Summary
Neste artigo, discutimos três cérebro as preparações para a gravação de grampo celular patch para estudar o circuito retinotectal de girinos de Xenopus laevis . Cada preparação, com suas próprias vantagens específicas, contribui para a rastreabilidade experimental da larva Xenopus como um modelo para estudar a função do circuito neural.
Abstract
O circuito de retinotectal de girino Xenopus , composto de células ganglionares da retina (RGCs) no olho que formam sinapses diretamente sobre os neurônios no tectum óptica, é um modelo popular para estudar circuitos neurais como auto-montagem. A capacidade de realizar toda a célula gravações de braçadeira do remendo de neurônios tectal e a gravar respostas RGC-evocada, ou na vivo ou utilizando uma preparação de todo o cérebro, tem gerado uma grande massa de dados de alta resolução sobre os mecanismos subjacentes normal e formação de circuito anormal e a função. Aqui descrevemos como executar a in vivo preparação, a preparação original de todo o cérebro, e mais recentemente desenvolveram a preparação de fatia horizontal do cérebro para a obtenção de gravações de grampo celular remendo de neurônios tectal. Cada preparação tem vantagens exclusivas experimentais. A preparação na vivo permite a gravação da resposta direta dos neurônios tectal a estímulos visuais projetadas sobre o olho. A preparação de todo o cérebro permite que os axônios RGC ser ativado em uma forma altamente controlada, e a preparação de fatia do cérebro horizontal permite a gravação de em todas as camadas do tectum.
Introduction
O circuito de retinotectal é o principal componente do sistema visual de anfíbios. É composto pelos RGCs nos olhos, que se projetam seus axônios para o tectum óptica onde formam conexões sinápticas com neurônios tectal pós-sináptica. O circuito de retinotectal de girino Xenopus é um modelo de desenvolvimento popular para estudar a função e formação de circuitos neurais. Existem muitos atributos do circuito de retinotectal dos girinos que a tornam um poderoso modelo experimental1,2,3. Um atributo importante e o foco deste artigo, é a capacidade de realizar gravações de grampo celular remendo de neurônios tectal, vivo em ou utilizar uma preparação de todo o cérebro. Com uma plataforma de eletrofisiologia, equipada com um amplificador que suporta a tensão e corrente-grampo - modos de gravação, gravações de grampo celular patch permitam eletrofisiologia de um neurônio ser caracterizado em alta resolução. Como resultado, gravações de grampo celular remendo de neurônios tectal em toda as fases chaves da formação de circuito retinotectal forneceram uma compreensão detalhada e abrangente do desenvolvimento e plasticidade de intrínseca4,5 , 6 , 7 e sináptica8,9,10,11 Propriedades. Combinando as gravações do neurônio tectal braçadeira remendo célula inteira, a habilidade de expressar genes ou morpholinos de interesse destes neurônios12e um método para avaliar o comportamento visual de guiada através de um teste de prevenção visual estabelecida13 promove o identificação de ligações entre moléculas, circuito função e comportamento.
É importante notar que o tipo de alta resolução de dados adquiridos a partir de gravações de grampo celular patch não são possíveis usar novos enfoques de imagem como o indicador de genética de cálcio GCaMP6, porque embora usando indicadores de cálcio permite a geração de imagens de cálcio dinâmica através de grandes populações de neurônios simultaneamente, há não direta ou forma óbvia de que os parâmetros elétricos específicos podem ser obtidos pela medição de fluorescência delta no somata e não há maneira de tensão grampear o neurônio para medir relações de corrente-tensão. Claramente estas duas abordagens distintas, eletrofisiológicas gravações e imagens de cálcio, possuem pontos fortes não sobrepostas e gerar diferentes tipos de dados. Assim, a melhor abordagem depende a questão experimental específica a ser tratada.
Aqui, descrevemos nosso método para a aquisição de gravações de grampo celular remendo de neurônios do tectum óptica de girino, usando uma in vivo preparação, preparação de todo o cérebro, e uma nova modificado a preparação de todo o cérebro que foi desenvolvida em nosso laboratório14 . Na seção de resultados de representante, demonstramos as vantagens experimentais de cada preparação e os diferentes tipos de dados que podem ser obtidos. Os limites e os pontos fortes de preparações diferentes, bem como dicas para solução de problemas, são incluídos na seção discussão.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Wyoming e institucional Cuidado Animal. Todos os procedimentos, incluindo gravações eletrofisiológicas, são realizados à temperatura ambiente, cerca de 23 ° C. Todos os métodos descritos aqui são otimizados para gravação tectal neurônios de girinos entre estágio desenvolvente 42 e 49 (encenado de acordo com Neiuwkoop e Faber15).
1. preparação na Vivo
- Anestesia o girino.
- Coloque o girino em um pequeno prato de Petri contendo solução de Steinberg com 0.01% MS-222 por aproximadamente 5 min.
Nota: MS-222 aka "tricaina" é um peixe comum e anfíbios anestésico. Os girinos são gerados em solução a Steinberg em mM: 0.067 KCl, 0.034 Ca (NO3)2•4H2O, 0.083 MgSO4•7H2O, NaCl 5.8, 4,9 HEPES. - Certifique-se do que girino é profundamente anestesiada (não-responsivos e não mais natação) antes de prosseguir para a etapa 2.
- Coloque o girino em um pequeno prato de Petri contendo solução de Steinberg com 0.01% MS-222 por aproximadamente 5 min.
- Fixe o girino anestesiado para um bloco de silicone submerso no chão do prato dissecando/gravação.
- Usar uma pipeta de transferência descartável para mover o girino anestesiado para um prato de dissecação/gravação contendo a solução de gravação externa (115 mM de NaCl, 2mm de KCl, com 3 mM de CaCl2, 3 mM de MgCl2, 5mm de HEPES, 1 mM de glicose; ajustar o pH para 7,25 usando 10 N de NaOH, osmolaridade 255 mOsm).
- Para minimizar o músculo espontâneo se mexer, adicione o bloqueador do receptor de acetilcolina, tubocurarina (100 µM) para a solução externa. (Normalmente, isso é feito usando uma pipeta de 200 µ l para adicionar 100 µ l de um estoque de tubocurarina 10 mM a 10 mL de solução externa).
- Usando pinos insetos, segura o girino, o lado dorsal, com uma pedra submersa de elastómero de silicone (tais como Sylgard 184, consulte Tabela de materiais para obter detalhes), que tem sido colada ao piso dissecação do prato.
Nota: A colocação dos pinos é crítica: colocá-los em ambos os lados do cérebro, caudal suficientemente para evitar empalar os axônios RGC aferentes esse projeto do olho e penetra o cérebro apenas anterior a óptica tectum (Figura 1A).
- Usar uma pipeta de transferência descartável para mover o girino anestesiado para um prato de dissecação/gravação contendo a solução de gravação externa (115 mM de NaCl, 2mm de KCl, com 3 mM de CaCl2, 3 mM de MgCl2, 5mm de HEPES, 1 mM de glicose; ajustar o pH para 7,25 usando 10 N de NaOH, osmolaridade 255 mOsm).
- Filé do cérebro ao longo da linha mediana.
- Para uma visão clara do cérebro, retire a pele sobrejacente do cérebro tornando-se uma incisão superficial ao longo da linha mediana usando uma agulha estéril de 25-G.
- Filé do cérebro ao longo do eixo da linha média mesmo inserindo a agulha no tubo neural e puxando suavemente para cima (dorsalmente) tal que a porção dorsal do tubo é cortada corretamente (cortada) deixando a placa de assoalho intacta (Figura 1B).
Nota: É importante que a placa de assoalho do tubo neural deixada intacta porque as entradas sensoriais aferentes entram o tectum através da placa de piso.
- Remova a membrana ventricular transparente que cobre os neurônios tectal.
- Mover o prato de gravação para o equipamento de eletrofisiologia e use uma ponta de pipeta de vidro quebrado para remover a membrana ventricular sobrejacente os corpos celulares de neurônios tectal. Quebre a ponta levemente arrastando-o através de um limpador de tarefa delicada.
- Dane-se a pipeta no suporte da pipeta e abaixá-la até o tectum óptica através do micromanipulador.
- Use a pipeta quebrada a casca da membrana ventricular longe o tectum.
Nota: Não é necessário remover a membrana do tectum inteira; uma pequena janela irá ser suficiente e fornecer acesso à abundância de neurônios.
- Obter a célula inteira gravações de braçadeira do remendo.
Nota: A abordagem a partir de agora é semelhante ao efectuar gravações de grampo celular remendo de fatias de cérebro de rato, conforme descrito em Segev, et al 16 (Figura 1C). - Grave as respostas tectal neurônio para um flash de todo campo de luz projetada na retina.
- Para projeta um flash de todo campo de luz na retina, coloque uma fibra óptica adjacentes ao olho do girino. No outro extremo da fibra óptica é um LED em consonância com um resistor variável que permite para a luminosidade da luz ser controlado. Acionar o LED pela saída digital do amplificador. Desta forma, todo campo flashes de diferentes intensidades de luz podem ser gravado(Figura 4).
2. todo o cérebro preparação
- Execute as etapas 1.1 a 1.3.
Nota: Não há nenhuma necessidade para tubocurarina na solução externa para esta preparação. - Isole o cérebro.
- Use uma agulha de 25 G para romper o rombencéfalo(Figura 2).
- Para isolar o cérebro inteiro do girino, passa suavemente a agulha por baixo do cérebro, em uma direção caudal e rostral para separar todas as lateral e ventral do tecido conjuntivo e fibras nervosas.
- Proteger o cérebro de um bloco de elastômero de silicone.
- Assim completamente livre, proteger o cérebro de um bloco de elastômero de silicone, colocando um pino através de um dos bulbos olfatórios e outro alfinete e o rombencéfalo (Figura 2B). Esta é a configuração ideal para gravação de neurônios tectal.
- Mova o prato que contém a preparação de cérebro inteiro fixado do escopo dissecar ao equipamento de eletrofisiologia. Remova a membrana ventricular utilizando uma pipeta de vidro quebrado, conforme descrito na etapa 1.4.
- Coloque um eletrodo bipolar estimulante sobre o quiasma óptico (onde os panfletos do axónio de cada olho cruzam no mesencéfalo) para ativar diretamente os axônios RGC.
- Coloque o eletrodo bipolar estimulante rostral e quase ao lado, o ventrículo médio grande. O quiasma situa-se imediatamente rostral ao ventrículo médio grande (Figura 2B).
- Delicadamente mais o eletrodo estimulante para baixo sobre o quiasma tal que uma pequena amolgadela é formada no tecido. O eletrodo bipolar é impulsionado por um estimulador de pulso que permite que a força de estimulação a ser precisamente controlada.
- Coloque o eletrodo bipolar estimulante rostral e quase ao lado, o ventrículo médio grande. O quiasma situa-se imediatamente rostral ao ventrículo médio grande (Figura 2B).
- Executar a gravação de grampo de remendo de célula inteira (Figura 2C) conforme descrito por Segev, et al 16
3. preparação de fatia do cérebro horizontal
- Execute os passos 2.1 para 2.3.
- Use uma lâmina de barbear para excisar a quarta mais lateral (que na vivo corresponde a quarta mais dorsal) de um lado de uma óptica tectum. Este corte é feito paralelo ao plano rostral-caudal, como mostrado na Figura 3.
- Re-pino do cérebro para o lado do elastómero de silicone com o fatiado lateral voltada para cima (de modo que o somata e neurópilo podem ser acessados diretamente por gravação) e a superfície ventricular do cérebro para fora do bloco de elastômero de silicone (Figura 3 B) (para que um eletrodo bipolar pode ser colocado sobre o quiasma óptico).
- Executar a braçadeira do remendo de célula inteira ou gravação local potencial arquivada (Figura 3C) conforme descrito por Segev, et al 16
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Representative Results
Para gravar as respostas evocadas de luz um flash de todo campo de luz é projetado na retina enquanto a resposta resultante é gravada a partir de neurônios tectal individuais(Figura 4). Este protocolo particular é projetado para medir tanto a resposta do neurônio à luz activar ("no" resposta) e em seguida desligar 15 s mais tarde para medir a "resposta fora." Tectal neurônios normalmente exibem robusto e desativar respostas (modo de braçadeira mostrado aqui gravadas sob tensão, com o neurônio pinçada a - 60mV para medir corrente sináptica (Figura 4B)). A quantidade de unidade sináptica recebida por qualquer um neurônio pode ser quantificada por registrar os eventos sinápticos espontâneos (Figura 4C). Relações de corrente-tensão (curvas-V) podem ser geradas a partir do mesmo neurônio pisando o neurônio para potenciais cada vez mais despolarizadas e gravação da resultante Na tensão-ativado+ e correntes de K+ , conhecidas como "misturado atual gravações"(Figura 4D, E). Tem sido bem estabelecido que, para estes neurônios de anfíbios, pico at+ e K+ correntes podem ser quantificadas através de gravações atuais mistas porque os picos não temporalmente sobrepor com um outro4,7.
Direto de ativação de axônios RGC no quiasma óptico ignora todo montante computação e processamento de estímulos visuais que ocorrem no olho e permite estudar a transmissão sináptica entre axônios RGC pré-sináptica e pós-sináptica tectal neurônios em sua forma mais pura e reduzida. Tectal neurônio respostas a RGC ativação são geradas a partir RGCs estimuladas pela luz ou diretamente usando um eletrodo de estimulação bipolar consiste em dois componentes: um componente monosynaptic (a entrada sináptica direta de RGCs ativados) e um polysynaptic componente (a rede local recorrente atividade alimentação volta para o neurônio que está sendo gravado). No caso das luz respostas evocadas, os componentes monosynaptic e polysynaptic sobrepor-se com o outro por uma certa quantidade de undeterminable. Essa sobreposição temporal limita o que pode-se concluir sobre a transmissão sináptica entre a retina e tectum óptica. Utilizando uma preparação de todo o cérebro e ativar o trato do axônio RGC diretamente através de um eletrodo colocado sobre o quiasma óptico (Figura 5A), no entanto, produzem uma mono - e polysynaptic componente que são essencialmente não-sobreposição no tempo. A força estimulante do eletrodo bipolar pode ser ajustada. Como a força estimulante é aumentada, há um maior número de axônios RGC ativado (Figura 5B). Um protocolo de estimulação mínima determina a força sináptica de um axônio RGC individual em um neurônio tectal individual; um protocolo de estimulação máxima reflete o total, ou entrada sináptica, máxima de todos os RGC axônios combinada (Figura 5-C). A proporção adequada de entrada sináptica excitatória que inibitórios (E: Eu ratio) recebida por um indivíduo tectal neurônio é crítico para a função visual normal18. Figura 5 D mostra um exemplo dos RGC-evocada excitatórios e inibitórios atuais traços gravado a partir de um neurônio tectal individual. A probabilidade da liberação do transmissor de RGC pré-sináptica axônio terminal é medida por gravações de pulso pareado. Por isso, o neurônio pós-sináptico tectal é gravado no modo de grampo de tensão para medir correntes sinápticas, enquanto os axônios RGC são ativados sucessivamente, separados por um intervalo de tempo de 50 ms (Figura 5E).
Podem efectuar gravações de grampo celular patch de neurônios tectal residentes em qualquer camada somática. Semelhante para a preparação de todo o cérebro, axônios RGC podem ser ativados pela colocação de um eletrodo bipolar gravação sobre o quiasma óptico (Figura 6A). Todas as gravações realizadas na preparação de todo o cérebro também podem ser realizadas usando esta preparação da fatia horizontal do cérebro. Figura 6 B mostra um exemplo de uma resposta evocada RGC gravada a partir de um neurônio na camada superficial. Esta preparação também permite o padrão espacial de RGC sináptica input para os dendritos tectal para ser medido. Por isso, potenciais evocados RGC campo são registrados todos os 10 µm no eixo médio-lateral (ou seja, o eixo distal-proximal) do neurópilo (Figura 6C). Isso gera um perfil de alta resolução do padrão de entrada RGC funcional. Os potenciais de campo em seguida podem ser transformados em densidades de fonte atual calculando-se o segundo derivados espaciais14 e as densidades de fonte atual por sua vez podem ser transformadas em uma trama de imagem. O enredo de imagem em Figura 6C mostra que a entrada mais forte de RGC destinos a área mais distal do neurópilo.
Figura 1. Na vivo procedimentos de preparação. (A) girino encurralado em um pedaço de elastômero de silicone. Os pinos são indicados pelas setas brancas. Observe o posicionamento mais caudal do pin para evitar empalar o trato óptico. Linha branca tracejada indica a linha média. (B) Zoomed-em vista de todo o cérebro após a remoção da pele de sobreposição e corte ao longo da linha mediana dorsal. (C) gravação de remendo-braçadeira de células inteiras na vivo. (L: Lateral. M: medial. R: Rostral. C: Caudal. D: Dorsal. V: ventral. OB: bulbo olfatório. OT: Tectum óptica. HB: Rombencéfalo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Procedimentos de preparação do cérebro todo. (A) depois que o cérebro é filetes ao longo da linha mediana, o rombencéfalo é cortada. (B) todo o cérebro é dissecado para fora e derrotou-ao elastómero de silicone. O asterisco branco indica o pino no bulbo olfatório à esquerda. A caixa vermelha indica o terço médio do tectum, ou seja, a área de destino para a gravação. (C) célula inteira remendo braçadeira gravação usando a preparação de todo o cérebro. O asterisco preto indica a área da membrana ventricular un-raspada onde as células não podem ser acessadas para gravação. Onde a membrana foi removida com êxito, o somata aparece mais distintos e definidos. A seta indica um neurônio insalubre. (PZ: zona proliferativa. LMV: Grande ventrículo Medial. OB: bulbo olfatório. OT: Tectum óptica. HB: rombencéfalo. L: lateral. M: medial. R: Rostral. C: Caudal. D: Dorsal. V: Ventral). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Procedimentos de preparação de fatia horizontal cérebro. (A), a porção mais lateral de um lado o tectum óptica vai ser cortada (indicado pela linha tracejada) após a preparação de todo o cérebro. Preparação de fatia de cérebro Horizontal (B) depois de ser preso ao lado do elastómero de silicone. Linhas duplas brancas representam um estimulante eletrodo colocado sobre o quiasma óptico. (C) Zoomed-em vista das camadas de soma e neurópilo usando uma preparação da fatia horizontal do cérebro. Curva tracejada indica o limite entre camadas de soma e neurópilo. Esta figura foi modificada de junio, et al 14 (l: Lateral. M: medial. R: Rostral. C: Caudal. D: Dorsal. V: ventral. OB: bulbo olfatório. OC: quiasma óptico. OT: Tectum óptica. HB: Rombencéfalo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Gravações de uma preparação na vivo . (A) diagrama esquemático mostrando a configuração típica de uma gravação na vivo . (B) luz evocada respostas incluindo luz e luz de respostas. Traços de baixo-relevo são o zoom no modo de exibição de em-fora-resposta e, respectivamente. (C) correntes de pós-sináptico excitatórias espontânea gravada. (D) at+ e K+ correntes em resposta à tensão braçadeira passos de -60 mV a 30 mV de um único neurônio. (E) IV parcelas geradas a partir de traços em (D). Todas as gravações foram feitas com o neurônio realizado no -60 mV, exceto em (D) para gerar IV-parcelas; os neurônios são pisou para potenciais cada vez mais despolarizadas, em incrementos de 10 mV, para ativar as correntes dependentes de voltagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Gravações de uma preparação de todo o cérebro. (A) diagrama esquemático mostrando a configuração típica de gravação de todo o cérebro, incluindo um estimulante eletrodo colocado sobre o quiasma óptico (linhas verdes e vermelhas representam axônios RGC). (B) sobreposição vestígios das respostas às mudanças da força de estimulação do RGC RGC. Máximo (C) resposta de estimulação (à esquerda) e estimulação mínima resposta (à direita). (D) um RGC-evocada excitatória e inibitória de resposta para um único neurônio. (E) os impulsos facilitação da resposta evocada por RGC de um neurônio individual. (OB: bulbo olfatório. OC: quiasma óptico. OT: Tectum óptica). Todas as gravações foram feitas com o neurônio realizado no -60 mV, exceto em (D) para medir os excitatórios e inibitórios insumos: excitatória entrada é gravada por segurando o neurônio o potencial de reversão do ácido γ-aminobutírico (GABA)-mediada cloreto correntes (mv-45); a entrada inibitória, segurando o neurônio o potencial de reversão do ácido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (Leandro)-mediada correntes (+ 5 mv). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 . Gravações de um cérebro horizontal de corte preparação. (A) diagrama esquemático mostrando a configuração de uma preparação da fatia horizontal do cérebro. Observe que, embora o eletrodo estimulante permanece com o quiasma óptico, a pipeta de gravação é agora posicionado para células de acesso através de todas as camadas tectal expostas a preparação da fatia horizontal do cérebro. (B) uma resposta RGC de um neurônio que residem na camada superficial do tectum. (C) gravou potenciais de campo em todo o neurópilo e as convertido atual fonte densidades (CSD) mostradas pela imagem trama mapas de calor. (OC: quiasma óptico. OT: Tectum óptica. HB: Rombencéfalo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Todos os métodos descritos neste trabalho são otimizados para gravação tectal neurônios de girinos entre estágio desenvolvente 42 e 49 (encenado de acordo com Neiuwkoop e Faber15). Pela fase 42, os girinos são suficientemente grande e suficientemente desenvolvidos para que os pinos de insetos podem ser colocados em ambos os lados do cérebro para gravações na vivo e para a realização da dissecação do cérebro inteiro. Nas fases anteriores, quando os girinos são essencialmente bidimensionais (isto é, liso), as abordagens descritas aqui não são ideais.
Devido à facilidade em que os neurônios tectal poderá ser acessados e gravados na configuração do celular, circuito este modelo tem sido um viveiro de descobertas fundamentais sobre a forma de circuitos neurais como enquanto função e funcionamento - enquanto formando19. Aqui descrevemos como adquirir gravações de braçadeira de remendo de célula inteira de neurônios tectal, incluindo como executar o girino na vivo e preparações de todo o cérebro, a gravação de diferentes configurações e exemplos dos diferentes tipos de dados. O seguinte é uma discussão sobre os pontos fortes e limitações de cada preparação, seguido de dicas para realizar gravações de alta qualidade celular.
Xenopus girinos começam exibindo comportamentos de evitação visual pela fase 47/48, aproximadamente 7-8 dias após a fertilização3,13. Isto significa que mesmo estes estágios relativamente iniciais de desenvolvimento, o circuito retinotectal é funcional e capazes de processar os estímulos visuais. Questões fundamentais em matéria de desenvolvimento e plasticidade do circuito retinotectal foram diretamente tratadas usando a preparação na vivo para registar tectal neurônio respostas a estímulos visuais, projetadas na retina. Na vivo gravações no girino são relativamente simples em comparação com a configuração de gravação equivalente nos mamíferos devido a relativa simplicidade da falta de um crânio e sistema nervoso. Porque somas individuais tectal neurônio podem ser visualizada na vivo, selagem para um determinado neurônio e atingir a configuração de gravação do celular patch braçadeira são essencialmente equivalente à realização de braçadeira de remendo de célula inteira gravando em roedor fatia preparativos. Os girinos normalmente sobrevivem durante várias horas na plataforma (que podem ser facilmente avaliados pelo monitoramento a batida do coração). Uma limitação inerente da girino na vivo preparação é que neurônios tectal que residem na camada de fundo somática do tectum a óptica, a camada que está imediatamente adjacente ao ventrículo médio grande, são apenas acessível para gravação (Figura 1 ). Isto significa que a tectal neurônios que residem nas camadas exteriores somáticas do tectum foram amplamente inexplorados in vivo.
A vantagem experimental a preparação de todo o cérebro é que isola o cérebro com os receptores sensoriais periféricos os olhos e a pele, eliminando toda a actividade sensorial orientado espúria. Enquanto não é mais capaz de ser impulsionado por estímulos visuais, as entradas RGC axonal que destino o tectum ainda estão presentes em preparação o cérebro todo e eles podem ser ativados diretamente de uma forma altamente controlada através de um eletrodo bipolar estimulante (FHC) colocado no o quiasma óptico, onde os dois conjuntos de intervalos de axônio RGC penetra o cérebro. O primeiro uso relatado da preparação cérebro inteiro foi em 1996, em um importante estudo de Wu et al . 8, no quais axônios RGC foram ativados usando um eletrodo bipolar estimulante tal que os autores poderiam quantificar a força de axônios RGC individuais para os neurônios pós-sinápticos de tectal e em fazer então fez descobertas fundamentais sobre a progressão da maturação de sinapse. Tal como acontece com a preparação na vivo , a preparação de todo o cérebro permite o acesso a apenas os neurônios que residem na camada profunda, adjacente à membrana ventricular.
Embora o tectum óptica é composta de aproximadamente nove corpo celular camadas17, todos os estudos anteriores de eletrofisiologia têm focado os neurônios tectal camada profunda, porque o cérebro todo tradicional e preparações na vivo (descritas acima) permita o acesso apenas para os neurônios da camada profunda. Para acessar os neurônios tectal em todas as camadas somáticas, do mais profundo ao mais superficial, bem como todo o neurópilo onde axônios RGC formam conexões sinápticas com dendritos do neurônio tectal, desenvolvemos uma preparação de cérebro todo modificado, conhecida como "o preparação da fatia horizontal do cérebro"(Figura 3.14). Tal como acontece com a preparação de todo o cérebro, a preparação de fatia horizontal cérebro mantém os axônios RGC dentro do cérebro e que possam ser controlados pela colocação de um eletrodo bipolar estimulante no quiasma óptico.
Em geral, as preparações são projetadas para otimizar a visualização de e acesso ao somata tectal neurônio para realizar a gravação de grampo celular patch. Direto de acesso para o soma é essencial para gravações de qualidade toda célula remendo braçadeira: acesso ao interior do neurônio requer a formação de uma forte (> 1 × 109 Ω) entre a pipeta e a membrana plasmática do neurônio, que requer direto do selo contato da ponta da pipeta para essa membrana. Por isso, suficiente remoção da membrana ventricular é chave para gravação de sucesso. Também, chave para o sucesso gravações RGC-evocada é a colocação do eletrodo bipolar estimulante para o quiasma óptico. Essencialmente todos os neurônios tectal recebem entrada sináptica direta de axônios RGC. Se nenhuma resposta RGC-evocada é observada, então é mais provável devido à colocação incorreta do eletrodo bipolar tal que não é sobre o quiasma óptico e não em contacto com os nervos ópticos. Isso pode ser corrigido por simplesmente re-posicionamento do eletrodo estimulante. Inobservância RGC-evocadas respostas após re-posicionamento do eletrodo bipolar poderia significar que a projeção do axônio RGC acidentalmente foi cortada durante a dissecção. Neste caso, é preciso recomeçar com uma nova preparação. Finalmente, a inobservância de uma resposta evocada por RGC pode ser devido a gravação de uma célula que não é um neurônio tectal comum. Por exemplo, glia normalmente não exibem a RGC-evocados monosynaptic resposta normal exibida pelos neurônios tectal e nem os grandes neurônios mesencéfalo que foram encontrados, embora em números muito baixos, residindo no tectum óptica20. A probabilidade da gravação de uma destas células não-tectal é muito baixa devido ao enorme número de neurônios tectal. Claro, gravações de qualidade exigem também os neurônios tectal para ser saudável. Características de um neurônio tectal saudável são uma soma redonda ou ovais compacto que é clara e sem manchas. Uma vez que a configuração de gravação de toda célula tem sido alcançada, a saúde do neurônio pode ser avaliada ainda mais a nível eletrofisiológicos medindo Propriedades elétricas fundamentais tais como descansar o potencial de membrana, entrada de resistência e capacitância . O potencial de membrana de repouso dos neurônios tectal saudáveis entre os estágios do desenvolvimento 42 e 49 é aproximadamente -45 mV, com uma resistência de entrada média de aproximadamente 1 GΩ e uma capacidade de 10-12 pF3,4,5. Uma pequena fração dos neurônios será inevitavelmente danificada devido à remoção da membrana ventricular. O somata dos neurônios danificados ou insalubres aparece granulada, inchado, ou enrugado. Um exemplo de um neurônio insalubre é mostrado na Figura 2C. Se a maioria dos neurônios aparece insalubre, este poderia ser um reflexo de que há algo errado com a solução de gravação externa, por isso é recomendado para compensar a solução fresca de gravação externa. Além de aparecer saudável, os neurônios melhores para gravação são tipicamente associados com um grande número de outros neurônios, em vez de ser isolado. Além disso, escolha as células que são facilmente acessíveis. Por exemplo, não forçamos o tecido demais acessar uma célula, porque isto pode danificar o tecido ou mover o tecido e, portanto, deslocar o eletrodo estimulante fora do lugar. Finalmente, as gravações devem ser restritas para o terço médio do tectum (Figura 2B), para evitar diferenças de potencial devido ao gradiente do desenvolvimento que existe do outro lado do eixo rostro-caudal4,8, a não ser, claro, o foco do experimento é o gradiente do desenvolvimento acima mencionado. O tectum adequada é a área rostral da zona proliferativa e caudal à borda caudal do ventrículo médio grande.
A braçadeira do remendo de toda célula técnica de gravação não é sem suas limitações. Em geral, este estilo de gravação envolve a gravação de um neurônio de cada vez. Isso é contrário abordagens envolvendo a imagem de uma nova geração de indicadores de cálcio GCaMP6, que permitem a atividade de grandes populações de neurônios para ser fotografada simultaneamente em uma fatia de preparação e em vivo.
Outra desvantagem inerente para gravações de braçadeira de tensão de célula inteira é o erro de braçadeira de espaço (incapacidade de controlar a tensão muito mais além da soma), que limita o controle temporal de tensão4. Em geral, estas questões de grampo de tensão são mínimos quando a gravação de neurônios tectal, no entanto, por causa de seu tamanho relativamente pequeno e modestos arborizations dendríticas correntes relativamente pequenas e lentas, em comparação com os neurônios de mamíferos. Estas características de neurônios tectal renderização-los especialmente favorável para grampo de tensão, gravação, medição de muitos parâmetros e construção de perfis para os neurônios individuais5,6.
Sentidos futuros incluem otimizando uma in vivo horizontal cerebral fatia preparação para caracterizar a função dos neurônios da camada exterior no processamento de estímulos visuais.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Com a subvenção de NIH SBC COBRE 1P20GM121310-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Dissecting microscope |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Amphibian general anesthetic |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Used to prepare Stienberg's solution |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare Steinberg's solution |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Used to prepare external recording solution |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Used to prepare external recording solution |
| D-glucose Anhydrous | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare external recording solution |
| Tubocurarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379 | Nicotinic acetylcholine receptor antagonist |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm diameter stainless steel pins |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761028 | Preweighed monomer and curing agent kit |
| Sterile Polystyrene Petri Dish - 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Small petri dishes |
| PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | 305122 | Syringe needles |
| 1mL Slip Tip Tuberculin Syringe | BD | 309659 | Disposable, sterile syringes |
| Borosilicate pipette glass | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Pulled to desired specifications using pipette pulling machine |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Fabricates micropipettes for electrophysiology recording |
| Kimwipes Kimtech wipes | Kimberly-Clark | 34120 | Delicate task lint-free wipers |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Current clamp and voltage clamp headstage |
| MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller | Sutter Instrument | MP-285/T | Control for headstage on electrophysiology rig |
| Fiber-Coupled LED (Green) | Thorlabs | M530F2 | Fiber optic cable paired with green LED |
| Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter) | FHC | 30207 | Bipolar stimulating electrode |
| ISO-Flex Stimulator | A.M.P.I. (Israel) | Contact manufacturer | Flexible stimulus isolator |
| Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplifier for voltage- and current-clamp recording |
| Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | 2500-135 | Data acquisition system for electrophysiology recording |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Microscope for electrophysiology |
| Micro-g Lab Table | TMC | 63-533 | Air table for electrophysiology microscope |
| Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit | Dell | D06D001 | Computer running electrophysiology software |
| c2400 CCD camera | Hamamatsu | 70826-5 | Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging |
| 7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades | Gillette | CMM01049 | Platinum-coated stainless razor blades |
| Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-711-7M | Disposable Polyethylene transfer pipets |
References
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
- Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
- Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit. Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole. J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit. J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).
- Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity. Elife. 4, 11351 (2015).
- Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).
- Wu, G., Malinow, R. Cline H.T. of a central glutamatergic synapse. Science. , 972-976 (1996).
- Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism. Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).
- Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development. Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), e705 (2008).
- Dong, W., et al. Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum. J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum. J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland. New York. (1994).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J. Vis. Exp. (112), e54024 (2016).
- Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure. Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).
- Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles. Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).
- Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function. Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles. J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).
