Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Forberedelser og protokoller for hele cellen Patch klemme opptak i Xenopus laevis Tectal nerveceller

Published: March 15, 2018 doi: 10.3791/57465

Summary

I dette papiret diskutere vi tre hjernen preparater brukes for registrering av hele cellen oppdateringen klemme for å studere retinotectal kretsen av Xenopus laevis rumpetroll. Hver forberedelse, med sin egen spesielle fordeler, bidrar til den eksperimentelle tractability av Xenopus rumpetroll som modell å studere nevrale krets-funksjonen.

Abstract

Xenopus rumpetroll retinotectal krets, består av netthinnen ganglieceller (RGCs) i øyet som skjemaet synapser direkte på nerveceller i den fiberoptisk tectum, er en populær modell å studere hvordan nevrale kretser selv montere. Muligheten til å utføre hele cellen oppdateringen klemme opptak fra tectal nevroner og registrere RGC-utløste svar, enten i vivo eller bruke en hele hjernen forberedelse, har generert en stor mengde høyoppløselige data om mekanismene bak normal , og unormale krets dannelse og funksjon. Beskriver her vi hvordan du utfører i vivo utarbeidelse, opprinnelige hele hjernen utarbeidelse, og mer nylig utviklet vannrett hjernen stykke forberedelse for å få hele cellen oppdateringen klemme opptak fra tectal neurons. Hvert preparat har unike eksperimentelle fordeler. I vivo utarbeidelsen gjør opptak av direkte svaret tectal neurons visuelle stimuli projisert på øyet. Hele hjernen forberedelse gir RGC axons aktiveres på en svært kontrollert måte, og vannrett hjernen stykke utarbeidelsen gjør opptak fra over alle lag av tectum.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Retinotectal krets er det større komponenten av amfibier visuelle systemet. Det består av RGCs i øyet, som prosjektet deres axons å fiberoptisk tectum hvor de danner synaptic forbindelser med postsynaptic tectal neurons. Xenopus rumpetroll retinotectal krets er en populære utviklingsmessige modellen nevrale krets dannelse og funksjon. Det er mange attributter for denne rumpetroll retinotectal som gjør det en kraftig eksperimentell modell1,2,3. En viktig egenskap, og fokus i denne artikkelen, er muligheten til å utføre hele cellen oppdateringen klemme opptak fra tectal nerveceller, i vivo eller bruker en hele hjernen forberedelse. Med en elektrofysiologi riggen utstyrt med en forsterker som støtter spenning - og gjeldende-klemme opptaksmodi, tillate hele cellen oppdateringen klemme innspillinger en Nevron elektrofysiologi å være preget med høy oppløsning. Som et resultat, har hele cellen oppdateringen klemme opptak fra tectal neurons over viktige stadier av retinotectal krets dannelsen gitt en detaljert og omfattende forståelse av utviklingen og plastisitet av iboende4,5 , 6 , 7 og synaptic8,9,10,11 egenskaper. Kombinere hele cellen oppdateringen klemme tectal Nevron innspillinger, muligheten til å uttrykke genene eller morpholinos av disse neurons12og metode for å vurdere visuelle guidede atferd via en etablert visuelle unngåelse test13 fremmer den Identifikasjon av koblinger mellom molekyler, krets-funksjonen og virkemåte.

Det er viktig å merke seg at typen høyoppløselig data fra hele cellen oppdateringen klemme innspillinger ikke er mulig med nyere tenkelig tilnærminger som indikatoren genetisk kalsium GCaMP6, fordi selv om bruker kalsium indikatorer tillater avbilding kalsium dynamics over store bestander av neurons samtidig, det er ikke direkte eller åpenbar måte at de spesifikke elektriske parameterne kan fås ved å måle delta fluorescens i somata, og det er ingen måte å spenning klemme Nevron måle nåværende-spenning relasjoner. Åpenbart disse to forskjellige tilnærminger, elektrofysiologiske opptak og kalsium bildebehandling, har ikke-overlappende styrker og generere forskjellige typer data. Derfor den beste tilnærmingen er avhengig av spesifikke eksperimentelle spørsmål blir adressert.

Her beskriver vi vår metode for å skaffe hele cellen oppdateringen klemme opptak fra nevroner i rumpetroll fiberoptisk tectum bruker en i vivo forberedelse, hele hjernen forberedelser, og en nyere endret hele hjernen forberedelse som ble utviklet i vår lab14 . I delen representant resultater viser vi eksperimentelle fordelene av hvert preparat og forskjellige datatypene som kan oppnås. Grenser og styrkene til forskjellige preparater, samt tips for feilsøking, inkluderes under diskusjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av University of Wyoming. Alle prosedyrer, inkludert elektrofysiologiske innspillinger, utføres i romtemperatur, ca 23 ° C. Alle metodene som er beskrevet her er optimalisert for opptak tectal neurons fra rumpetroll mellom utviklingen scene 42 og 49 (iscenesatt etter Neiuwkoop og Faber15).

1. i Vivo forberedelse

  1. Bedøve i rumpetroll.
    1. Plasser i rumpetroll i en liten Petriskål inneholder Steinberg løsning med 0,01% MS-222 for ca 5 min.
      Merk: MS-222 aka "Tricaine" er en felles fisk og amfibium bedøvende. I rumpetroll er oppvokst i Steinbergs løsning i mM: 0.067 KCl, 0.034 Ca (ingen3)2•4H2O, 0.083 MgSO4•7H2O, 5,8 NaCl, 4,9 HEPES.
    2. Kontroller i rumpetroll er dypt anaesthetized (utilgjengelig og ikke lenger svømming) før du går videre til trinn 2.
  2. Sikre de bedøvet rumpetroll i et neddykket silikon dissekere/opptak rett på gulvet.
    1. Bruk en engangs overføring pipette for å flytte anaesthetized rumpetroll til en disseksjon/opptak rett som inneholder eksterne innspillingen løsning (115 mM av NaCl, 2 mM KCl, 3 mM av CaCl2, 3 mM av MgCl2, 5 mM HEPES, 1 mM av glukose; justere pH 7.25 bruke 10 N av NaOH, osmolaritet 255 mOsm).
      1. For å minimere spontan muskel rykninger, legge acetylcholin reseptor blokkering, tubocurarin (100 µM) til eksterne løsning. (Vanligvis dette gjøres ved hjelp av en 200 µL pipette legge 100 µL av en 10 mM tubocurarin aksje til 10 mL av eksterne løsning).
    2. Bruker insekt pinner, sikre i rumpetroll, dorsal side, i et neddykket silikon (for eksempel Sylgard 184, se Materialer tabell for detaljer), som har vært limt til dissecting parabolen gulvet.
      Merk: Plassering av pinnene er kritisk: plasseres på hver side av hjernen, tilstrekkelig caudal å unngå impaling afferente RGC axons prosjektet fra øyet og inn i hjernen bare anterior fiberoptisk tectum (figur 1A).
  3. Filet hjernen langs midtlinjen.
    1. Et klart syn på hjernen, fjerne huden overliggende hjernen ved å gjøre en overfladisk snitt langs midtlinjen bruker en steril nål 25-G.
    2. Filetere hjernen langs den samme midtlinjen-aksen ved å sette inn nålen i medfødte og trekke forsiktig oppover (på ryggen) slik at den dorsal delen av røret er rent kuttet (kuttet) mens gulvplaten intakt (figur 1B).
      Merk: Det er viktig at gulvplaten av medfødte være intakt fordi afferente sensoriske innganger inn i tectum via gulvplaten.
  4. Fjerne gjennomsiktig ventrikkel membranen som dekker tectal neurons.
    1. Flytte opptak rett til elektrofysiologi riggen og bruke en knust glass pipette tips for å fjerne ventrikkel membranen overliggende tectal Nevron cellen legemer. Bryte spissen av lett dra den over en delikate oppgaven vindusvisker.
    2. Skru pipette inn i pipette-holderen og senk den ned på fiberoptisk tectum via micromanipulator.
    3. Bruk den ødelagte pipette Peel ventrikkel membranen fra tectum.
      Merk: Det er ikke nødvendig å fjerne membranen fra hele tectum; et lite vindu vil nok og gir tilgang til mange neurons.
  5. Få hele cellen oppdateringen klemme innspillinger.
    Merk: Tilnærming fra dette tidspunktet ligner gjennomføre hele cellen oppdateringen klemme innspillinger fra musen hjernen sektorene som beskrevet i Segev, et al. 16 (Figur 1C).
  6. Registrere tectal Nevron svar hele feltet blits lys på netthinnen.
    1. For å projisere en hele feltet lysblink på netthinnen, plass en optisk fiber tilstøtende i rumpetroll øyet. På den andre enden av optisk fiber er en LED i tråd med en variabel resistor som gir lys lystettheten skal kontrolleres. Utløse ledet av den digitale utgangen av forsterkeren. På denne måten registrert hele feltet blinker av varierende intensitet av lys kan være (Figur 4A).

2. hele hjernen forberedelse

  1. Utfør trinnene 1.1 å 1.3.
    Merk: Det er ikke nødvendig for tubocurarin i eksterne løsningen for dette preparatet.
  2. Isolere hjernen.
    1. Bruk en 25-G nål bryte hindbrain (figur 2A).
    2. For å isolere hele hjernen fra i rumpetroll, kjøre forsiktig nålen under hjernen, caudal til rostral retning bryte alle laterale og ventrale bindevev og nerve fibre.
  3. Sikre hjernen til en blokk med silikon.
    1. Når helt frigjort, sikre hjernen til en blokk med silikon-elastomer ved å plassere en pin gjennom en av olfactory pærer og en annen pin gjennom hindbrain (figur 2B). Dette er den optimale konfigurasjonen for opptak fra tectal neurons.
  4. Flytte parabolen som inneholder låste hele hjernen utarbeidelse fra dissecting området til elektrofysiologi riggen. Fjerne ventrikkel membranen bruker en knust glass pipette som beskrevet i trinn 1.4.
  5. Plass en bipolar stimulerende elektrode på optikk chiasm (hvor axon landområder fra hvert kors på mellomhjernen) for å aktivere direkte RGC axons.
    1. Plass bipolar stimulerende elektroden rostral og nesten grenser til, store midten ventrikkel. Optikk chiasm ligger umiddelbart rostral til store midten ventrikkel (figur 2B).
      1. Forsiktig lavere stimulerende elektroden ned på optikk chiasm slik at en liten bulk dannes i vevet. Bipolar elektroden er drevet av en puls stimulator som lar styrken av stimulans til kontrolleres nøyaktig.
  6. Utføre hele cellen oppdateringen klemme innspillingen (figur 2C) som beskrevet av Segev, et al. 16

3. vannrett hjernen stykke forberedelse

  1. Utfør trinnene 2.1 til 2.3.
  2. Bruk et barberblad for å avgiftsdirektoratet mest lateral fjerde (som i vivo tilsvarer den mest dorsal fjerde) av en side av en fiberoptisk tectum. Dette kuttet gjøres parallelt med rostral-caudal flyet som vist i Figur 3A.
  3. Re-knappenål hjernen ved siden av silikon-elastomer med den skiver siden vendt opp (slik at de somata og neuropil kan nås direkte for opptak) og ventrikkel overflaten av hjernen vendt fra silikon elastomer blokken (Figur 3 B) (slik at en bipolar elektrode kan plasseres på optikk chiasm).
  4. Utføre hele cellen oppdateringen klemme eller lokale arkivert potensielle opptak (Figur 3C) som beskrevet av Segev, et al. 16

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For å registrere lys-utløste svar er en hele feltet lysblink projisert på netthinnen mens resulterende respons registreres fra individuelle tectal neurons (Figur 4A). Dette bestemte protokollen er utformet for å måle både responsen av Nevron lys aktivere ("On" svar) og deretter slå av 15 senere å måle på "Off svar." Tectal neurons vanligvis viser robust og på svar (vist her i spenning klemme modus, med Nevron festet til - 60mV for å måle synaptic gjeldende (Figur 4B)). Mengden av synaptic stasjonen mottatt av noen en Nevron kan kvantifiseres ved spontan synaptic hendelser (Figur 4C). Nåværende-spenning relasjoner (IV kurver) kan genereres fra samme Nevron av stepping Nevron til stadig depolarized potensial og den resulterende spenning-aktivert Na+ og K+ strøm, referert til som "blandet gjeldende opptak"(Figur 4D, E). Det har vært godt etablert for disse amfibier neurons, topp Na+ og K+ strømmer kan kvantifiseres via blandet gjeldende opptak fordi toppene ikke timelig overlapper med en annen4,7.

Aktivering av RGC axons på optikk chiasm går utenom alle oppstrøms beregning og behandling av visuelle stimuli som finner sted i øyet, og tillater studere synaptic overføring mellom presynaptic RGC axons og postsynaptic tectal nerveceller i sin mest rent og redusert form. Tectal Nevron Svar å RGC aktivisering genereres fra RGCs stimulert av lys eller direkte med en bipolar stimulerende elektrode som består av to komponenter: en monosynaptic komponent (direkte synaptic inndataene fra aktivert RGCs) og en polysynaptic komponenten (lokalt tilbakevendende nettverk aktivitet fôring tilbake på Nevron registreres). Ved lys vakte svarene overlapper monosynaptic og polysynaptic komponenter med hverandre noen undeterminable beløp. Denne timelige overlapping begrenser hva kan konkluderes om synaptic overføring mellom netthinnen og optisk tectum. Bruke en hele hjernen forberedelse og aktivere det RGC axon spor direkte via en elektrode plassert på optikk chiasm (figur 5A), men produserer en mono- og polysynaptic komponent som er i hovedsak ikke-overlappende i tid. Stimulerende styrken på bipolar elektroden kan justeres. Som stimulerende styrken er økt, er det et større antall RGC axons aktivert (figur 5B). En minimal stimulering protokollen bestemmer synaptiske styrke en individuell RGC axon på en individuell tectal Nevron; en maksimal stimulering protokollen gjenspeiler totalen eller maksimum, synaptic inndata fra alle RGC axons kombinert (figur 5C). De riktige forholdet mellom eksitatoriske til hemmende synaptic inndata (E: Jeg forholdet) mottatt av en individuell tectal Nevron er viktig for normal visuelle funksjon18. Figur 5 D viser et eksempel på RGC-utløste eksitatoriske og inhibitory gjeldende spor spilt inn fra en individuell tectal Nevron. Sannsynligheten for at senderen fra RGC presynaptic axon terminaler måles i sammenkoblede puls innspillinger. For dette, er postsynaptic tectal Nevron registrert i spenning klemme modus for å måle synaptic strøm, mens RGC axons aktiveres suksessivt, atskilt med et 50 ms tidsintervall (figur 5E).

Hele cellen oppdateringen klemme opptak kan utføres fra tectal nerveceller i et somatisk lag. Ligner hele hjernen utarbeidelse, RGC axons kan aktiveres ved å plassere en bipolar opptak elektrode på optikk chiasm (figur 6en). Alle opptak i hele hjernen utarbeidelse kan også utføres ved hjelp av denne vannrette hjernen stykke forberedelse. Figur 6 B viser et eksempel på en sporing av en RGC-utløste respons innspilt fra en Nevron i overfladisk laget. Dette preparatet kan også romlig mønsteret RGC synaptic inngang på tectal dendrites skal måles. For dette, RGC-utløste feltet potensialer registreres hvert 10 µm langs mediale-lateral akse (dvs., den distale-proksimale aksen) neuropil (figur 6C). Dette genererer en høyoppløselig profil av mønsteret av funksjonelle RGC input. Feltet potensial kan deretter transformeres til gjeldende kilde tettheter ved å beregne de andre romlige avledede14 og de gjeldende kilde tettheter kan igjen bli forvandlet til en bilde plot. Bildet plottet i figur 6C viser at sterkeste RGC input mål mer distale området i neuropil.

Figure 1
Figur 1. I vivo forberedelse prosedyrer. (A) rumpetroll låste ned på et stykke silikon. Pins er angitt med hvite pilene. Merk flere caudal pin posisjonering for å unngå impaling fiberoptisk traktater. Den hvite stiplede linjen angir midtlinjen. (B) bratt stigning i se hele hjernen etter klipping langs dorsal midtlinjen og fjerne overliggende huden. (C) hele celle patch-klemme opptak i vivo. (L: Lateral. M: mediale. R: Rostral. C: Caudal. D: Dorsal. V: ventrale. OB: Luktelappen. OT: Optisk Tectum. HB: Hindbrain). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Hele hjernen forberedelse prosedyrer. (A) når hjernen er filetert langs midtlinjen, hindbrain er kuttet. (B) hele hjernen er dissekert ut og låst silikon-elastomer. Den hvite stjernen angir pin i venstre olfactory pære. Den røde boksen angir den midtre tredjedelen av tectum, dvs., målområdet for opptak. (C) hele cellen oppdateringen klemme innspilling med hele hjernen forberedelse. Svart stjernen angir området av un skrapte ventrikkel membran der cellene ikke tilgjengelig for innspilling. Hvor membranen er fjernet, vises somata mer distinkte og definert. Pilen viser en usunn Nevron. (PZ: proliferativ sone. LMV: Store mediale ventrikkel. OB: Luktelappen. OT: Optisk Tectum. HB: Hindbrain. L: lateral. M: mediale. R: Rostral. C: Caudal. D: Dorsal. V: ventrale). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Vannrett hjernen stykke forberedelse prosedyrer. (A) den mest laterale delen av en side av fiberoptisk tectum vil bli skiver (indikert ved den stiplede linjen) etter hele hjernen forberedelse. (B) vannrett hjernen stykke forberedelse etter blir låst ved siden av silikon-elastomer. Dobbel hvite linjer representerer en stimulerende elektrode plassert på optikk chiasm. (C) bratt stigning i utsikt over soma lag og neuropil bruker en vannrett hjernen stykke forberedelse. Stiplet kurven viser soma lag og neuropil. Dette tallet har blitt endret fra Hamodi, et al. 14 (L: Lateral. M: mediale. R: Rostral. C: Caudal. D: Dorsal. V: ventrale. OB: Luktelappen. OC: optikk Chiasm. OT: Optisk Tectum. HB: Hindbrain). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Opptak fra en i vivo forberedelse. (A) skjematisk viser vanlig konfigurasjon for en in vivo -opptak. (B) lys utløste svar inkludert lys og lys av svar. Innfelt spor er zoomet inn visningen av på og av-svar, henholdsvis. (C) spontan eksitatoriske postsynaptic strømmer inn. (D) Na+ og K+ strøm svar på spenning klemme skritt fra-60 mV til 30 mV fra en enkelt Nevron. (E) IV tomter fra spor i (D). Alle innspillinger ble gjort med Nevron holdt på-60 mV unntatt i (D) å generere IV-tomter; neurons er gikk til stadig mer depolarized potensial, i 10 mV intervaller, aktivere spenning-avhengige strømninger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 . Opptak fra en hele hjernen forberedelse. (A) skjematisk viser typiske konfigurasjon av hele hjernen innspillingen inkludert en stimulerende elektrode plassert på optikk chiasm (grønne og røde linjene representerer RGC axons). (B) overliggende spor av RGC svar endringer av RGC stimulering styrke. (C) maksimum stimulering response (venstre) og minimum stimulering response (høyre). (D) en RGC-utløste eksitatoriske og inhibitory svar på en enkelt Nevron. (E) parvise puls tilrettelegging av svaret RGC-fremkalt av en enkelt Nevron. (OB: Luktelappen. OC: optikk Chiasm. OT: Fiberoptisk Tectum). Alle innspillinger ble gjort med Nevron holdt på-60 mV unntatt i (D) å måle eksitatoriske og inhibitory innganger: eksitatoriske input registreres ved å holde Nevron på tilbakeføring potensialet for γ-Aminobutyric acid (GABA)-mediert klorid strøm (-45 mv); hemmende input ved å holde Nevron på tilbakeføring potensialet av α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syre (AMPA)-mediert strøm (5 mv). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 . Opptak fra en vannrett hjerne skjær forberedelse. (A) skjematisk viser konfigurasjonen av en horisontal hjernen stykke forberedelse. Merk at selv om stimulerende elektroden forblir på optikk chiasm, innspilling pipette er nå posisjonert til tilgang celler over alle tectal lag av horisontale hjernen stykke utarbeidelse. (B) en RGC svar fra en Nevron bosatt i overfladisk laget av tectum. (C) registrert feltet potensialer over neuropil og de konverterte gjeldende kilde tettheter (verdipapirsentraler) vist av tomten varme bildekart. (OC: optikk Chiasm. OT: Optisk Tectum. HB: Hindbrain). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle metodene som er beskrevet i dette arbeidet er optimalisert for opptak tectal neurons fra rumpetroll mellom utviklingen scene 42 og 49 (iscenesatt etter Neiuwkoop og Faber15). Scenen 42, i rumpetroll er tilstrekkelig store og tilstrekkelig utviklet slik at insekt pinnene kan plasseres på hver side av hjernen i vivo opptak og for å gjennomføre hele hjernen dissection. På tidligere stadier, når i rumpetroll er i hovedsak todimensjonale (dvs., flat), tilnærminger beskrevet her er ikke optimal.

På grunn av brukervennlighet som kan tectal neurons åpnes og registrert i hele cellekonfigurasjon, har denne modell kretsen vært et arnested for grunnleggende funn om hvordan nevrale kretser form mens fungerer- og funksjonen mens forming19. Her har vi beskrevet hvordan du kjøpe hele cellen oppdateringen klemme opptak fra tectal neurons, inkludert hvordan du utfører i rumpetroll i vivo og hele hjernen forberedelser, ulike opptak konfigurasjoner og eksempler på ulike typer data. Følgende er en diskusjon om styrker og begrensninger av hvert preparat, etterfulgt av tips for å oppnå høy kvalitet hele cellen innspillinger.

Xenopus rumpetroll begynne å vise visuelle unngåelse atferd av stage 47/48, ca 7-8 dager etter befruktning3,13. Dette betyr at selv om disse relativt tidlige stadier av utviklingen, retinotectal krets er fungerende og kan behandle visuelle stimuli. Grunnleggende spørsmål om utvikling og plastisitet av retinotectal kretsen er direkte rettet bruker i vivo forberedelse til å registrere tectal Nevron svar på visuelle stimuli projisert på netthinnen. I vivo opptakene i i rumpetroll er relativt enkel sammenlignet med tilsvarende opptak konfigurasjonen i pattedyr på grunn av den relative enkelheten av nervesystemet og mangel på en hodeskalle. Personlige tectal neuron somas kan være visualisert i vivo, er forsegling på en gitt Nevron og oppnå hele cellen oppdateringen klemme opptak konfigurasjon i hovedsak tilsvarer gjennomføre hele cellen oppdateringen klemme i gnager skive forberedelser. Rumpetroll overleve vanligvis i flere timer på riggen (som kan vurderes lett ved å overvåke hjerteslag). En begrensning iboende i rumpetroll i vivo forberedelser er at bare tectal neurons bosatt i dypt somatiske laget av fiberoptisk tectum, laget som er umiddelbart til store midten ventrikkel, er tilgjengelig for innspilling (figur 1 ). Dette betyr at tectal neurons i det ytterste somatiske lag av tectum har vært stort sett uutforsket i vivo.

Eksperimentelle fordelen av hele hjernen preparat er at isolerer hjernen fra eksterne sensoriske reseptorene i øynene og huden og eliminere alle falske sensoriske innsatsdrevet aktivitet. Mens ikke lenger kan drives av visuelle stimuli, RGC axonal innganger at målet på tectum er fortsatt til stede i hele hjernen utarbeidelsen og de direkte kan aktiveres på en svært kontrollert måte via en bipolar stimulerende elektrode (FHC) plassert på optikk chiasm der de to settene med RGC axon traktater inn i hjernen. Den første rapporterte bruken av hele hjernen preparatet var i 1996, i en viktig studie av Wu et al. 8, i hvilken RGC axons ble aktivert ved hjelp av en bipolar stimulerende elektrode slik at forfatterne kunne kvantifisere styrken på individuelle RGC axons på postsynaptic tectal neurons, og så gjorde grunnleggende oppdagelser om utviklingen av synapse modning. Som med i vivo utarbeidelse, gir hele hjernen forberedelse tilgang til bare disse nervecellene i det dype hudlaget, tilstøtende ventrikkel membranen.

Selv om den fiberoptisk tectum består av ca ni celle kroppen lag17, alle tidligere elektrofysiologi studier har fokusert på dype lag tectal neurons fordi tradisjonelle hele hjernen og i vivo forberedelsene (beskrevet gir tilgang bare til nervecellene i det dype hudlaget over). For å få tilgang tectal neurons over alle somatiske lag, fra dypest mest overfladiske og hele neuropil der RGC axons danne synaptic forbindelser med tectal Nevron dendrites, utviklet vi en endret hele hjernen forberedelse, referert til som "den vannrett hjernen stykke forberedelse"(Figur 314). Som med hele hjernen utarbeidelse, vannrette hjernen stykke utarbeidelse opprettholder RGC axons i hjernen, og de kan kontrolleres ved å plassere en bipolar stimulerende elektrode på optikk chiasm.

Total, forberedelsene er designet for å optimalisere visualisering av og tilgang til tectal neuron somata å gjennomføre hele cellen oppdateringen klemme opptak. Direkte tilgang til soma er avgjørende for kvalitet hele cellen oppdateringen klemme opptak: tilgang til innsiden av Nevron krever dannelsen av en meget sterk (> 1 × 109 Ω) forsegle mellom pipette og nevrons plasma membran, som krever direkte Kontakt pipette tips på at membran. Derfor er tilstrekkelig fjerning av ventrikkel membranen nøkkelen for vellykkete innspilling. Nøkkelen til vellykket RGC-utløste opptak er også den riktige plasseringen av bipolar stimulerende elektroden på optikk chiasm. Egentlig alle tectal neurons motta direkte synaptic inngang fra RGC axons. Hvis ingen RGC-utløste respons er observert, så er dette mest sannsynlig skyldes feil plassering av bipolar elektroden slik at det ikke er på optikk chiasm og ikke kontakte optiske nervene. Dette kan korrigeres ved å bare plassere re stimulerende elektroden. Svikt observere RGC-utløste svar etter re posisjonering bipolar elektroden kan bety at RGC axon projeksjon kuttet tilfeldigvis under dissection. I dette tilfellet er det nødvendig å begynne på en ny forberedelse. Til slutt, svikt observere en RGC-utløste respons kan skyldes opptak fra en celle som ikke er en vanlig tectal Nevron. For eksempel glia vanligvis vises ikke normal RGC-utløste monosynaptic svaret vises tectal neurons, og heller ikke store mesencephalic neurons som er funnet, om enn på svært lavt tall, bosatt i fiberoptisk tectum20. Sannsynligheten for opptak fra en av disse ikke-tectal cellene er svært lav på grunn av det store antallet tectal neurons. Selvfølgelig, kreve kvalitet opptak også tectal neurons å være sunn. Kjennetegner en sunn tectal Nevron er en kompakt runde eller ovale soma som er lyse og uten lyter. Når hele cellen opptak konfigurasjon er oppnådd, kan helse Nevron videre evalueres på elektrofysiologiske nivå ved å måle grunnleggende elektriske egenskaper som hviler membran potensialet, inngang motstand og kapasitans . Hvile membran potensialet av sunn tectal neurons mellom utviklingsstadier 42 og 49 er ca -45 mV, med en gjennomsnittlig input motstand av ca 1 GΩ og en kapasitans 10-12 pF3,4,5. En liten brøkdel av neurons vil uunngåelig bli skadet på grunn av fjerning av ventrikkel membranen. Somata av skadede eller usunn neurons vises kornete, oppsvulmet, eller krympet. Et eksempel på en usunn Nevron vises figur 2C. Hvis fleste av neurons vises usunn, kan dette være en refleksjon som det er noe galt med den eksterne innspillingen løsningen, så det anbefales å gjøre opp frisk eksterne innspillingen løsning. I tillegg vises sunn, er beste neurons for opptak vanligvis assosiert med en rekke andre neurons, i motsetning til blir isolert. Også velge celler som er lett tilgjengelig. For eksempel ikke Skyv vev for vanskelig å få en celle fordi dette kan skade vev eller flytte vev og dermed forskyve stimulerende elektroden malplassert. Til slutt, innspillinger bør begrenses til de midtre tredjedelen av tectum (figur 2B) å unngå potensielle forskjeller på grunn av utviklingsmessige graderingen som finnes over rostro-caudal akse4,8, med mindre, selvfølgelig, er fokus for eksperimentet nevnte utviklingsmessige graderingen. Tectum riktig er området rostral i sonen proliferativ og caudal caudal kanten av store midten ventrikkel.

Hele cellen oppdateringen klemmen opptak teknikk er ikke uten begrensninger. Generelt innebærer denne stilen av innspillingen innspilling en Nevron samtidig. Dette er metoder som involverer avbildning av en ny generasjon GCaMP6 kalsium indikatorer, som gir mulighet for aktiviteten til store bestander av neurons å avbildes samtidig i en skive forberedelse og i vivo.

En annen ulempe ligger hele cellen spenning klemme innspillinger er plass klemme feilen (manglende evne til å kontrollere spenningen mye lenger utover soma), som begrenser timelige kontroll av spenning4. Samlet er disse spenning klemme problemene minimal registrere fra tectal neurons imidlertid på grunn av deres relativt liten og slow strømninger sammenlignet pattedyr neurons med relativt liten størrelse og beskjeden dendrittiske arborizations. Disse karakteristikkene av tectal neurons gjengi dem spesielt mottagelig for spenning klemme opptak, måling av mange parametere, og bygging av profiler for individuelle neurons5,6.

Fremtidige retninger inkluderer optimalisere en i vivo vannrett hjernen stykke forberedelse å karakterisere funksjonen av ytre lag neurons i behandlingen av visuelle stimuli.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Støttet av NIH stipendet SBC COBRE 1P20GM121310-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stemi Stereo 508 Zeiss 495009-0006-000  Dissecting microscope
MS-222 "Tricane" Finquel ARF5G Amphibian general anesthetic
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-3 Used to prepare Stienberg's solution and external solution
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific P217-500 Used to prepare Stienberg's solution and external solution
HEPES Sigma-Aldrich H3375-1KG Used to prepare Stienberg's solution and external solution
Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O) Sigma-Aldrich 237124-500G Used to prepare Stienberg's solution  
Magnesium Sulfate (MgSO4) Mallinckrodt Chemicals 6066-04 Used to prepare Steinberg's solution
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5080-500G Used to prepare external recording solution
Magnesium Chloride (MgCl2) J.T. Baker 2444-01 Used to prepare external recording solution
D-glucose Anhydrous Mallinckrodt Chemicals 6066-04 Used to prepare external recording solution
Tubocurarine hydrochloride pentahydrate Sigma T2379 Nicotinic acetylcholine receptor antagonist
Insect Pins Fine Science Tools 26002-10 0.1mm diameter stainless steel pins
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 761028 Preweighed monomer and curing agent kit
Sterile Polystyrene Petri Dish - 60x15mm Fisher Scientific AS4052 Small petri dishes
PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) BD 305122 Syringe needles
1mL Slip Tip Tuberculin Syringe  BD 309659 Disposable, sterile syringes
Borosilicate pipette glass Sutter Instrument BF150-86-10HP Pulled to desired specifications using pipette pulling machine
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instruments P-97 Fabricates micropipettes for electrophysiology recording
Kimwipes Kimtech wipes Kimberly-Clark 34120 Delicate task lint-free wipers
Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B Molecular Devices 1-CV-7B Current clamp and voltage clamp headstage
MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller Sutter Instrument MP-285/T Control for headstage on electrophysiology rig
Fiber-Coupled LED (Green) Thorlabs M530F2 Fiber optic cable paired with green LED
Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter) FHC 30207 Bipolar stimulating electrode
ISO-Flex Stimulator A.M.P.I. (Israel)  Contact manufacturer Flexible stimulus isolator
Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier Molecular Devices 2500-0157 Amplifier for voltage- and current-clamp recording 
Digidata 1322A digitizer Molecular Devices 2500-135 Data acquisition system for electrophysiology recording
Axio Examiner.A1 Zeiss 491404-0001-000  Microscope for electrophysiology
Micro-g Lab Table TMC 63-533 Air table for electrophysiology microscope
Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit Dell D06D001 Computer running electrophysiology software
c2400 CCD camera Hamamatsu 70826-5 Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging
7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades Gillette CMM01049 Platinum-coated stainless razor blades
Transfer Pipets Fisher Scientific 13-711-7M Disposable Polyethylene transfer pipets

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
  2. Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3, (2), 129-136 (2015).
  3. Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit. Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).
  4. Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole. J. Neurophysiol. 112, (7), 1644-1655 (2014).
  5. Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit. J. Neurosci. 27, (31), 8268-8277 (2007).
  6. Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity. Elife. 4, 11351 (2015).
  7. Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39, (5), 831-842 (2003).
  8. Wu, G., Malinow, R. Cline H.T. of a central glutamatergic synapse. Science. 972-976 (1996).
  9. Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism. Neuron. 87, (5), 1050-1060 (2015).
  10. Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development. Neuron. 70, (3), 455-467 (2011).
  11. Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395, (6697), 37-44 (1998).
  12. Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), e705 (2008).
  13. Dong, W., et al. Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum. J. Neurophysiol. 101, (2), 803-815 (2009).
  14. Hamodi, A. S., Pratt, K. G. The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum. J. Neurophysiol. 113, (1), 400-407 (2015).
  15. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). Garland. New York. (1994).
  16. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J. Vis. Exp. (112), e54024 (2016).
  17. Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure. Curr. Biol. 24, (16), 1929-1933 (2014).
  18. Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles. Eur. J. Neurosci. 40, (6), 2948-2962 (2014).
  19. Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function. Trends Neurosci. 44, (4), 183-192 (2010).
  20. Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles. J. Neurophysiol. 102, (1), 399-412 (2009).
Forberedelser og protokoller for hele cellen Patch klemme opptak i <em>Xenopus laevis</em> Tectal nerveceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, Z., Donnelly, K. B., Pratt, K. G. Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons. J. Vis. Exp. (133), e57465, doi:10.3791/57465 (2018).More

Liu, Z., Donnelly, K. B., Pratt, K. G. Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons. J. Vis. Exp. (133), e57465, doi:10.3791/57465 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter