Summary
In diesem Artikel besprechen wir drei Gehirn-Präparate für die ganze Zelle Patch Clamp Aufzeichnung die Retinotectal Schaltung von Xenopus Laevis Kaulquappen zu studieren. Jede Vorbereitung, mit ihren eigenen spezifischen Vorteilen, trägt zur experimentellen Lenkbarkeit des Xenopus Kaulquappe als Vorbild für neuronale Schaltkreis-Funktion zu untersuchen.
Abstract
Die Xenopus Kaulquappe Retinotectal Schaltung, bestehend aus der retinalen Ganglienzellen (Routinggruppenconnectors) in das Auge, welches Formular direkt auf Neuronen in der optic Tectum Synapsen, ist ein beliebtes Modell, wie neuronale Schaltkreise zu studieren selbst zusammensetzen. Die Fähigkeit zur Durchführung der gesamten Zelle Patch Clamp Aufnahmen vom tectal Neuronen und zum Rekord RGC-evozierten Antworten, entweder in Vivo oder mit einer ganzen Gehirn Zubereitung, hat einen großen Körper der hochauflösenden Daten über die normalen Mechanismen erzeugt , und abnorme, Schaltung Bildung und Funktion. Hier beschreiben wir in Vivo Vorbereitung, die ursprüngliche ganze Gehirn-Vorbereitung, Durchführung und mehr vor kurzem horizontalen Gehirn Slice Vorbereitung für den Erhalt der gesamten Zelle Patch Clamp Aufnahmen von tectal Neuronen. Jede Vorbereitung hat einzigartige experimentelle Vorteile. Die in Vivo -Vorbereitung ermöglicht die Aufzeichnung der direkte Reaktion des tectal Neuronen auf visuelle Reize, die auf das Auge projiziert. Die ganze Gehirn Vorbereitung ermöglicht die RGC Axone sehr kontrollierte Art und Weise aktiviert werden, und die horizontalen Gehirn Slice Vorbereitung ermöglicht die Aufnahme von über alle Ebenen der Tectum.
Introduction
Die Retinotectal-Schaltung ist der Hauptbestandteil des Sehsystems Amphibien. Es umfasst die Routinggruppenconnectors im Auge, die ihre Axone, die optic Tectum Projekt wo sie synaptische Verbindungen mit tectal postsynaptischen Neuronen bilden. Die Xenopus Kaulquappe Retinotectal Schaltung ist ein beliebtes Entwicklungs Modell Untersuchung neuronaler Schaltkreis Bildung und Funktion. Es gibt viele Attribute dieser Kaulquappe Retinotectal Schaltung, die es ein leistungsfähiges experimentellen Modell1,2,3machen. Ein wichtiges Attribut, und der Schwerpunkt dieses Artikels ist die Möglichkeit, ganze Zelle Patch Clamp Aufnahmen aus tectal Neuronen, in Vivo oder über eine ganze Gehirn Vorbereitung durchzuführen. Mit einem Elektrophysiologie Rigg ausgestattet mit einem Verstärker, der Spannung und Strom-Klemme Aufnahmemodi unterstützt, können ganze Zelle Patch Clamp Aufnahmen eines Neurons Elektrophysiologie bei hoher Auflösung charakterisiert werden. Infolgedessen haben ganze Zelle Patch Clamp Aufnahmen von tectal Neuronen über die wichtigsten Phasen der Retinotectal Schaltung Bildung ein detailliertes und umfassendes Verständnis für die Entwicklung und Plastizität der intrinsischen4,5 zur Verfügung gestellt , 6 , 7 und synaptischen8,9,10,11 Eigenschaften. Kombinieren ganze Zelle Patch Clamp tectal Neuron Aufnahmen, fördert die Möglichkeit, Gene oder Morpholinos Interesse an diesen Neuronen12und eine Methode, um visuelle Führung Verhalten über eine etablierte visuellen Vermeidung Test13 beurteilen die Identifizierung von Verbindungen zwischen Molekülen, Kreislauf-Funktion und Verhalten.
Es ist wichtig zu beachten, dass die hohe Auflösung, die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahmen gewonnenen Daten nicht mit neueren bildgebenden Ansätze wie die genetische Kalzium-Anzeige GCaMP6, da geht obwohl Kalzium Indikatoren mit die Bildgebung erlaubt von Calcium Dynamik über große Populationen von Neuronen gleichzeitig, es gibt keine direkte oder naheliegender Weise, dass die spezifischen elektrischen Parameter erhalten Sie durch die Messung der Fluoreszenz-Delta in den Somata, und es keine Möglichkeit, Spannung gibt Klemme das Neuron nach Maß Strom-Spannungs-Beziehungen. Klar, diese zwei unterschiedliche Ansätze, elektrophysiologische Aufnahmen und Kalzium Imaging, besitzen nicht überlappende stärken und erzeugen verschiedene Arten von Daten. Somit hängt der beste Ansatz von experimentellen konkret in Angriff genommen.
Hier beschreiben wir unsere Methode für den Erwerb der ganze Zelle Patch Clamp Aufnahmen von Neuronen der Kaulquappe optic Tectum mit einer in Vivo -Vorbereitung, ganze Gehirn Vorbereitung und eine neuere verändert ganze Gehirn-Vorbereitung, die in unserem Labor14 entwickelt wurde . Im Abschnitt Vertreter Ergebnisse zeigen wir die experimentelle Vorteile jeder Vorbereitung und die verschiedenen Arten von Daten, die abgerufen werden können. Die Grenzen und Stärken der verschiedenen Zubereitungen, sowie Tipps zur Fehlerbehebung, sind in die Diskussion Abschnitt enthalten.
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Protocol
Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Wyoming genehmigt. Alle Verfahren, einschließlich elektrophysiologische Aufnahmen erfolgt bei Zimmertemperatur ca. 23 ° C. Alle hier beschriebene Methoden sind für die Aufzeichnung von tectal Neuronen von Kaulquappen zwischen Entwicklungsstadium 42 und 49 (inszeniert nach Neiuwkoop und Faber15) optimiert.
1. in-Vivo -Vorbereitung
- Die Kaulquappe zu betäuben.
- Legen Sie die Kaulquappe in eine kleine Petrischale mit Steinbergs Lösung mit 0,01 % MS-222 für ca. 5 Minuten.
Hinweis: MS-222 aka "Tricaine" ist eine gemeinsame Fische und Amphibien Narkose. Die Kaulquappen sind aufgewachsen in der Steinberg-Lösung in mM: 0,067 KCl, 0,034 Ca (NO3)2•4H2O, 0.083 MgSO4•7H2O, 5,8 NaCl, 4,9 HEPES. - Sicherstellen Sie, dass die Kaulquappe tief betäubt (nicht mehr reagiert und nicht mehr schwimmen) bevor Sie mit Schritt 2 fortfahren.
- Legen Sie die Kaulquappe in eine kleine Petrischale mit Steinbergs Lösung mit 0,01 % MS-222 für ca. 5 Minuten.
- Sichern Sie den narkotisierten Kaulquappe zu einem versunkenen Silikon Block auf dem Boden der Schale sezieren/Aufnahme.
- Verwenden eine Einweg-Transferpipette narkotisierter Kaulquappe auf eine Dissektion/Aufnahme-Schale mit externen Aufzeichnungslösung verschieben (115 mM NaCl, KCl, 2 mM 3 mM CaCl2, 3 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 1 mM Glukose; justieren pH bis 7,25 mit 10 N NaOH, Osmolarität 255 mOsm).
- Zur Minimierung von spontanen Muskel zuckt, Hinzufügen der Acetylcholin-Rezeptor-Blocker, Tubocurarin (100 µM), die externe Lösung. (In der Regel geschieht dies durch die Verwendung einer 200 µL Pipette 10 mL externe Lösung 100 µL einer 10 mM Tubocurarin Aktie hinzu).
- Mit Hilfe der Insekten Pins, sichern die Kaulquappe, Rückenseite, einem untergetauchten Block aus Silikon-Elastomer (z. B. Sylgard 184, siehe Materialtabelle für Details), die hat auf den sezierenden Gericht Boden geklebt worden.
Hinweis: Die Platzierung der Pins ist kritisch: Legen Sie sie auf beiden Seiten des Gehirns, zu vermeiden, durchbohrt die afferenten RGC Axone ausreichend kaudalen dieses Projekt aus dem Auge und geben das Gehirn nur anterior optic Tectum (Abb. 1A).
- Verwenden eine Einweg-Transferpipette narkotisierter Kaulquappe auf eine Dissektion/Aufnahme-Schale mit externen Aufzeichnungslösung verschieben (115 mM NaCl, KCl, 2 mM 3 mM CaCl2, 3 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 1 mM Glukose; justieren pH bis 7,25 mit 10 N NaOH, Osmolarität 255 mOsm).
- Filet im Gehirn entlang der Mittellinie.
- Entfernen Sie für eine klare Sicht auf das Gehirn die Haut über das Gehirn durch einen oberflächlichen Schnitt entlang der Mittellinie mit einer sterilen Nadel 25 G.
- Filetieren Sie und das Gehirn entlang der gleichen Mittellinie Achse durch Einsetzen der Nadel in das Neuralrohr und ziehen sanft nach oben (dorsal) solche, die der dorsale Teil des Rohres sauber (abgetrennten) geschnitten wird beim Verlassen der Bodenplatte intakt (Abbildung 1B).
Hinweis: Es ist wichtig, dass die Bodenplatte des Neuralrohrs intakt gelassen werden, weil die afferenten sensorischen Inputs über die Bodenplatte der Tectum eingeben.
- Entfernen Sie die transparente ventrikuläre Membran, die die tectal Neuronen deckt.
- Bewegen Sie die Aufnahme Schale Elektrophysiologie-Rig und eine zerbrochenes Glas-Pipettenspitze, um ventrikuläre Membran darüberliegenden tectal Neuron Zelle stellen zu entfernen. Brechen Sie die Spitze von leicht über eine heikle Aufgabe Scheibenwischer ziehen.
- Schrauben Sie die Pipette in die Pipette Halterung und senken Sie es hinunter die optic Tectum über dem Mikromanipulator.
- Verwenden Sie die defekte Pipette um zu schälen die ventrikuläre Membran von der Tectum.
Hinweis: Es ist nicht notwendig, die Membran aus der gesamten Tectum entfernen; ein kleines Fenster wird genügen und den Zugriff auf viele Neuronen.
- Erhalten Sie die gesamte Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen.
Hinweis: Der Ansatz von diesem Punkt an ist ähnlich Durchführung ganze Zelle Patch Clamp Aufnahmen von Maus Gehirnscheiben beschriebenen Segev, Et al. 16 (Abbildung 1C). - Zeichnen Sie die tectal Neuron Antworten auf ein ganzes Feld Lichtblitz auf die Netzhaut projiziert.
- Um ein ganzes Feld Lichtblitz auf die Netzhaut zu projizieren, platzieren Sie eine Glasfaser neben der Kaulquappe Auge. Am anderen Ende der optischen Faser ist eine LED im Einklang mit einem Variablen Widerstand, der für die leichte Leuchtdichte kontrolliert werden kann. Auslöser der LED durch den digitalen Ausgang des Verstärkers. Auf diese Weise aufgezeichnet ganze Feld, das Lichtblitze unterschiedlicher Intensität des Lichts werden können (Abb. 4A).
2. ganzes Gehirn Vorbereitung
- Führen Sie Schritte 1.1 bis 1.3.
Hinweis: Gibt es keine Notwendigkeit für Tubocurarin in die externe Lösung für dieses Präparat. - Das Gehirn zu isolieren.
- Verwenden Sie eine 25-G-Nadel Hinterhirn (Abb. 2A) zu durchtrennen.
- Um das ganze Gehirn von der Kaulquappe zu isolieren, führen Sie die Nadel sanft unter das Gehirn in einer kaudalen, rostral Richtung alle lateralen und ventralen Bindegewebe und Nervenfasern zu durchtrennen.
- Sichern Sie das Gehirn in einen Block aus Silikon-Elastomer.
- Sobald völlig befreit, sichern Sie das Gehirn in einen Block aus Silikon-Elastomer indem man eine Nadel durch eines der olfaktorischen Birnen und einem anderen Stift durch das Hinterhirn (Abbildung 2B). Dies ist die optimale Konfiguration für die Aufnahme von tectal Neuronen.
- Verschieben Sie die Schale mit der fixierten ganze Gehirn Vorbereitung vom sezierenden Anwendungsbereich der Elektrophysiologie-Rig. Entfernen Sie die ventrikuläre Membran mit einer Pipette Glasscherben, wie unter Punkt 1.4 beschrieben.
- Legen Sie eine bipolare Elektrode anregendste auf Optik Chiasmus (wo kreuzen die Axon-Traktate von jedem Auge im Mittelhirn) um die RGC Axone direkt zu aktivieren.
- Ort der bipolaren anregende Elektrode rostral und fast neben dem großen mittleren Ventrikel. Die Optik Chiasmus befindet sich unmittelbar rostral zum großen mittleren Ventrikel (Abbildung 2B).
- Senken Sie sanft die anregende Elektrode nach unten auf die Optik Chiasmus derart, dass eine kleine Delle im Gewebe gebildet wird. Die bipolare Elektrode treibt ein Puls-Stimulator ermöglicht die Stärke der Stimulation genau kontrolliert werden.
- Ort der bipolaren anregende Elektrode rostral und fast neben dem großen mittleren Ventrikel. Die Optik Chiasmus befindet sich unmittelbar rostral zum großen mittleren Ventrikel (Abbildung 2B).
- Führen Sie die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme (Abbildung 2C), wie durch Segev, Et Al. beschrieben 16
3. horizontale Gehirn Slice Vorbereitung
- Führen Sie Schritte 2.1 bis 2.3.
- Verwenden Sie eine Rasierklinge, Verbrauchsteuern am seitlichen viertes (welche in Vivo am dorsalen vierten entspricht) von einer Seite von einem optic Tectum. Dieser Schnitt erfolgt parallel zur rostral-kaudalen Ebene, wie in Abbildung 3dargestellt.
- Neu pin das Gehirn auf die Seite der Silikon-Elastomer mit den in Scheiben geschnittenen Seite nach oben (so dass die Somata und Neuropil direkt für die Aufnahme zur Verfügung steht) und die ventrikuläre Oberfläche des Gehirns abgewandten des Silikon-Elastomer-Blocks (Abbildung 3 B) (so, dass eine bipolare Elektrode auf die Optik Chiasmus platziert werden kann).
- Durchführen Sie die ganze Zelle Patch Clamp oder lokale eingereichten mögliche Aufzeichnung (Abb. 3C), wie beschrieben durch Segev, Et al. 16
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Representative Results
Um Licht-evozierten Antworten zu erfassen ist ein ganzes Feld Lichtblitz auf die Netzhaut projiziert, während die resultierende Reaktion von einzelnen tectal Neuronen (Abb. 4A) erfasst wird. Dieses besondere Protokoll wurde entwickelt, um sowohl die Reaktion des Neurons, das Licht einschalten ("On" (Antwort) und dann ausschalten 15 Messen s später zu messen, die "Off-Antwort." Tectal Neuronen weisen in der Regel robuste ein- und Ausschalten Antworten (gezeigt hier aufgenommenen in Klammer Spannungsmodus, mit dem Neuron geklemmt, - 60mV, um synaptische Strom (Abbildung 4B) zu messen). Die Höhe der synaptischen Antrieb erhielt von jedem eine Nervenzelle kann durch spontane synaptische Ereignisse (Abb. 4C) quantifiziert werden. Strom-Spannungs-Beziehungen (Spannungs-Kurven) können aus der gleichen Neuron durch den Ausbau des Neurons, zunehmend depolarisiert Potentiale generiert und Aufzeichnung der resultierende Spannung aktiviert Na+ und K+ Strömungen, bezeichnet als "aktuelle gemischt Recordings"(Abbildung 4D, E). Es wurde gut etabliert, die für diese Amphibien Neuronen peak Na+ und K+ Ströme über gemischte aktuelle Aufnahmen quantifiziert werden können, weil der Gipfel nicht zeitlich miteinander4,7überschneiden.
Direkte Aktivierung der RGC Axone in die Optik Chiasmus umgeht alle vorgelagerten Berechnung und Verarbeitung von visuellen Reizen, die stattfinden im Auge und kann für das Studium der synaptischen Übertragung zwischen präsynaptischen RGC Axone und tectal postsynaptischen Neuronen in seiner die meisten reinen und reduzierter Form. Tectal Neuron Antworten auf RGC Aktivierung entstehen aus Routinggruppenconnectors angeregt durch Licht oder direkt über eine bipolare anregende Elektrode, bestehend aus zwei Komponenten: einer monosynaptischen Komponente (der synaptischen Direkteingabe von aktivierten Routinggruppenconnectors) und einen polysynaptischen Komponente (die wiederkehrenden Ortsnetz Aktivität Fütterung wieder auf das Neuron aufgenommen wird). Bei den leichten evozierten Antworten überschneiden sich die monosynaptischen und polysynaptischen Komponenten miteinander durch gewisse unbestimmbar. Diese zeitliche Überlappung begrenzt, was über synaptische Übertragung zwischen der Netzhaut und optic Tectum abgeschlossen werden kann. Mit eine Gesamt-Hirn-Vorbereitung und Aktivierung des RGC Axon Trakts direkt über eine Elektrode platziert auf der Optik Chiasmus (Abb. 5A), erzeugt jedoch ein Mono- und polysynaptische Komponente, die im Wesentlichen nicht-überlappende rechtzeitig. Die anregende Kraft der bipolare Elektrode kann eingestellt werden. Da die stimulierende Kraft erhöht wird, gibt es eine größere Anzahl von RGC Axone aktiviert (Abb. 5B). Eine minimale Stimulation Protokoll bestimmt die synaptische Stärke von einem einzelnen RGC Axon auf eine einzelne tectal Neuron; eine maximale Stimulation Protokoll spiegelt die Summe oder maximum, synaptische Input von allen die RGC Axone kombiniert (Abbildung 5C). Das richtige Verhältnis von exzitatorischen zu hemmenden Synapsen Eingang (E: Ich Verhältnis) erhielt von einer Einzelperson tectal Neuron ist entscheidend für die normale Sehfunktion18. Abbildung 5 D zeigt ein Beispiel der RGC-evozierten exzitatorischen und inhibitorischen aktuelle Spuren aufgezeichnet von einer einzelnen tectal Neuron. Die Wahrscheinlichkeit, dass der Sender-Veröffentlichung von RGC präsynaptischen Axon Terminals wird durch gekoppelte Puls Aufnahmen gemessen. Hierzu ist der postsynaptischen tectal Neuron in Klemme Spannungsmodus zu synaptischen Ströme zu messen, während die RGC Axone nacheinander aktiviert werden, getrennt durch ein Zeitintervall von 50 ms (Abbildung 5E) aufgezeichnet.
Ganze Zelle Patch Clamp Aufnahmen können von tectal Neuronen mit Wohnsitz in jeder somatischen Ebene durchgeführt werden. Ähnlich wie das ganze Gehirn Vorbereitung können RGC Axone aktiviert werden, indem man eine bipolare Aufnahme-Elektrode auf die Optik Chiasmus(Abbildung 6). Alle Aufnahmen in das ganze Gehirn Vorbereitung durchgeführt können auch mit dieser horizontalen Gehirn Slice Vorbereitung durchgeführt werden. Abbildung 6 B zeigt eine Beispiel-Ablaufverfolgung aufgezeichnet von einem Neuron in der oberflächlichen Schicht RGC-evozierten Reaktion. Dieses Präparat ermöglicht auch das räumliche Muster der RGC synaptischen Eingang auf die tectal Dendriten gemessen werden. Hierzu werden Feld RGC-evozierten Potentiale erfasst jeden 10 µm entlang der Achse des Medial-laterale (d.h. der distalen proximalen Achse) der Neuropil (Abbildung 6C). Dies erzeugt eine hochauflösende Profil des Musters der funktionalen RGC-Eingang. Die Feld-Potenziale können dann in aktuellen Quelle dichten durch die Berechnung der zweiten räumliche Derivative14 umgewandelt werden und die aktuelle Quelle dichten können wiederum in einen Plot Bild umgewandelt werden. Das Bild-Grundstück in Abbildung 6C zeigt, dass die stärksten RGC-Eingabe mehr distalen Bereich der Neuropil richtet.
Abbildung 1. In vivo Vorbereitung Verfahren. (A) Kaulquappe festgenagelt auf ein Stück Silikon-Elastomer. Pins sind durch weiße Pfeile angedeutet. Beachten Sie, die mehr kaudalen Pin Positionierung zur Vermeidung von optischen Flächen durchbohrt. Die weiße gestrichelte Linie zeigt die Mittellinie. (B) Zoomed-Ansicht des gesamten Gehirns nach dem Schneiden entlang der dorsalen Mittellinie und überstehende Haut entfernen. (C) Whole-Cell Patch-Clamp Aufnahme in Vivo. (L: Lateral. M: Medial. R: Rostral. C: kaudalen. D: Dorsal. V: Ventral. OB: Riechkolben. OT: Optic Tectum. HB: Hinterhirn). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Gesamte Gehirn Vorbereitung Verfahren. (A) Nachdem das Gehirn entlang der Mittellinie, das Hinterhirn filetiert wird durchtrennt. (B) das gesamte Gehirn seziert und festgenagelt, die Silikon-Elastomer. Das weiße Sternchen zeigt die Nadel in der linken Riechkolben. Das rote Feld zeigt im mittlere Drittel der Tectum, d. h., der Zielbereich für die Aufnahme. (C) ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme mit Gesamt-Hirn Vorbereitung. Der schwarze Stern gibt die Fläche der UN-geschabt ventrikuläre Membran wo Zellen für die Aufnahme nicht zugegriffen werden kann. Wo die Membran erfolgreich entfernt wurde, erscheinen die Somata deutliche und definiert. Der Pfeil zeigt eine ungesunde Neuron. (PZ: Proliferative Zone. LMV: Große mediale Ventrikel. OB: Riechkolben. OT: Optic Tectum. HB: Hinterhirn. L: Lateral. M: Medial. R: Rostral. C: kaudalen. D: Dorsal. V: Ventral). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Horizontale Gehirn Slice Vorbereitung Verfahren. (A) die meisten seitlichen Teil des einseitig die optic Tectum wird werden in Scheiben geschnitten (angegeben durch die gestrichelte Linie) nach der Gesamt-Hirn Zubereitung. (B) horizontale Gehirn Slice Vorbereitung nachdem er festgenagelt an der Seite des Silikon-Elastomer. Doppelte weiße Linien repräsentieren eine anregende Elektrode platziert auf der Optik Chiasmus. (C) Zoomed-Ansicht der Soma Schichten und Neuropil mit einer horizontalen Gehirn Slice Zubereitung. Gestrichelte Kurve zeigt die Grenze zwischen Soma Schichten und Neuropil. Diese Zahl wurde von Hamodi, Et Al. modifiziert 14 (L: Lateral. M: Medial. R: Rostral. C: kaudalen. D: Dorsal. V: Ventral. OB: Riechkolben. OC: Optik Chiasmus. OT: Optic Tectum. HB: Hinterhirn). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Aufnahmen aus einem in-Vivo -Vorbereitung. (A) Schaltplan zeigt die typische Konfiguration einer in-Vivo -Aufnahme. (B) Licht hervorgerufen Reaktionen einschließlich Licht an und Licht aus Antworten. Inset Spuren sind vergrößerte Ansicht der auf - und ab-Response, beziehungsweise. (C) spontane exzitatorischen postsynaptischen Ströme aufgenommen. (D) Na+ und K+ Strömungen in Reaktion auf Spannung Klemme Schritte von-60 mV bis 30 mV aus ein einzelnes Neuron. (E) IV Grundstücke aus Spuren in (D) generiert. Alle Aufnahmen erfolgten mit der Neuron statt bei-60 mV außer in (D) zum Generieren von IV-Grundstücke; Neuronen sind trat an zunehmend mehr depolarisiert Potenziale, in Schritten von 10 mV, spannungsabhängige Strömungen zu aktivieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 . Aufnahmen von einem ganzen Gehirn Vorbereitung. (A) Schaltplan zeigt die typische Konfiguration des Gesamt-Hirn Aufnahme einschließlich einer anregenden Elektrode platziert auf der Optik Chiasmus (grüne und rote Linien repräsentieren RGC Axone). (B) Überlagerung Spuren der RGC Reaktionen auf Änderungen der RGC Stimulation Stärke. (C) maximale Stimulation (links) und minimale Stimulation Antwort (rechts). (D) eine RGC-evozierten erregenden und hemmenden Antwort auf ein einzelnes Neuron. (E) Paired pulse Moderation der RGC-evozierten Reaktion einer einzelnen Nervenzelle. (OB: Riechkolben. OC: Optik Chiasmus. OT: Optic Tectum). Alle Aufnahmen erfolgten mit der Neuron statt bei-60 mV außer in (D) um die erregenden und hemmenden Eingänge zu messen: der exzitatorische Input wird durch das halten der Neuron das Umkehr-Potential der γ-Aminobuttersäure (GABA) aufgezeichnet-vermittelte Chlorid Strömungen (-45 Mv); die hemmenden Eingabe durch das Neuron auf das Potential der Umkehrung der α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Säure (AMPA) halten-Ströme (+ 5 Mv) vermittelt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 . Aufnahmen von einem horizontalen Gehirn schneiden Vorbereitung. (A) Schaltplan zeigt die Konfiguration einer horizontalen Gehirn Slice Zubereitung. Beachten Sie, dass obwohl die anregende Elektrode auf der Optik Chiasmus bleibt, die Aufnahme-Pipette ist nun Zugang Zellen über die tectal Ebenen ausgesetzt durch die horizontale Gehirn Slice Vorbereitung positioniert. (B) eine RGC Reaktion eines Neurons mit Wohnsitz in der oberflächlichen Schicht der Tectum. (C) Feld Potenziale über das Neuropil und die konvertierten aktuelle Quelle dichten (CSDs) zeigt Bild Plot Heatmaps aufgezeichnet. (OC: Optik Chiasmus. OT: Optic Tectum. HB: Hinterhirn). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Alle in dieser Arbeit beschriebene Methoden sind für die Aufzeichnung von tectal Neuronen von Kaulquappen zwischen Entwicklungsstadium 42 und 49 (inszeniert nach Neiuwkoop und Faber15) optimiert. Stufe 42, die Kaulquappen sind groß genug und ausreichend entwickelt, dass die Insekten Pins auf beiden Seiten des Gehirns für in-Vivo -Aufnahmen und für die Durchführung des gesamten Gehirns Dissektion platziert werden können. In früheren Stadien, wenn die Kaulquappen im wesentlichen zweidimensional sind (d.h., flach), die hier beschriebenen Vorgehensweisen sind nicht optimal.
Wegen der Leichtigkeit in der tectal Neuronen zugegriffen und in ganze Zelle Konfiguration aufgenommen, wurde dieser Modell-Schaltung eine Brutstätte für grundlegende Forschungen über wie neuronale Schaltkreise Form und Funktion - Funktion unter Bildung19. Hier haben wir beschrieben, wie ganze Zelle Patch Clamp Aufnahmen von tectal Neuronen, wie z. B. der Kaulquappe in Vivo und ganze Gehirn Vorbereitungen, die unterschiedliche Aufnahme Konfigurationen und Beispiele für die verschiedenen Arten von Daten durchführen zu erwerben. Das folgende ist eine Diskussion über die Stärken und Grenzen der einzelnen Vorbereitung, gefolgt von Tipps für die ganze Zelle qualitativ hochwertige Aufnahmen zu erreichen.
Xenopus Kaulquappen beginnen anzeigen visuelle Vermeidungsverhalten von Stage 47/48, ca. 7-8 Tage nach Befruchtung3,13. Dies bedeutet, dass auch bei dieser relativ frühen Stadien der Entwicklung, die Retinotectal Schaltung funktionieren und visuelle Reize verarbeiten kann. Grundlegende Fragen über die Entwicklung und Plastizität der Retinotectal Schaltung wurden direkt angesprochen, mit der in-Vivo -Vorbereitung tectal Neuron Antworten auf visuelle Reize, die auf die Netzhaut projiziert aufzeichnen. In Vivo -Aufnahmen in der Kaulquappe sind relativ einfach im Vergleich zu der gleichwertigen Aufnahmekonfiguration bei Säugetieren durch die relative Einfachheit des Nervensystems und Mangel an einem Schädel. Da einzelne tectal Neuron Somas visualisierte in Vivosein können, entspricht Abdichtung auf ein bestimmtes Neuron und ganze Zelle Patch Clamp Aufnahmekonfiguration erreichen im wesentlichen Durchführung ganze Zelle Patch Clamp Aufzeichnung Nagetier Scheibe Vorbereitungen. Kaulquappen überleben in der Regel für mehrere Stunden auf dem Prüfstand (die leicht beurteilt werden kann, durch die Überwachung des Herzschlag). Inhärente eine Einschränkung der Kaulquappe in Vivo Vorbereitung ist, dass nur tectal Neuronen mit Wohnsitz in der tiefe somatische Schicht der optic Tectum, die Schicht, die unmittelbar neben dem großen mittleren Ventrikel ist zugänglich für die Aufnahme (Abbildung 1 ). Dies bedeutet, dass tectal Neuronen mit Wohnsitz in den somatischen Außenlagen der Tectum weitgehend unerforscht wurden in-vivo.
Die experimentelle Vorteil das ganze Gehirn Vorbereitung ist, dass das Gehirn aus den peripheren sensorischen Rezeptoren in den Augen und die Haut, beseitigt alle unechten sensorisch gesteuerte Aktivitäten isoliert. Zwar nicht mehr in der Lage getrieben durch visuelle Reize, die RGC axonalen Eingänge, die auf die Tectum in das ganze Gehirn Vorbereitung noch vorhanden sind und sie direkt aktivierbar sehr kontrolliert über eine bipolare anregende Elektrode (FHC) aufgesetzt die Optik Chiasmus, wo die zwei Sätze von RGC Axon Traktaten das Gehirn zu betreten. Der erste gemeldete Einsatz das ganze Gehirn Vorbereitung war 1996 in eine wichtige Studie von Wu Et al. 8, machte in der RGC Axone aktiviert wurden mit einer bipolaren anregende Elektrode so, dass die Autoren die Stärke der einzelnen RGC Axone auf postsynaptischen Neuronen tectal quantifizieren können und dabei so grundlegende Entdeckungen über das Fortschreiten der Synapse Reifung. Wie bei der in-Vivo -Vorbereitung, ermöglicht die ganze Gehirn Vorbereitung Zugriff auf nur diese Neuronen mit Wohnsitz in der tiefen Schicht, angrenzend an die ventrikuläre Membran.
Obwohl die optic Tectum rund neun Zellkörper Schichten17besteht, alle früheren Elektrophysiologie Studien konzentrierten sich auf die Tiefe Schicht tectal Neuronen weil die traditionellen ganze Gehirn und in Vivo Zubereitungen (beschrieben siehe oben) erlauben Sie nur den Zugriff auf die Neuronen der tiefen Schicht. Um tectal Neuronen über alle somatischen Ebenen, vom tiefsten zum oberflächlichsten sowie die gesamte Neuropil gelangt wo RGC Axone synaptische Verbindungen mit tectal Neuron Dendriten bilden, entwickelten wir eine modifizierte ganze Gehirn Vorbereitung, genannt "der horizontale Gehirn Slice Vorbereitung"(Abbildung 3-14). Wie bei der Gesamt-Hirn-Vorbereitung, die horizontale Gehirn Slice Vorbereitung unterhält die RGC Axone im Gehirn und sie gesteuert werden, indem man eine bipolare Elektrode anregendste auf die Optik Chiasmus.
Insgesamt sollen die Vorbereitungen Visualisierung von und Zugang zu tectal Neuron Somata ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme durchführen zu optimieren. Direkter Zugang zu den Soma ist entscheidend für Qualität ganze Zelle Patch Clamp Aufnahmen: Zugang zum Inneren des Neurons erfordert die Bildung einer sehr starken (> 1 × 109 Ω) Abdichtung zwischen der Pipette und Plasmamembran des Neurons, das direkte erfordert Kontakt die Pipettenspitze auf die Membrane. Daher ist ausreichende Entfernung der ventrikulären Membran Schlüssel für die erfolgreiche Aufnahme. Auch ist der Schlüssel für erfolgreiche RGC-evozierten Aufnahmen die korrekte Platzierung der bipolaren anregende Elektrode auf die Optik Chiasmus. Im Wesentlichen alle tectal Neuronen erhalten synaptischen Direkteingabe von RGC Axone. Wenn keine RGC-evozierten Reaktion beobachtet wird, dann ist dies sehr wahrscheinlich durch falsche Platzierung der bipolare Elektrode, so dass es nicht auf die Optik Chiasmus und die Sehnerven nicht zu kontaktieren. Dies kann korrigiert werden, indem einfach Re-Positionierung der anregenden Elektrode. Nichtbeachtung der RGC-evozierten Antworten nach Re-Positionierung der bipolaren Elektrode, dass bedeuten könnte die RGC Axon Projektion wurde versehentlich während der Präparation durchtrennt. In diesem Fall ist es notwendig, mit einer neuen Vorbereitung zu beginnen. Schließlich kann eine RGC-evozierten Reaktion bei Nichtbeachtung durch Aufnahme aus einer Zelle sein, keine gemeinsame tectal Neuron ist. Zum Beispiel Glia zeigen in der Regel nicht die normale RGC-evozierten monosynaptische-Reaktion von tectal Neuronen angezeigt, und auch nicht die große mesencephalic Neuronen, die gefunden wurden, wenn auch in sehr geringer Anzahl, wohnhaft in der optic Tectum-20. Die Wahrscheinlichkeit der Aufnahme aus einer dieser nicht tectal Zellen ist sehr gering, aufgrund der schieren Anzahl an tectal Neuronen. Hochwertige Aufnahmen erfordern natürlich auch tectal Neuronen, gesund zu sein. Merkmale eines gesunden tectal Neurons sind eine kompakte Runde oder ovale Soma, die helle und ohne Makel ist. Ganze Zelle Aufnahmekonfiguration erreicht hat, kann die Gesundheit des Neurons weiter auf die elektrophysiologischen Ebene ausgewertet werden durch die Messung der elektrischen Grundeigenschaften wie Ruhe Membran Potenzial, Eingangswiderstand und Kapazität . Membran-Ruhepotential von gesunden tectal Neuronen zwischen Entwicklungsstadien 42 und 49 ist ca.-45 mV, mit einer durchschnittlichen Eingangswiderstand des ca. 1 GΩ und einer Kapazität von 10 bis 12 pF3,4,5. Ein kleiner Teil der Neuronen wird zwangsläufig durch die Entfernung der ventrikulären Membran beschädigt werden. Die Somata von beschädigten oder fehlerhaften Neuronen erscheinen körnig, aufgebläht oder geschrumpft. Ein Beispiel für eine ungesunde Neuron Abbildung 2C. Wenn die Mehrheit der Neuronen ungesunde angezeigt, könnte dies eine Reflexion, die gibt es etwas falsch mit der externen Aufnahmelösung, so ist es empfehlenswert, um frische externe Aufnahmelösung bilden. Außerdem gesund erscheinen, sind die besten Neuronen für die Aufnahme in der Regel verbunden mit einer großen Anzahl von anderen Neuronen, im Gegensatz zu isoliert. Darüber hinaus wählen Sie Zellen, die leicht zugänglich sind. Drücken Sie z. B. das Gewebe nicht zu hart, um eine Zelle zuzugreifen, denn dies könnte das Gewebe schädigen oder das Gewebe zu verschieben und so die anregende Elektrode fehl am Platz verschieben. Zu guter Letzt Aufnahmen auf beschränkt werden sollte im mittleren Drittel des Tectum (Abbildung 2B) mögliche Unterschiede aufgrund der Entwicklungsbiologie Farbverlauf zu vermeiden, die über die Rostro-kaudalen Achse4,8vorhanden ist, Es sei denn, natürlich, im Mittelpunkt des Experiments der vorgenannten Entwicklungsstörungen Farbverlauf. Die richtige Tectum ist der Bereich rostral der proliferativen Zone und kaudalen an den kaudalen Rand des großen mittleren Ventrikel.
Die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme Technik ist nicht ohne seine Grenzen. Im Allgemeinen beinhaltet diese Art der Aufnahme Aufnahme einer Nervenzelle zu einem Zeitpunkt. Dies ist im Gegensatz zu Ansätzen mit Darstellung einer neuen Generation GCaMP6 Kalzium Indikatoren, die für die Tätigkeit der großen Populationen von Neuronen zu erlauben, gleichzeitig in einem Slice Vorbereitung und in Vivoabgebildet werden.
Ein weiterer Nachteil, die ganze Zelle Spannung Klemme Aufnahmen ist der Raum Klemme Fehler (die Unfähigkeit zur Kontrolle der Spannung weit jenseits der Soma), die zeitliche Steuerung der Spannung4begrenzt. Alles in allem sind diese Spannung Klemme Fragen minimal bei der Aufnahme von tectal Neuronen allerdings aufgrund ihrer relativ geringen Größe, bescheidene dendritischen freilege und relativ kleine und langsame Strömungen im Vergleich zu Säugetieren Neuronen. Diese Merkmale des tectal Neuronen machen sie besonders zugänglich für Spannung Klemme Erfassung, Messung von vielen Parametern und Bau der Profile für die einzelnen Neuronen5,6.
Zukünftige Richtungen gehören Optimierung eine in Vivo horizontale Gehirn Slice Vorbereitung um die Funktion der äußeren Schicht Neuronen in der Verarbeitung von visuellen Reizen zu charakterisieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Unterstützt von der NIH Grant SBC COBRE 1P20GM121310-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Dissecting microscope |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Amphibian general anesthetic |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Used to prepare Stienberg's solution |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare Steinberg's solution |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Used to prepare external recording solution |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Used to prepare external recording solution |
| D-glucose Anhydrous | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare external recording solution |
| Tubocurarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379 | Nicotinic acetylcholine receptor antagonist |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm diameter stainless steel pins |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761028 | Preweighed monomer and curing agent kit |
| Sterile Polystyrene Petri Dish - 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Small petri dishes |
| PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | 305122 | Syringe needles |
| 1mL Slip Tip Tuberculin Syringe | BD | 309659 | Disposable, sterile syringes |
| Borosilicate pipette glass | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Pulled to desired specifications using pipette pulling machine |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Fabricates micropipettes for electrophysiology recording |
| Kimwipes Kimtech wipes | Kimberly-Clark | 34120 | Delicate task lint-free wipers |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Current clamp and voltage clamp headstage |
| MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller | Sutter Instrument | MP-285/T | Control for headstage on electrophysiology rig |
| Fiber-Coupled LED (Green) | Thorlabs | M530F2 | Fiber optic cable paired with green LED |
| Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter) | FHC | 30207 | Bipolar stimulating electrode |
| ISO-Flex Stimulator | A.M.P.I. (Israel) | Contact manufacturer | Flexible stimulus isolator |
| Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplifier for voltage- and current-clamp recording |
| Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | 2500-135 | Data acquisition system for electrophysiology recording |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Microscope for electrophysiology |
| Micro-g Lab Table | TMC | 63-533 | Air table for electrophysiology microscope |
| Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit | Dell | D06D001 | Computer running electrophysiology software |
| c2400 CCD camera | Hamamatsu | 70826-5 | Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging |
| 7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades | Gillette | CMM01049 | Platinum-coated stainless razor blades |
| Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-711-7M | Disposable Polyethylene transfer pipets |
References
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
- Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
- Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit. Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole. J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit. J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).
- Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity. Elife. 4, 11351 (2015).
- Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).
- Wu, G., Malinow, R. Cline H.T. of a central glutamatergic synapse. Science. , 972-976 (1996).
- Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism. Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).
- Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development. Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), e705 (2008).
- Dong, W., et al. Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum. J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum. J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland. New York. (1994).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J. Vis. Exp. (112), e54024 (2016).
- Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure. Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).
- Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles. Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).
- Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function. Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles. J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).
