Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

İki boyutlu yarı denaturing deterjan özel Jel Elektroforez amiloid veya amiloid benzeri liflerin boyutu heterojen onaylamak için kullanımı

Published: April 26, 2018 doi: 10.3791/57498
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Biology, UT Southwestern Medical Center

Summary

Burada biz iki boyutlu yarı denaturing özel Jel Elektroforez amiloid benzeri lifler türdeş olmayan boyutta varlığını doğrulamak ve amiloid liflerinin ayrışma sırasında jel boyutu heterojenite kaynaklanmaktadır olasılığını dışlamak için kullanın koşma oluşum.

Abstract

Amiloid Dil veya amiloid benzeri lifler birçok insan hastalıkları ile ilişkili olan ve şimdi birçok sinyal yolları için önemli olduğunu keşfetti edilmektedir. Kolayca bu elyaf çeşitli deneysel koşullarda oluşumu algılama yeteneğini potansiyel işlevleri anlamak için önemlidir. Pek çok yöntem lifler, algılamak için kullanılan ama bazı dezavantajları olmadan olmaz. Örneğin, elektron mikroskobu (EM) veya Kongo kırmızısı veya Thioflavin T ile sık sık boyama arıtma liflerinin gerektirir. Öte yandan, yarı denaturing deterjan özel Jel Elektroforez (SDD-yaş) hücre özleri arıtma olmadan SDS dayanıklı amiloid benzeri lifler algılanmasını sağlar. Buna ek olarak, boyut farkı liflerinin karşılaştırmasını sağlar. Daha da önemlisi, Western Blot tarafından spesifik proteinlerin lifler içinde tanımlamak için kullanılabilir. Daha az zaman alıcı ve labs daha geniş bir dizi için daha kolay erişilebilir. SDD-yaş sonuçları genellikle değişken heterojenite derecesini gösterir. Protein kompleksi SDS huzurunda Elektroforez sırasında ayrılma heterojenite parçası oluşur olup olmadığını sorusunu gündeme getiriyor. Bu nedenle, ikinci bir boyut SDD-ÇAĞINDA görülen boyutu heterojenite gerçekten fiber heterojenite vivo içinde bir sonucu ve bozulma ya da ayrılma sırasında proteinlerin bazı değil bir sonucu olup olmadığını belirlemek için SDD-Age istihdam Elektroforez. Bu yöntem, amiloid veya amiloid benzeri liflerin kısmen SDD-yaş işlemi sırasında dissociating değil hızlı, nitel onay sağlar.

Introduction

Protein misfolding nedeniyle amiloid lifleri oluşumu, Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı ve Huntington hastalığı1gibi patolojik koşullarda bir rol oynamaya uzun bilinmektedir. Daha yakın zamanlarda, amiloid veya amiloid benzeri liflerin oluşumu sinyal yolları insanlar Anti-yayılmacı doğuştan gelen bağışıklık yanıtı2 necroptosis3,ve4sırasında dahil olmak üzere ve daha düşük organizmalar bir parçası olmak için gösterilen Maya5,6gibi. Bu nedenle, bu elyaf laboratuarda algılama yeteneğini önemlidir. Şu anda, amiloid ve amiloid benzeri lifler algılamak için üç ana yolu vardır: Boyalar, EM ve SDD-yaş kullanımı.

Boya, Kongo kırmızısı veya Thioflavin T, gibi kullanımı hızlı ve kolayca detectable mikroskopi veya spektroskopisi7kullanarak olmanın avantajı sunuyor. Ancak, mikroskopi, Kongo kırmızısı, söz konusu olduğunda tarafından hangi proteinleri oluşturan lifler veya boyutu lifler, hiçbir özgüllük algılar. Benzer şekilde, Kongo kırmızısı veya Thioflavin T bağlayıcı protein kompleksleri için algılamak için spektroskopisi kullanımı yalnızca bir pozitif veya negatif sonuç sağlar.

EM lifleri ve aynı zamanda lif uzunluğu ve çapı8hakkında kantitatif bilgi varlığının kesin kanıt sağlar. Ancak, bu yöntem çok sıkı arıtma gerektirir. Ayrıca, EM pahalı ekipman kullanan bir özel bir tekniktir.

SDD-yaş SDS dayanıklı mega Dalton protein kompleksleri amiloid veya amiloid benzeri lifler de dahil olmak üzere tespit etmek için kullanılmıştır. Birçok avantaj sunar. İlk olarak, arıtma liflerinin gerektirmez ve peform9için kolaydır. İkinci olarak, göreli boyutu ve fiber heterogenicity miktarı dahil olmak üzere liflerinin boyutu hakkında Nitel bilgi sağlar. Western Blot Elektroforez sonra gerçekleştirilen çünkü son olarak, bu SDD-yaş yarı denaturing olduğu için bazı epitopları hangi gizli kalmasını unutulmamalıdır, ancak kendisi için herhangi bir proteinin bir antikor olduğunu var olup olmadığını belirlemek kolaydır algılama antikor tarafından olmak zordur.

Son zamanlarda, reseptör etkileşen protein kinaz 1 (RIPK1) ve 3 (RIPK3) bildirilmiştir formu amiloid lifleri için platformlar necroptosis sırasında nekroz3programlanmış bir tür sinyal olarak hizmet etmek için. Bu iplikler okurken, bizim laboratuvar lineage kinaz etki alanı gibi (MLKL), karışık başka bir necroptosis ilişkili protein de amiloid benzeri lifler4kurdu gösterdi. Ancak, SDD-yaş ile incelenmesi üzerine, MLKL lifleri boyutunu birbirlerine (şekil 1) aynı çıktı RIPK1 ve RIPK3 lifler farklı çıktı. MLKL necroptosis necrosome10denilen karmaşık sinyal oluşturmak için RIPK1/RIPK3 için bağlar tanınmış olduğundan bu beklenmedik bir şeydi.

En az iki açıklaması vardır. İlk olarak, iki tamamen farklı amiloid benzeri lifler necroptosis sırasında bir içeren RIPK1/RIPK3 ve diğer içeren MLKL şeklinde. İkinci olarak, tek bir içeren RIPK1/RIPK3/MLKL necroptosis ama MLKL ilişkilendirmesiyle diğer proteinler sırasında oluşmuş amiloid benzeri lifler zayıf yeterince SDD-yaş sırasında ayrışıp türüdür.

Bu sorunu çözmek için bir iki boyutlu (2D) SDD yaşından öneriyorum. SDD-yaş-kararlı amiloid veya amiloid benzeri lifler aynı geçiş desen birinci ve ikinci boyut Elektroforez sırasında olacaktır. Bu tespit bir membran proteinleri aktarma ve Western blot taşıma sonra olacak. İstikrarlı elyaf keskin köşegen desen sergileyecek. Bu herhangi bir sapma lifler SDS-Elektroforez nedeniyle değişiklikleri meydana öneririz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hazırlayın örnekleri

  1. Kültür 2 x 106 amiloid HT-29 kolon kanser hücrelerinin 10 ml, Dulbecco'nın modifiye kartal orta (% 10 fetal sığır serum ve penisilin-streptomisin içeren DMEM) 10 cm doku kültürü tabak içinde üreten. Kültür hücreleri 37 ° C kuluçka %5 CO2gece.
    1. Sonra % 80 confluency için hücrelerin büyümesine, fosfat tamponlu tuz (PBS) 10 mL hücrelerle yıka. 3 mL tripsin çözeltisi ekleyin ve 3 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
    2. Hücreleri yemek tamamen Disosiye sonra kültür orta 10 mL ekleyin ve 15 mL konik tüp 10 mL pipet hücrelerle aktarmak. Senaryo Özeti 3 dakika oda sıcaklığında 1000 x g santrifüj kapasitesi. Orta Aspire edin, 5 mL kültür ortamının hücrelerde resuspend ve bir hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak. Her iki 10 cm tabak tabak 2 x 106 hücreler.
    3. Hücreleri uygun ve gecede 37 ° C kuluçka %5 CO2kurtarmak için izin verir. Amyloids 20 ng/mL tümör nekrozis faktör-alfa (TNF-α), 100 nM şaplak atmak mimetic ve 20 µM pan-caspase inhibitörü Z-VAD-FMK11ile oluşumu ikna etmek için bir yemek için tedavi uygulanır. Kasanın TSZ kısaltılır. Araç ile diğer çanak bir denetim olarak tedavi.
  2. Uygun süreyi sonra genellikle 6 h, lysate hücre hasat.
    1. Plastik bir sıyırıcı plaka kapalı hücre scrape ve 10 mL pipet 15 mL konik tüp içine aktarmak için kullanın. 1000 x g 4 ° C'de 3 dk de hücreleri santrifüj kapasitesi
    2. Hücreleri tarafından 10 mL buz soğuk PBS resuspending ve 1000 x g 4 ° C'de 3 dk de centrifuging 2 kez yıkamak PBS çözüm Aspire edin.
      Not: İşlemi burada hücre Pelet sıvı azot içinde dondurma ve ˗80 ° C ilâ 1 aylığına depolayarak duraklatılmış.
    3. Hücre Pelet 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarmak ve buz üzerinde 30 dk için lizis arabellek 0.3 ml kuluçkaya. 4 ° C'de 15 dakika 20.000 x g, santrifüj Süpernatant lysate tüm cep telefonu var.
      Not: İşlemi burada örnek-20 ° C'de için birkaç ay kadar depolayarak duraklatılmış.
    4. Bir Bradford tahlil üreticisinin protokolüne göre tarafından protein konsantrasyonu ölçmek. 4 x 3 µg/µL örnek 20 µL hazırlamak ve 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya SDD-yaş yükleme arabellek ekleyin.

2. hazırlayın ve jelleri çalıştırın

  1. 200 ml 1 x Tris-asetat arabelleği (TAE) bir cam kabı ve özel eritmek için bir mikrodalga Isı özel 2 g ekleyin. 1 mL % 20 SDS % 0,1 SDS son bir konsantrasyon için ekleyin. Karıştırmak için dikkatli bir şekilde girdap. Kabarcıklar SDS eklenmesinden sonra oluşturmamanız için dikkat ediniz.
  2. Özel çözüm 15 cm x 14 cm jel levha dökün. 1-mL pipet herhangi bir kabarcıkları ortadan kaldırmak için kullanın. Bir 20-iyi tarak en üste yerleştirmek.
  3. İlk Boyut: pipet 60 µg, her hücrenin sağ şeritte lysate. (Boya açık yaklaşık ¾ jel yoluyla olana) jel 60 V 4 h için çalıştırın çalışan tampon olarak % 0,1 SDS içeren TAE kullanarak.
  4. İkinci Boyut: jel 90 ° saat yönünün tersine (Şekil 2A) dikkatle döndürün. Jel 60 V 4 h için çalıştırın.
    Not: Genel çalışan 4 V/cm jel uzunluğu bir durumdur. Çalışan koşulların tam olarak birinci ve ikinci boyutları için aynı olduğunu önemlidir.

3. transfer

  1. Proteinler polivinilidin difluoride (PVDF) membran (Şekil 2B) aktarmak için kılcal aktarma yöntemini kullanın.
    1. Aktarma arabelleği için 500 mL ekleyin bir yaklaşık 20 cm x 20 cm kapsayıcı. 5-cm yüksek yığın kağıt havlu konteyner yanında yapmak. Yığının üst yüzey alanı jel boyutları büyük olması gerekir.
    2. 14 cm x 15 cm filtre kağıdı Aktarım arabellek emmek ve kağıt havlu yığını üzerine yerleştirin. Hiçbir kırışıklık veya kabarcıklar ile kağıda yerleştirmek için dikkat ediniz. Filtre kağıt başka bir parça ile tekrar.
    3. 14 cm x 15 cm PVDF membran için 30 metanol içinde etkinleştirmek s sonra filtre tüm kabarcıklar kaldırmak için bir rulo kullanmak için dikkat çekici kağıt üzerinde katman. Jel Aktarım arabellek ile durulayın ve yine herhangi bir kabarcıklar inişli çıkışlı membran üstüne katman.
    4. Plastik film ile yakın Aktarım arabellek kapsayıcıya kağıt havlu kenarı kapsar. Bir sonraki adımda inşa kağıt köprü kağıt havlu yığını ile doğrudan temas gelebilir değil önemlidir.
    5. 15 cm x 35 cm filtre kağıt Aktarım arabellek emmek ve böylece bir ucunu üst jel kapsar ve diğer ucunu Aktarım arabellek kapsayıcısında yerleştirin. Başka bir köprü ile yineleyin.
    6. Kapsayıcı plastik wrap ile kapak ve gecede oda sıcaklığında bekletin.

4. Western Blot algılama

  1. Durulama zar 50 mL % 0.05 içeren PBS ile ara-20 (PBST) olarak tehlikeli madde kabına 20 cm × 20 cm. 20 mL % 5 süt PBST içinde ekleyin. Rock engellemek 30 dakika oda sıcaklığında.
  2. Tavşan anti-MLKL antikor PBST sütte %5 20 mL içine 10 µL pipet ve kapsayıcıya ekle. Gecede 4 ° C'de rocker üzerinde kuluçkaya
  3. Membran PBST 20 mL için 5 dk. tekrar 5 kere yıkayın.
  4. Anti-rabbit-HRP 20 ml % 5 süt PBST içinde 4 µL pipet ve kapsayıcıya ekle. 2 h için oda sıcaklığında rocker üzerinde kuluçkaya.
  5. Membran PBST 20 mL için 5 dk. tekrar 5 kere yıkayın.
  6. Gelişmiş Kemiluminesan substrat (ECL) ekleyin ve röntgen filmleri üreticinin protokolüne göre için maruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sonra necroptosis indüksiyon, RIPK1 ve RIPK3 hemen hemen aynı amiloid benzeri desenler (şerit 2 ve 4, şekil 1) gösterdi. Ancak, MLKL lifler daha heterojen ve RIPK1/RIPK3 lifleri (lane 6, şekil 1) küçük olmak gibiydi. Bizi ister MLKL RIPK1/RIPK3-bağımsız lifler oluşturur ya da MLKL sade bir şekilde büyük RIPK1/RIPK3/MLKL lifleri SDD-yaş sırasında ayrışıp. olasılığını adrese 2D SDD-yaş yöntem geliştirmek için istenir.

Elektroforez ve transfer yordam genel bir şematik Şekil 2' de gösterilmiştir. İlk boyutun SDD-yaş sırasında amiloid veya amiloid benzeri liflerin şekil 3' teAgörüldüğü gibi karakteristik bir smear sergileyecek. İkinci boyut SDD-yaş üzerine çalışan, iki olası sonuç vardır. İlk çalıştırmada yaptıkları gibi hiçbir bozulma ya da ayrılma işlemi çalıştıran jel sırasında söz konusu olduğunda, lifler ikinci çalışma sırasında aynı şekilde geçirilir. Bu durumda, bir Western blot şekil 3' teBgörüldüğü gibi 45 ° açıyla membran üzerinde köşegen desen sergileyecek. SDD-yaş işlemi sırasında lifleri ayırmak, daha küçük lifleri daha hızlı ikinci Elektroforez sırasında göç edecek. Bu durumda, bir Western blot şekil 3Cgösterildiği gibi çapraz sınırının altında Dikey çizgiler sergileyecek.

Necroptosis sırasında görülen MLKL lifleri söz konusu olduğunda, ilk boyut SDD-yaş (şekil 4A) sırasında karakteristik smear gösteriyorlar. Ne zaman bu aynı lifleri 2D SDD-yaş için tabi tutuldu, onlar hiçbir dikey streaking (şekil 4B) ile keskin bir çapraz çizgi sergiledi. Bu kanıtlarla MLKL lifleri SDD-yaş işlemi sırasında dissociating değil olduğunu ve şekil 1 ' de görülen MLKL içeren lifleri RIPK1/RIPK3 lifleri gerçekten farklı olduğunu sonucuna varıldı. Ayrıca, RIPK3 IMMUNO tükenmiş-hücre lysates yaşındayken MLKL lifleri sağlam4MLKL elyaf ve RIPK1/RIPK3 lifleri gerçekten ayrı varlıklardır onaylayan, kaldı.

Figure 1
Resim 1 . Amiloid benzeri lifler muayene sırasında necroptosis. Tüm cep telefonu lysates ve TNF kaynaklı necroptosis geçiren hücrelerden hasat SDD-yaş için tabi. Batı lekesi RIPK1, RIPK3 ve MLKL için yapıldı. MLKL içeren lifleri RIPK1/RIPK3-içeren liflerinden ayrı geçiş desen sergiledi. MLKL monomer ancak bu koşul altında görünür. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 . Deneysel protokol. İki boyutlu yarı denaturing deterjan özel Jel Elektroforez (2D SDD-yaş)(a)şeması. Kırmızı etiketli sağ çoğu şeride örnekte yükleyerek başlayın. İlk boyut çalıştırma sona ermesi sonra jel 90 ° saat yönünün tersine döndür. İkinci boyut Elektroforez çalıştırın. Noktalı ok çalıştırmak ikinci boyutu yönünü gösterir, katı ok çalıştırmak ilk boyut yönünü gösterir. (B) şema devrine kılcal eylem. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 . Olası sonuçları. (A) beklenen geçiş desen SDD-yaş ilk boyut sonra amiloid veya amiloid benzeri liflerinin. Katı ok geçiş yönünü belirtir. (B) beklenen geçiş desen SDD-yaş-kararlı (Hayır bozulma ya da ayrılma) Amiloid veya amiloid benzeri lifler 2D SDD-yaş sonra. Katı ok ilk boyut SDD-yaş yönünü belirtir. Noktalı Ok ikinci boyutu SDD-yaş yönünü gösterir. (C) sigara-SDD-yaş-kararlı amiloid veya amiloid benzeri lifler beklenen geçiş desen. Katı ok ilk boyut SDD-yaş yönünü belirtir. Noktalı Ok ikinci boyutu SDD-yaş yönünü gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4. MLKL geçiş içeren lifleri 1D ve 2D SDD-yaş sırasında. (A)tüm cep telefonu lysates hücrelerden necroptosis geçmesi TSZ ile uyarılan hasat. Lysates SDD-yaş için tabi tutuldu ve Western blot MLKL için gerçekleştirildi. Karakteristik bir smear gözlendi. (B) tüm cep telefonu lysates hücrelerden necroptosis geçmesi TSZ ile uyarılan hasat edildi. Lysates 2D SDD-yaş için tabi tutuldu ve Western blot MLKL için gerçekleştirildi. Lifler ayrılma SDD-yaş sırasında tabi olmayan gösteren 45° açıyla keskin bir çizgi gözlendi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En önemli bir özelliği, 2D SDD-yaş Elektroforez koşullar birinci ve ikinci boyutu için aynı olmasıdır. Benzer bir şekilde her iki sırasında geçiş lifleri 45 ° (hiçbir ayrılma veya bozulma oluştuğunu gösteren), keskin bir çapraz çizgi bağlıdır algılama yeteneğini electrophoreses. Farklı koşullar, örneğin voltaj veya çalışma süreyi değiştirme kullanarak bu sonuçlar karanlık olacak. Geleneksel 1 D için olduğu gibi bu amiloid ve amiloid benzeri lifleri bozabilir olacaktır Ayrıca, SDD-yaş, örnek kaynar, kaçınılmalıdır. Tüm transferler için olduğu gibi filtre kağıdı, membran ve jel katmanlar arasında kabarcıklar önlemek için özen gösterilmelidir. Son olarak, transfer adımı sırasında bu köprü sarkıt değil ve kağıt havlu yığını doğrudan temas önemlidir. Bunu önlemek için güvenilir bir yol plastik wrap küçük bir parça kağıt havlu kenarı kapsayacak şekilde kullanmaktır.

Protokolü (60 V 4 h için) sağlanan çalışan koşulları ayarlanabilir. Örneğin, bu protokol için özel jel 14 cm x 15 cm oldu. Daha küçük bir jel kullandıysanız, voltaj (4 V/cm jel uzunluk) ve çalışma zamanında orantılı olarak ayarlanmalıdır. İki örnek aynı anda jel hazırlanırken iki tarak kullanarak analiz. Örnekleri her tarak için en iyi sağ yüklü olmalıdır. Böylece en iyi örnek alt yarısı jel çalışmaz bu durumda, çalışma zamanı tekrar kısaltılabilir. Zaman jel bir boyut için ayarlanıyorsa, diğer boyut eşleşecek şekilde ayarlanır önemlidir.

SDS-sayfa aksine 1 D ve 2D SDD-yaş yarı denaturing. Lifler korunacak çünkü bazı epitopları ulaşılmaz kalabilir. Bu bazı antikorlar tarafından algılama sınırlayabilir. 2D SDD-yaş amiloid veya amiloid benzeri liflerin tam boyutunu belirlemek için onun yetenek sınırlıdır. Ancak, bir göreli boyut karşılaştırma yapılabilir.

Ayrılma veya bozulma SDD-yaş sırasında tüm protein kompleksleri tabidir ve bu yüzden nitel sonuçlar yorumlamak zor olabilir. 2D kullanımına SDD-yaş SDD-yaş sırasında görülen boyutu heterojenite SDS-bağımlı ayrılma Elektroforez sırasında nedeniyle değil onay izin verir. 2D SDD-yaş geleneksel 1 D SDD-yaş kullanıldığı herhangi bir bağlamda kullanmak uygundur. Boyutu heterojenite 1 D SDD-çağda gözlenen 2D SDD-yaş özellikle yararlıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.

Acknowledgments

Bu eser için bir arkadaş grubu tarafından desteklenen S.H.-A. NIH/NCATS (TL1TR001104), Welch Vakfı Hibe (I-1827) ve NIGMS (RGM120502A) Z.W. Z.W. bir R01 hibe'tıbbi araştırma ve kanser önleme ve Texas akademik ve Araştırma Enstitüsü (R1222) Virginia Murchison Linthicum uzman olduğunu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gel electrophoresis unit Fisher HE99XPRO appratus for gel running.
agrose VWR 97062-250 For agarose gel.
paper tower Fisher 19-120-2484 for transfering
filter paper VWR 21427-386 for transfering
PVDF membrane Bio-Rad 162-0177 for transfering
blocking milk powder Bio-Rad 1706404XTU for blocking in Western blot
MLKL antibody Genetex GTX107538 rabbit anti-MLKL antibody
RIPK1 antibody BD Biosciences 610459 mouse anti-RIPK1 antibody
RIPK3 antibody gift from Dr. Xiaodong Wang rabbit anti-RIPK3. See refenence 11.
anti-Rabbit-HRP Sigma A6154 secondary antibody
ECL Fisher WBKLS0500 Western chemiluminescent HRP substrate
X-ray film Fisher F-BX810 for Western blot result
DMEM Sigma D6429 for cell culture
fetal bovine serum Sigma F4135 for cell culture
penicilin-streptomycin Sigma P4333 for cell culture
Trypsin solution Sigma T4049 for cell culture
PBS for tissue culture Sigma D8662 for cell culture
recombinant TNF made in our lab for inducing necroptosis. See reference 11.
smac-mimetic gift from Dr. Xiaodong Wang for inducing necroptosis. See reference 11.
ZVAD-FMK ApexBio A1902 for inducing necroptosis. See reference 11.
Cell Counter Bio-Rad 1450102 Model TC20; for counting cells
Pierce™ BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 for measuring protein concentration in cell lysates
Cell lifter Fisher 07-200-364 to remove cells from dish
Lysis Buffer (1 L) 20 mL 1 M Tris pH 7.4
10 mL glycerol
30 mL 5 M NaCl
840 mL ddH2O
10 mL Triton-X100
(protease and phosphates inhibitors as desired)
10X TAE (1 L) 48.4 g Tris base
11.42 mL glacial acetic acid
20 mL 0.5M EDTA pH 8
ddH20 to 1 L
4X SDD-AGE loading buffer (50 mL) 5 mL 10X TAE
10 mL glycerol
4 mL 20% SDS
0.5 mL 10% bromophenol blue
31 mL ddH2O
TBS Transfer Buffer (1 L) 20 mL 1 M Tris pH 7.4
30 mL 5 M NaCl
950 mL ddH2O
PBST Wash Buffer (1 L) 100 mL 10xPBS
800 mL ddH2O
1 mL Tween20
10X PBS (10 L) 800 g NaCl
20 g KCl
144 g Na2HPO4·2H2O
24 g KH2PO4
add ddH2O to 10 L

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature medicine. 10, 10-17 (2004).
  2. Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
  3. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
  4. Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).
  5. Uptain, S. M., Lindquist, S. Prions as protein-based genetic elements. Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).
  6. Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. , (2008).
  7. Sipe, J. D., et al. Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis. Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).
  8. Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level. Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).
  9. Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. Methods in Enzymology. 412, Academic Press. 33-48 (2006).
  10. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
  11. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137, 1100-1111 (2009).

Tags

Biyokimya sayı: 134 amiloid amiloid benzeri protein toplamak protein kompleksi iki boyutlu yarı denaturing deterjan özel Jel Elektroforez ayrılma boyutu heterojenite sinyal
İki boyutlu yarı denaturing deterjan özel Jel Elektroforez amiloid veya amiloid benzeri liflerin boyutu heterojen onaylamak için kullanımı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hanna-Addams, S., Wang, Z. Use of… More

Hanna-Addams, S., Wang, Z. Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers. J. Vis. Exp. (134), e57498, doi:10.3791/57498 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter