Summary
Hier gebruiken we de Elektroforese van het gel van de tweedimensionale semi-denatureren agarose bevestigen de aanwezigheid van amyloid-achtige vezels van heterogene grootte en uitsluiten van de mogelijkheid dat de heterogeniteit van grootte te wijten aan de dissociatie van de amyloïde vezels tijdens de gel is lopend proces.
Abstract
Amyloïde of amyloid-achtige vezels zijn geassocieerd met vele ziekten bij de mens, en zijn nu belangrijk voor vele signaalroutes wordt ontdekt. De mogelijkheid om de vorming van deze vezels onder verschillende experimentele omstandigheden gemakkelijk te detecteren is van essentieel belang voor het begrijpen van hun potentiële functie. Veel methoden zijn gebruikt voor het detecteren van de vezels, maar niet zonder nadelen. Elektronenmicroscopie (EM) of kleuring met Congo rood of Thioflavin T vaak wordt bijvoorbeeld vereist dat de zuivering van de vezels. Aan de andere kant, maakt semi-denatureren wasmiddel agarose gelelektroforese (SDD-leeftijd) de ontdekking van de SDS-resistente amyloid-achtige vezels in de cel extracten zonder zuivering. Bovendien, staat het de vergelijking van het verschil van de grootte van de vezels. Wat nog belangrijker is, kan het worden gebruikt om te identificeren specifieke proteïnen binnen de vezels door het westelijke bevlekken. Het is minder tijdrovend en meer gemakkelijk toegankelijk is voor een groter aantal labs. Resultaten van de SDD-leeftijd blijkt vaak variabele mate van heterogeniteit. Het doet de vraag rijzen of het deel van de heterogeniteit voortvloeit uit de dissociatie van het eiwit complex tijdens de elektroforese in aanwezigheid van SDS. Om deze reden hebben we een tweede dimensie van de SDD-leeftijd om te bepalen als de heterogeniteit van de grootte gezien in SDD-leeftijd echt een resultaat van vezel heterogeniteit in vivo en niet een gevolg van afbraak of dissociatie van een aantal van de eiwitten tijdens is dienst elektroforese. Met deze methode kunt snelle en kwalitatieve bevestiging dat de amyloïde of amyloid-achtige vezels niet gedeeltelijk tijdens het proces van de SDD-leeftijd distantieert zijn.
Introduction
De vorming van amyloïde vezels te wijten aan het eiwit misfolding is al lang bekend een rol te spelen in de pathologische aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer, ziekte van Parkinson en de ziekte van Huntington1. Meer recentelijk, de vorming van amyloïde of amyloid-achtige vezels is gebleken om een deel van signaalroutes bij de mens, met inbegrip van tijdens anti-virale ingeboren immune reactie2 en necroptosis3,4, en in lagere organismen zoals gist5,6. De mogelijkheid om op te sporen van deze vezels in het lab is daarom belangrijk. Momenteel zijn er drie belangrijke manieren om amyloid en amyloid-achtige vezels te detecteren: het gebruik van kleurstoffen, EM en SDD-leeftijd.
Het gebruik van kleurstoffen, zoals Congo rood of Thioflavin T, biedt het voordeel dat ze snel en gemakkelijk aantoonbaar met behulp van microscopie of spectroscopie7. Detectie door microscopie, in het geval van Congo rood, biedt echter geen specificiteit waarover eiwitten bestaan uit de vezels, of de grootte van de vezels. Ook biedt het gebruik van de spectroscopie te detecteren Congo rood of Thioflavin T binding aan eiwitcomplexen alleen een positief of negatief resultaat.
EM biedt sluitend bewijs van de aanwezigheid van vezels en ook kwantitatieve informatie over de vezel lengte en diameter8. Deze methode vereist echter zeer strenge zuivering. Bovendien, is EM een gespecialiseerde techniek die gebruik maakt van dure apparatuur.
SDD-leeftijd is gebruikt voor het detecteren van SDS-resistente mega Dalton eiwitcomplexen met inbegrip van amyloïde of amyloid-achtige vezels. Het biedt vele voordelen. Ten eerste, het is niet vereist voor de zuivering van de vezels en is gemakkelijk te peform9. Ten tweede, het biedt kwalitatieve informatie over de grootte van de vezels, met inbegrip van de relatieve grootte en hoeveelheid van de vezel heterogenicity. Ten slotte, omdat het westelijke bevlekken kan worden uitgevoerd na elektroforese, het is gemakkelijk om het detecteren van de aanwezigheid van een eiwit waarvoor er een antilichaam is, hoewel hierbij moet worden opgemerkt dat omdat SDD-leeftijd semi-denatureren is, sommige epitopes verborgen die blijven kunnen compliceert detectie door antilichaam.
Onlangs, receptor interactie proteïne kinase 1 (RIPK1) en 3 (RIPK3) gemeld aan formulier amyloïde vezels om te dienen als signalering platformen tijdens necroptosis, een geprogrammeerde vorm van necrose3. Terwijl het bestuderen van deze vezels, toonde ons lab dat een ander necroptosis-geassocieerde proteïne, gemengde afkomst kinase domein-achtige (MLKL), ook amyloid-achtige vezels4gevormd. Echter, bij onderzoek met de SDD-leeftijd, de grootte van de vezels MLKL verscheen onderscheiden van de RIPK1 en RIPK3 vezels, die leek identiek aan elkaar (Figuur 1). Dit was onverwacht omdat het is bekend dat MLKL aan RIPK1/RIPK3 bindt om te vormen de necroptosis signalering complex genaamd de necrosome10.
Er zijn ten minste twee verklaringen. Ten eerste, twee totaal verschillende amyloid-achtige vezels kunnen vormen tijdens de necroptosis, een met RIPK1/RIPK3 en de andere met MLKL. Ten tweede, is slechts één type van amyloid-achtige vezels die met RIPK1/RIPK3/MLKL kan worden gevormd tijdens de necroptosis, maar de associatie van MLKL met de andere eiwitten zwak genoeg dat het distantieert tijdens SDD-leeftijd.
Om aan te pakken dit, stellen wij voor het uitvoeren van een tweedimensionale (2D) SDD-leeftijd. SDD-leeftijd-stable amyloid of amyloid-achtige vezels zal hetzelfde patroon migratie hebben tijdens de eerste en de tweede dimensie elektroforese. Dit is aantoonbaar zijn na overdracht van de eiwitten naar een membraan en het uitvoeren van een westelijke vlek. Stabiele vezels zal een scherpe diagonaal patroon vertonen. Elke afwijking hiervan zou suggereren dat de vezels ondergaan veranderingen als gevolg van de SDS-elektroforese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding van de monsters
- Cultuur 2 x 106 amyloid HT-29 dikke darm kankercellen in een schaal 10-cm weefselkweek in 10 mL van de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) met 10% foetale runderserum en penicilline-streptomycine produceren. Cultuur cellen overnachting in een incubator 37 ° C met 5% CO2.
- Nadat de cellen tot 80% confluentie groeien, wassen de cellen met 10 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg 3 mL trypsine oplossing en Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 minuten.
- Nadat de cellen volledig gedissocieerde uit de schotel zijn, voeg toe 10 mL gestolde voedingsbodem en de cellen met een pipet 10 mL overbrengen in een conische buis 15 mL. Centrifugeer de cellen bij 1.000 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Het medium gecombineerd, resuspendeer de cellen in 5 mL gestolde voedingsbodem en met behulp van een cel counter cellen tellen. Plaat 2 x 106 cellen in elk van de twee 10-cm schotels.
- De cellen te houden en te herstellen 's nachts in een incubator 37 ° C met 5% CO2toestaan. Behandeling toepassen op een schotel voor het opwekken van de vorming van amyloids met 20 ng/mL Tumornecrosefactor-alfa (TNF-α), 100 nM Smac-mimetische en 20 µM pan-caspase-remmer Z-VAD-FMK11. De combinatie wordt afgekort als TSZ. Behandelen de andere schotel met voertuig als een besturingselement.
- Na de juiste lengte van de tijd, meestal 6 h, oogsten de cel lysate.
- Schraap de cellen uit de plaat met een kunststof schraper en een 10-mL pipet gebruiken om te zetten in een conische buis 15 mL. Centrifugeer de cellen bij 1.000 x g gedurende 3 min bij 4 ° C.
- De cellen 2 keer wassen door resuspending in 10 mL ijs koud PBS en centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 3 min bij 4 ° C. De PBS-oplossing gecombineerd.
Opmerking: Het proces kan hier onderbroken worden door bevriezing van de cel pellet in vloeibare stikstof en slaan op ˗80 ° C voor maximaal 1 maand. - De cel pellet overbrengen naar een 1.5-mL microcentrifuge buis en incubeer in 0.3 mL lysisbuffermengsel gedurende 30 minuten op het ijs. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C. De bovendrijvende substantie is de hele cel lysate.
Opmerking: Het proces kan hier onderbroken worden door op te slaan van het monster bij-20 ° C voor tot enkele maanden. - De eiwitconcentratie meten door een analyse van Bradford volgens protocol van de fabrikant. Voeg 4 x SDD-leeftijd laden buffer te bereiden 20 µL van 3 µg/µL monster en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
2. opstellen en uitvoeren van Gels
- Voeg 2 g agarose tot 200 mL voor 1 x Tris-acetaat buffer (TAE) in een bekerglas van glas en warmte in een magnetron te smelten de agarose. Voeg 1 mL 20% SDS voor een uiteindelijke concentratie van 0,1% SDS. Swirl zorgvuldig te mengen. Wees voorzichtig niet te bellen na de toevoeging van de SDS genereren.
- Giet de agarose-oplossing in een gel-plaat van 15 cm x 14 cm. Gebruik een 1 mL pipet te elimineren alle bubbels. Plaats een 20-well kam boven.
- Eerste dimensie: Pipetteer 60 µg van hele cel lysate in de extreem-rechtse rijstrook. Uitvoeren van de gel op 60 V voor ongeveer 4 h (totdat de kleurstof voorzijde ongeveer ¾ door de gel is) met behulp van de TAE met 0,1% SDS als de lopende buffer.
- Tweede dimensie: zorgvuldig draaien de gel 90° linksom(Figuur 2). Stel de gel op 60 V voor ongeveer 4 uur.
Opmerking: De algemene lopende voorwaarde is 4 V/cm gel lengte. Het is belangrijk dat de lopende voorwaarden precies hetzelfde voor de eerste en tweede dimensie zijn.
3. overdracht
- Gebruik de capillaire overdrachtmethode om de eiwitten overbrengen in een Polyvinylideenfluoride (PVDF) difluoride membraan (Figuur 2B).
- Voeg 500 mL buffer van de overdracht aan een ongeveer 20 x 20 cm container. Het maken van een 5-cm hoge stapel papieren handdoeken naast de container. De oppervlakte van de bovenkant van de stack moet groter zijn dan de afmetingen van de gel.
- Doordrenk een filtreerpapier 14 x 15 cm in overdracht buffer en plaats boven aan de stapel papier handdoek. Zorg om te plaatsen op het papier met geen rimpels of bellen. Herhaal met een ander stuk filtreerpapier.
- Activeren van een membraan PVDF 14 x 15 cm in methanol voor 30 s laag dan het op het filtreerpapier verzorgen met een roller te verwijderen alle bubbels. Spoel de gel af met overdracht buffer en het laag op de top van het membraan, opnieuw uitrollen van alle bubbels.
- Betrekking hebben op de rand van het dichtst bij de container van overdracht buffer met plastic wrap keukenpapier. Het is belangrijk dat de papieren brug gebouwd in de volgende stap niet in direct contact met de stapel papier handdoek komt.
- Geniet van een stuk van 15 x 35 cm filtreerpapier in overdracht buffer en plaats het zodat één uiteinde de bovenkant van de gel bestrijkt en het andere uiteinde in de container van overdracht buffer. Herhaal met een andere brug.
- Bedek de container met plastic wrap en laat 's nachts bij kamertemperatuur.
4. westelijke bevlekken detectie
- Spoel het membraan met 50 mL PBS met 0,05% Tween-20 (PBST) in een container van 20 cm × 20 cm. Voeg 20 mL 5% melk in PBST. Rock bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten om te blokkeren.
- Pipetteer 10 µL konijn anti-MLKL antistof in 20 mL 5% melk in PBST en toevoegen aan de container. Incubeer op rocker's nachts bij 4 ° C.
- Het membraan in 20 mL PBST voor 5 min. Herhaal 5 keer wassen.
- Pipetteer 4 µL van anti-rabbit-HRP tot 20 mL 5% melk in PBST en toevoegen aan de container. Incubeer op rocker bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
- Het membraan in 20 mL PBST voor 5 min. Herhaal 5 keer wassen.
- Verbeterde Chemiluminescentie substraat (ECL) toevoegen en blootstellen aan X-ray films volgens protocol van de fabrikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na necroptosis inductie bleek RIPK1 en RIPK3 bijna identiek amyloid-achtige patronen (rijstroken 2 en 4, Figuur 1). Meer heterogene waren echter MLKL vezels en leek te zijn kleiner dan RIPK1/RIPK3 vezels (lane 6, Figuur 1). Dat gevraagd ons de 2D SDD-leeftijd-methode om de mogelijkheid MLKL vormt RIPK1/RIPK3-onafhankelijke vezels of MLKL gewoon distantieert van de grote RIPK1/RIPK3/MLKL-vezels tijdens SDD-leeftijd te ontwikkelen.
Een algemeen schema van de elektroforese en overdracht procedure is afgebeeld in Figuur 2. Tijdens de eerste dimensie SDD-leeftijd, zal de amyloïde of amyloid-achtige vezels een karakteristiek uitstrijkje, zoals te zien in Figuur 3Avertonen. Bij het uitvoeren van de tweede dimensie SDD-leeftijd, zijn er twee mogelijke uitkomsten. In het geval van geen afbraak of dissociatie tijdens de gel process uitgevoerd, zal de vezels migreren identiek tijdens de tweede run zoals ze in de eerste run deden. In dit geval zal een westelijke vlek vertonen een diagonaal patroon op het membraan in een hoek van 45° zoals te zien in Figuur 3B. Als de vezels tijdens het proces van de SDD-leeftijd distantiëren, zal de kleinere vezels sneller tijdens de tweede elektroforese migreren. In dit geval zal een westelijke vlek vertonen verticale strepen onder de diagonale lijn, zoals afgebeeld in Figuur 3C.
In het geval van de MLKL vezels gezien tijdens necroptosis, tonen ze de karakteristieke uitstrijkjes tijdens de eerste dimensie SDD-leeftijd (Figuur 4A). Wanneer die dezelfde vezels werden onderworpen aan 2D SDD-leeftijd, vertoonden ze een scherpe diagonale lijn met verticale strepen (Figuur 4B). Met dit bewijs geconcludeerd werd dat MLKL niet van de vezels tijdens de SDD-leeftijd distantieert was en dat de MLKL-bevattende vezels te zien in Figuur 1 inderdaad verschillend van de RIPK1/RIPK3-vezels waren. Bovendien, toen RIPK3 immuno-uitgeput van de cel lysates, de MLKL vezels bleef intact4, waarin wordt bevestigd dat MLKL vezels en RIPK1/RIPK3 vezels inderdaad verschillende entiteiten zijn.
Figuur 1 . Onderzoek van amyloid-achtige vezels tijdens necroptosis. Hele cel lysates werden geoogst uit cellen TNF-veroorzaakte necroptosis ondergaan en onderworpen aan SDD-leeftijd. Westelijke vlekken werden uitgevoerd voor RIPK1, RIPK3 en MLKL. De MLKL-bevattende vezels tentoongesteld een afzonderlijke migratie-patroon van de RIPK1/RIPK3-bevattende vezels. Het monomeer MLKL is nauwelijks zichtbaar onder deze voorwaarde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Experimentele protocol. (A) schema van de tweedimensionale semi-denatureren wasmiddel agarose gelelektroforese (2D SDD-leeftijd). Beginnen met het laden van het monster in de meeste rechterbaan, gemarkeerd in het rood. Na beëindiging van de eerste run van de dimensie, de gel 90° linksom te draaien. Voer de Elektroforese van de tweede dimensie. Gevulde pijl geeft de richting van de eerste dimensie uitvoeren, gestippelde pijl geeft de richting van de tweede dimensie uitvoeren. (B) Schema van overdracht door capillaire werking. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Mogelijke resultaten. (A) de verwachte migratie patroon van amyloïde of amyloid-achtige vezels na de eerste dimensie van de SDD-leeftijd. Gevulde pijl geeft de richting van de migratie. (B) de verwachte migratie patroon van de SDD-leeftijd-stable (geen afbraak of dissociatie) amyloid of amyloid-achtige vezels na 2D SDD-leeftijd. Gevulde pijl geeft de richting van de eerste dimensie SDD-leeftijd. Gestippelde pijl geeft de richting van de tweede dimensie SDD-leeftijd. (C) het verwachte migratie-patroon van de niet-SDD-leeftijd-stable amyloid of amyloid-achtige vezels. Gevulde pijl geeft de richting van de eerste dimensie SDD-leeftijd. Gestippelde pijl geeft de richting van de tweede dimensie SDD-leeftijd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Migratie van MLKL-bevattende vezels tijdens 1D en 2D SDD-AGE. (A) hele cel lysates zijn geoogst uit cellen gestimuleerd met TSZ necroptosis ondergaan. De lysates werden onderworpen aan SDD-leeftijd, en een westelijke vlek voor MLKL werd uitgevoerd. Een karakteristiek uitstrijkje werd waargenomen. (B) hele cel lysates zijn geoogst uit cellen gestimuleerd met TSZ necroptosis ondergaan. De lysates werden onderworpen aan 2D SDD-leeftijd en een westelijke vlek voor MLKL werd uitgevoerd. Een scherpe lijn onder een hoek van 45° werd waargenomen, die aangeeft dat de vezels niet dissociatie tijdens SDD-leeftijd doen ondergaan. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meest kritische aspect van de 2D SDD-leeftijd is dat de voorwaarden van de elektroforese hetzelfde voor de eerste en tweede dimensie zijn. De capaciteit om te ontdekken een scherpe diagonale lijn van 45 ° (hetgeen aangeeft dat geen dissociatie of aantasting heeft plaatsgevonden) hangt af van de vezels die migreren op identieke wijze tijdens beide electrophoreses. Met behulp van verschillende omstandigheden, bijvoorbeeld het wijzigen van de spanning of de lengte van de runtime zal het verdoezelen van deze resultaten. Ook, zoals het geval is voor traditioneel 1D SDD-leeftijd, koken van het monster moet worden vermeden, omdat dit amyloid en amyloid-achtige vezels verstoren zal. Zoals voor alle overdrachten geldt, moet worden gezorgd om luchtbellen tussen de lagen filterpapier, membraan en gel. Tot slot, tijdens de stap van de overdracht, het is cruciaal dat de brug niet hangen en direct contact opnemen met de stapel papier handdoek. Een betrouwbare manier om dit te voorkomen is het gebruik van een klein stukje plastic wrap ter dekking van de rand van de papieren handdoeken.
Lopende benamingen in het protocol (60 V voor 4 uur) kunnen worden aangepast. Bijvoorbeeld, was de agarose gel in dit protocol, 14 x 15 cm. Als een kleinere gel wordt gebruikt, moeten spanning (4 V/cm gel lengte) en runtime proportioneel worden aangepast. Twee monsters kunnen tegelijk worden geanalyseerd met behulp van twee kammen, bij de voorbereiding van de gel. De monsters moeten worden geladen in het recht meest goed voor elke kam. In dit geval moet de bewerkingstijd opnieuw worden ingekort zodat het bovenste monster wordt niet uitgevoerd in de bodem de helft van de gel. Indien de tijd wordt aangepast voor de ene dimensie van de gel, is het essentieel dat de andere dimensie wordt aangepast om aan te passen.
In tegenstelling tot de SDS-pagina zijn zowel 1 D en 2D SDD-leeftijd semi-denatureren. Omdat de vezels intact blijven, kunnen sommige epitopes blijven ontoegankelijk. Dit kan de detectie beperken door sommige antilichamen. 2D SDD-leeftijd wordt beperkt in zijn vermogen om de exacte grootte van amyloïde of amyloid-achtige vezels. Echter kan een relatieve grootte vergelijking worden gemaakt.
Alle eiwitcomplexen zijn onderworpen aan dissociatie of afbraak tijdens SDD-leeftijd, en dus de kwalitatieve resultaten kunnen moeilijk te interpreteren. Het gebruik van 2D SDD-leeftijd toelaat bevestiging dat grootte heterogeniteit gezien tijdens de SDD-leeftijd geen gevolg van SDS-afhankelijke dissociatie tijdens elektroforese is. 2D SDD-leeftijd is geschikt voor gebruik in een context waar traditionele 1 D SDD-leeftijd wordt gebruikt. 2D SDD-leeftijd is vooral handig wanneer grootte heterogeniteit is waargenomen in 1 D SDD-tijdperk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door een fellowship voor S.H.-A. NIH-/ NCATS (TL1TR001104), een stichting Welch verlenen (I-1827) en een subsidie van de R01 van NIGMS (RGM120502A) voor Z.W. Z.W. is de Virginia Murchison Linthicum geleerde in medisch onderzoek en preventie van kanker en onderzoek instituut van Texas geleerde (R1222).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gel electrophoresis unit | Fisher | HE99XPRO | appratus for gel running. |
| agrose | VWR | 97062-250 | For agarose gel. |
| paper tower | Fisher | 19-120-2484 | for transfering |
| filter paper | VWR | 21427-386 | for transfering |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | for transfering |
| blocking milk powder | Bio-Rad | 1706404XTU | for blocking in Western blot |
| MLKL antibody | Genetex | GTX107538 | rabbit anti-MLKL antibody |
| RIPK1 antibody | BD Biosciences | 610459 | mouse anti-RIPK1 antibody |
| RIPK3 antibody | gift from Dr. Xiaodong Wang | rabbit anti-RIPK3. See refenence 11. | |
| anti-Rabbit-HRP | Sigma | A6154 | secondary antibody |
| ECL | Fisher | WBKLS0500 | Western chemiluminescent HRP substrate |
| X-ray film | Fisher | F-BX810 | for Western blot result |
| DMEM | Sigma | D6429 | for cell culture |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | for cell culture |
| penicilin-streptomycin | Sigma | P4333 | for cell culture |
| Trypsin solution | Sigma | T4049 | for cell culture |
| PBS for tissue culture | Sigma | D8662 | for cell culture |
| recombinant TNF | made in our lab | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| smac-mimetic | gift from Dr. Xiaodong Wang | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| ZVAD-FMK | ApexBio | A1902 | for inducing necroptosis. See reference 11. |
| Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Model TC20; for counting cells |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | for measuring protein concentration in cell lysates |
| Cell lifter | Fisher | 07-200-364 | to remove cells from dish |
| Lysis Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired) |
||
| 10X TAE (1 L) | 48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L |
||
| 4X SDD-AGE loading buffer (50 mL) | 5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O |
||
| TBS Transfer Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O |
||
| PBST Wash Buffer (1 L) | 100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20 |
||
| 10X PBS (10 L) | 800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L |
References
- Ross, C. A., Poirier, M. A.
- Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
- Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
- Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).
- Uptain, S. M., Lindquist, S. Prions as protein-based genetic elements. Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. , (2008).
- Sipe, J. D., et al. Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis. Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).
- Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level. Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).
- Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. Methods in Enzymology. 412, Academic Press. 33-48 (2006).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137, 1100-1111 (2009).
