont essentiellement à deux dimensions (i.e., plat), les approches décrites ici ne sont pas optimales.
En raison de la facilité dans laquelle les neurones tectal sont accessibles et enregistrés en configuration cellule entière, ce circuit de modèle a été un lieu de prédilection pour des découvertes fondamentales sur la forme de circuits neuronaux comment tout en fonctionnement - et fonction tout en formant des19. Ici, nous avons décrit comment acquérir des cellules entières patch clamp enregistrements de neurones opposantes, notamment comment effectuer le têtard en vivo et préparations tout le cerveau, l’enregistrement de différentes configurations et exemples des différents types de données. Ce qui suit est une discussion sur les points forts et les limites de chaque préparation, suivie de conseils pour réaliser des enregistrements de haute qualité à germes entiers.
Les têtards de Xenopus commencent affichant des comportements d’évitement visuel par étape 47/48, environ 7 à 8 jours après la fertilisation3,13. Cela signifie que, même à des stades relativement précoces de développement, le circuit de rétino est opérationnel et capable de traiter des stimuli visuels. Des questions fondamentales concernant le développement et la plasticité du circuit rétino ont été abordées directement à l’aide de la préparation in vivo pour enregistrer les réponses de neurone tectal à des stimuli visuels projetés sur la rétine. In vivo des enregistrements dans le têtard sont relativement simples par rapport à la configuration de l’enregistrement équivalent chez les mammifères en raison de la relative simplicité du système nerveux et manque d’un crâne. Somas neurone tectal individuels pouvant être visualisées en vivo, étanchéité sur un neurone donné et atteindre la configuration enregistrement de germes entiers patch clamp revient essentiellement à réaliser patch clamp de la cellule entière en tranche rongeur préparations. Les têtards survivent généralement pendant plusieurs heures sur le banc d’essai (qui peuvent être facilement évaluées par le battement du cœur de surveillance). Une des limitations inhérentes du têtard en vivo préparation sont que seulement tectal neurones dans la couche profonde somatique du tectum optique, la couche qui est juste à côté du grand ventricule moyen, sont accessibles pour l’enregistrement (Figure 1 ). Cela signifie que les neurones tectal résidant dans les couches externes somatiques du tectum ont été largement inexplorés in vivo.
L’avantage expérimentale de la préparation du cerveau entier est qu’il isole le cerveau depuis les récepteurs sensoriels périphériques dans les yeux et la peau, éliminant toute l’activité sensorielle axée fallacieuse. Alors que n’est plus capable de conduite par des stimuli visuels, les entrées axonales RGC qui ciblent le tectum sont toujours présentes dans la préparation de tout le cerveau et ils peuvent être activés directement de façon très contrôlée par une électrode bipolaire stimulante (FHC) placée sur le chiasma où les deux ensembles de parcelles axon RGC pénétrer dans le cerveau. La première utilisation déclarés de la préparation de tout le cerveau était en 1996, dans une importante étude par Wu et al. 8, dont les axones RGC ont été activés à l’aide d’une électrode de stimulation bipolaire telle que les auteurs pourraient quantifier la force des axones RGC individuels sur les neurones postsynaptiques générés, en faisant faire des découvertes fondamentales sur la progression de maturation de la synapse. Comme pour la préparation in vivo , la préparation de tout le cerveau permet d’accéder à seulement ces neurones dans la couche profonde, adjacente à la membrane ventriculaire.
Bien que le tectum optique est composé d’environ neuf corps cellulaire couches17, toutes les études d’électrophysiologie antérieures ont mis l’accent sur les neurones de la couche profonde tectal parce que le cerveau entier traditionnel et in vivo des préparations (décrites ci-dessus) permet l’accès uniquement aux neurones de la couche profonde. Afin d’accéder aux neurones tectal travers toutes les couches somatiques, des plus profondes au plus superficielles ainsi que l’ensemble de la neuropile où RGC axones forment les connexions synaptiques avec les dendrites des neurones tectal, nous avons développé une préparation mis à jour le cerveau entier, dénommée « le préparation de tranches de cerveau horizontale » (Figure 3,14). Comme pour la préparation de tout le cerveau, la préparation de tranches de cerveau horizontal maintient les axones RGC dans le cerveau et ils peuvent être contrôlés en plaçant une électrode de stimulation bipolaire sur le chiasma optique.
Dans l’ensemble, les préparations sont conçues pour optimiser la visualisation d’et l’accès aux corps cellulaires de neurones tectal pour procéder à l’enregistrement de germes entiers patch clamp. Direct accès à soma est essentiel pour des enregistrements de qualité à germes entiers patch clamp : accès à l’intérieur du neurone exige la formation d’une très forte (> 1 × 109 Ω) joint entre la pipette et la membrane plasmique du neurone, qui exige en direct contact de l’embout de la pipette sur cette membrane. Par conséquent, suppression suffisante de la membrane ventriculaire est clé pour l’enregistrement avec succès. Clé pour bons enregistrements évoquée par le CJR est également le placement correct de l’électrode de stimulation bipolaire sur le chiasma optique. Essentiellement tous les neurones tectal reçoivent une entrée synaptique directe des axones RGC. Si aucune réponse évoquée par le CJR n’est observée, alors c’est très probablement due à un positionnement incorrect de l’électrode bipolaire tel qu’il n’est pas sur le chiasma optique et ne communiquant pas avec les nerfs optiques. Ceci peut être corrigé par simplement re-positionnement de l’électrode stimulante. Non-respect des réponses évoquées par RGC après que le repositionnement de l’électrode bipolaire peut signifier que la projection d’axon RGC a été sectionné accidentellement au cours de la dissection. Dans ce cas, il est nécessaire de recommencer avec une nouvelle préparation. Enfin, une réponse évoquée par la CJR le non-respect pourrait découler de l’enregistrement à partir d’une cellule qui n’est pas un neurone tectal commun. Par exemple, les cellules gliales ne s’affichent pas en général à la réaction normale d’évoquée par le CJR monosynaptique affichée par les neurones tectal et pas plus que les neurones mésencéphaliques importantes ont été constatées, mais à très faibles effectifs, résidant dans le tectum optique20. La probabilité d’enregistrement d’un de ces cellules non-tectal est très faible en raison du nombre important de neurones tectal. Bien sûr, des enregistrements de qualité exigent également les neurones opposantes pour être en bonne santé. Caractéristiques d’un neurone tectal sain sont un compact soma rond ou ovale qui est claire et sans imperfections. Une fois la configuration d’enregistrement à germes entiers ont été réalisée, la santé du neurone peut être évaluée plus loin au niveau électrophysiologique par mesure des propriétés électriques fondamentale comme le potentiel de membrane, résistance d’entrée et une capacité de repos . Le potentiel membranaire de repos des neurones tectal sain entre les stades de développement 42 et 49 est environ -45 mV, avec une résistance d’entrée moyenne d’environ 1 GΩ et une capacité de 10-12 pF3,4,5. Une petite fraction des neurones est inévitablement endommagée en raison de la suppression de la membrane ventriculaire. Les corps cellulaires des neurones endommagés ou insalubres apparaissent granuleuses, gonflé ou échaudés. Un exemple d’un neurone malsain est illustré Figure 2C. Si la majorité des neurones apparaître malsaine, cela pourrait être une réflexion qu’il y a quelque chose de mal avec la solution d’enregistrement externe, il est donc recommandé pour compenser les frais d’enregistrement externe solution. Outre apparaissant en bonne santé, les neurones meilleures pour l’enregistrement sont généralement associés à un grand nombre d’autres neurones, plutôt que d’être isolé. En outre, choisir les cellules qui sont facilement accessibles. Par exemple, ne poussez pas le tissu trop difficile d’accéder à une cellule car cela pourrait endommager les tissus ou déplacer les tissus et ainsi changer l’électrode stimulante hors de propos. Enfin, les enregistrements devraient se limiter au tiers médian du tectum (Figure 2B) pour éviter des différences de potentiel en raison de la pente du développement qui existe dans l’ensemble de l’axe rostro-caudal4,8, à moins, bien sûr, la mise au point de l’expérience est le gradient de développement susmentionné. Le tectum approprié est la région rostrale de la zone proliférative et caudale vers le bord caudal du grand ventricule moyen.
Le patch clamp à germes entiers de la technique d’enregistrement n’est pas sans ses limites. En général, ce style d’enregistrement implique un neurone d’enregistrement à la fois. C’est contrairement aux approches faisant intervenir l’imagerie d’une nouvelle génération d’indicateurs de calcium GCaMP6, qui permettent à l’activité de grandes populations de neurones sont projetés simultanément dans une préparation de tranches et in vivo.
Un autre inconvénient inhérent aux enregistrements de pince de tension à germes entiers est l’erreur de pince de l’espace (l’incapacité de contrôler la tension beaucoup plus loin, au-delà du soma), qui limite le contrôle temporel de tension4. Dans l’ensemble, ces questions de serrage de tension sont minimes, lors de l’enregistrement de neurones tectal cependant, en raison de leur taille relativement petite et modestes ramifications dendritiques courants relativement petits et lents par rapport aux neurones chez les mammifères. Ces caractéristiques des neurones tectal rendent particulièrement propices pour bride de tension d’enregistrement, mesure de nombreux paramètres et la construction de profils pour les neurones individuels5,6.
Orientations futures comprennent optimiser une préparation en vivo horizontal cerveau tranche pour caractériser la fonction des neurones de la couche externe dans le traitement des stimuli visuels.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Financée par la NIH subvention SBC COBRE 1P20GM121310-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Dissecting microscope |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Amphibian general anesthetic |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Used to prepare Stienberg's solution |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare Steinberg's solution |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Used to prepare external recording solution |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Used to prepare external recording solution |
| D-glucose Anhydrous | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare external recording solution |
| Tubocurarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379 | Nicotinic acetylcholine receptor antagonist |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm diameter stainless steel pins |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761028 | Preweighed monomer and curing agent kit |
| Sterile Polystyrene Petri Dish - 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Small petri dishes |
| PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | 305122 | Syringe needles |
| 1mL Slip Tip Tuberculin Syringe | BD | 309659 | Disposable, sterile syringes |
| Borosilicate pipette glass | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Pulled to desired specifications using pipette pulling machine |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Fabricates micropipettes for electrophysiology recording |
| Kimwipes Kimtech wipes | Kimberly-Clark | 34120 | Delicate task lint-free wipers |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Current clamp and voltage clamp headstage |
| MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller | Sutter Instrument | MP-285/T | Control for headstage on electrophysiology rig |
| Fiber-Coupled LED (Green) | Thorlabs | M530F2 | Fiber optic cable paired with green LED |
| Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter) | FHC | 30207 | Bipolar stimulating electrode |
| ISO-Flex Stimulator | A.M.P.I. (Israel) | Contact manufacturer | Flexible stimulus isolator |
| Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplifier for voltage- and current-clamp recording |
| Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | 2500-135 | Data acquisition system for electrophysiology recording |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Microscope for electrophysiology |
| Micro-g Lab Table | TMC | 63-533 | Air table for electrophysiology microscope |
| Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit | Dell | D06D001 | Computer running electrophysiology software |
| c2400 CCD camera | Hamamatsu | 70826-5 | Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging |
| 7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades | Gillette | CMM01049 | Platinum-coated stainless razor blades |
| Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-711-7M | Disposable Polyethylene transfer pipets |
References
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
- Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
- Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit. Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole. J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit. J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).
- Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity. Elife. 4, 11351 (2015).
- Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).
- Wu, G., Malinow, R. Cline H.T. of a central glutamatergic synapse. Science. , 972-976 (1996).
- Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism. Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).
- Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development. Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), e705 (2008).
- Dong, W., et al. Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum. J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum. J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland. New York. (1994).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J. Vis. Exp. (112), e54024 (2016).
- Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure. Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).
- Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles. Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).
- Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function. Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles. J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).
