Summary
כאן נשתמש agarose למחצה denaturing דו-ממדית בג'ל כדי לאשר הנוכחות של סיבי עמילואיד כמו גודל הטרוגניות או לא לכלול את האפשרות הטרוגניות גודל נובע דיסוציאציה של סיבי עמילואיד במהלך הג'ל התהליך פועל.
Abstract
סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי קושרו עם מחלות רבות, עכשיו מתגלים להיות חשובה עבור רבים איתות המסלולים. היכולת לזהות בקלות היווצרות של סיבים אלה בתנאים שונים נסיוני חיוני להבנת פונקציית הפוטנציאל שלהם. שיטות רבות השתמשו כדי לזהות את הסיבים, אבל לא בלי מספר חסרונות. לדוגמה, מיקרוסקופ אלקטרונים (EM), או צביעת קונגו האדום או Thioflavin T לעיתים קרובות דורשת טיהור של הסיבים. מצד שני, agarose דטרגנט למחצה denaturing בג'ל (SDD-גיל) מאפשרת זיהוי של סיבי עמילואיד דמוי עמידים מרחביות תמציות תא ללא טיהור. בנוסף, הוא מאפשר השוואת ההבדל בגודל של הסיבים. ויותר חשוב, זה יכול לשמש כדי לזהות חלבונים ספציפיים בתוך הסיבים מאת סופג המערבי. זה פחות זמן רב ונגיש בקלות רבה יותר על מספר רחב של מעבדות. המפגין-גיל התוצאות מציגות לעיתים קרובות משתנה מידת הטרוגניות. זה מעלה את השאלה אם חלק הטרוגניות נובעת הדיסוציאציה של החלבונים במהלך אלקטרופורזה בנוכחות מרחביות. מסיבה זו, יש לנו עובדים ממד השנייה של המפגין-גיל כדי לקבוע אם הטרוגניות גודל ראיתי בעידן-המפגין הוא באמת תוצאה של סיבים הטרוגניות ויוו , לא תוצאה של השפלה או דיסוציאציה של חלק החלבונים במהלך אלקטרופורזה. שיטה זו מאפשרת אישור מהיר, איכותי כי סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי לא בריא באופן חלקי במהלך תהליך המפגין-גיל.
Introduction
היווצרות של סיבי עמילואיד עקב חלבון misfolding יש כבר זמן רב ידוע לשחק תפקיד פיפטות מחלות כמו אלצהיימר, פרקינסון, מחלת הנטינגטון1. לאחרונה, היווצרות של סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי הוכח להיות חלק איתות המסלולים בבני אדם, לרבות במהלך התגובה החיסונית מולדת אנטי ויראלית2 ו- necroptosis3,4, ואת היצורים התחתון כגון שמרים5,6. לכן, היכולת לזהות סיבים אלו במעבדה הוא חשוב. כיום, ישנן שלוש דרכים הראשי כדי לזהות עמילואיד ו סיבי עמילואיד כמו: השימוש של צבעי EM, המפגין-גיל.
השימוש של צבעים, כגון קונגו האדום או Thioflavin T, מציעה את היתרון של להיות מהירה בקלות לזיהוי באמצעות מיקרוסקופ או ספקטרוסקופיה7. עם זאת, זיהוי על ידי מיקרוסקופ, במקרה של קונגו אדום, מספק אין ירידה לפרטים אודותיו חלבונים המרכיבים את הסיבים, או הגודל של הסיבים. בדומה לכך, השימוש של ספקטרוסקופיה לאתר קשירה קונגו אדום או Thioflavin T מתחמי חלבון מספק רק תוצאה חיובית או שלילית.
EM מספקת ראיה חלוטה הנוכחות של סיבים וגם מידע כמותי אודות סיבי האורך ואת קוטר8. עם זאת, שיטה זו דורשת טיהור מחמירים מאוד. בנוסף, EM היא טכניקה מיוחדת אשר משתמשת ציוד יקר.
המפגין-גיל שימש כדי לזהות עמידים מרחביות מגה דלטון חלבון מתחמי לרבות סיבי עמילואיד או דמוי עמילואיד. הוא מציע יתרונות רבים. ראשית, הוא אינו דורש הטיהור של סיבי, הוא קל לעיתים9. שנית, הוא מספק מידע איכותי על הגודל של הסיבים, כולל גודלו היחסי וכמות סיבים heterogenicity. לבסוף, מאחר סופג המערבי יכול להתבצע לאחר אלקטרופורזה, קל לזהות הנוכחות של כל חלבון אשר יש נוגדן, למרות יודגש כי מכיוון המפגין-גיל denaturing למחצה, epitopes מסוימים עשויים להישאר נסתרים אשר מסבך זיהוי על ידי נוגדנים.
לאחרונה, קולטן שמעצבת קינאז 1 (RIPK1) ו- 3 (RIPK3) דווחו על סיבי עמילואיד טופס כדי לשמש איתות פלטפורמות במהלך necroptosis, צורה מתוכנתים של נמק3. תוך כדי לימוד סיבים אלו, המעבדה שלנו הראה כי חלבון אחר הקשורים necroptosis, מעורב שושלת היוחסין קינאז כמו תחום (MLKL), נוצר גם סיבי עמילואיד דמוי4. עם זאת, לאחר בדיקה עם המפגין-גיל, גודל הסיבים MLKL הופיע נבדל הסיבים RIPK1 ו RIPK3, אשר הופיע זהים אחד לשני (איור 1). זה היה לא צפוי כי זה ידוע כי MLKL נקשר RIPK1/RIPK3 כדי ליצור necroptosis באיתות מורכבים שנקרא necrosome10.
ישנם לפחות שני הסברים. ראשית, שני סיבי עמילואיד דמוי שונים לגמרי עלולה להיווצר במהלך necroptosis, אחד המכיל RIPK1/RIPK3, את MLKL המכיל אחרים. שנית, רק סוג אחד של סיבי עמילואיד דמוי שהמכיל RIPK1/RIPK3/MLKL עשוי להיווצר במהלך necroptosis, אבל השיוך של MLKL חלבונים אחרים הוא חלש מספיק. כי זה dissociates במהלך המפגין-גיל.
כדי לטפל בבעיה זו, אנו מציעים מבצע דו מימדי (2D) המפגין-עידן. המפגין-גיל-יציבה עמילואיד או סיבי עמילואיד דמוי יהיה אותו דפוס ההעברה במהלך אלקטרופורזה הממד הראשון והשני. זה יהיה לזיהוי לאחר העברת החלבונים קרום, בביצוע של תספיג חלבון. סיבי יציב תערוכת דפוס אלכסוני חדה. כל סטייה ממנו הייתי מציע כי הסיבים עוברים שינויים עקב מרחביות-אלקטרופורזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מכינים דגימות
- תרבות 2 x 106 עמילואיד לייצר תאים סרטניים של המעי הגס HT-29 בקערה תרביות רקמה ס מ-10 ב- 10 מ"ל של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) המכילה 10% סרום שור בעובר ו פניצילין-סטרפטומיצין. התרבות התאים לינה חממה 37 ° C עם 5% CO2.
- לאחר התאים גדלים כדי 80% confluency, לשטוף את התאים עם 10 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS). להוסיף 3 מ"ל של פתרון טריפסין, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות.
- לאחר התאים הם לגמרי dissociated מתוך קערה, להוסיף 10 מ של תרבות בינוני ולא להעביר את התאים עם פיפטה 10-mL צינור חרוטי 15-mL. Centrifuge התאים ב 1,000 x g למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. תשאף המדיום, resuspend את התאים ב 5 מ של תרבות בינוני, ולספור את התאים באמצעות מונה תא. צלחת 2 x 106 תאים של שני ס מ-10 מנות כל אחת.
- לאפשר את התאים לדבוק ולשחזר ללון בחממה 37 ° C עם 5% CO2. טיפול חלות על צלחת אחת כדי לגרום להיווצרות amyloids עם 20 ng/mL הגידול נקרוזה מקדם-אלפא (TNF-α), 100 ננומטר Smac-מימטי ולאחר 20 מיקרומטר פאן-קספאז מעכב Z-VAD-FMK11. השילוב הוא באופן מקוצר כ- TSZ. פנקו את המנה אחרים עם רכב כפקד.
- לאחר משך הזמן המתאים, בדרך כלל 6-אייץ ', לקצור את התא lysate.
- לגרד את התאים מהצלחת עם במגרדת פלסטיק ולהשתמש פיפטה של 10-mL להעביר לתוך צינור חרוטי 15-mL. Centrifuge התאים ב g x 1,000 דקות 3-4 מעלות צלזיוס.
- לשטוף את התאים פי 2 על ידי resuspending ב- 10 מ"ל של PBS קר קרח צריך שתוציאו ב g x 1,000 דקות 3-4 מעלות צלזיוס. האחות הפתרון PBS.
הערה: התהליך ניתן להשהות כאן על ידי קופאת בגדר תא חנקן נוזלי ואחסון ב ˗80 ° C עד כחודש. - בגדר תא להעביר צינור 1.5-mL microcentrifuge, דגירה ב mL 0.3 פירוק מאגר במשך 30 דקות על קרח. צנטריפוגה ב 20,000 x g למשך 15 דקות ב 4 º C. תגובת שיקוע הוא lysate את כל התא.
הערה: התהליך ניתן להשהות כאן על-ידי אחסון הדגימה ב-20 ° C עבור אפילו מספר חודשים. - למדוד את ריכוז החלבון על ידי assay ברדפורד על-פי הפרוטוקול של היצרן. להוסיף 4 x המפגין-גיל מאגר טעינה כדי להכין 20 µL מדגם µg/µL 3, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
2. מכינים ולהפעיל ג'לים
- להוסיף 2 גר' agarose 200 מ של 1 x טריס-אצטט (טה) של מאגר כוס זכוכית ומחממים במיקרוגל כדי להמיס את agarose. להוסיף 1 מ"ל של 20% מרחביות על ריכוז סופי של 0.1% מרחביות. מערבולת בזהירות לערבב. לטפל לא כדי לייצר בועות לאחר התוספת מרחביות.
- שופכים את הפתרון agarose לתוך לוח ג'ל 15 ס מ x 14 ס מ. להשתמש על פיפטה 1-mL כדי לחסל בועות. מקום אחד מסרק 20-ובכן בחלק העליון.
- תחילה ממד: פיפטה 60 µg של כל תא lysate בנתיב ימני-קיצוני. להפעיל את הג'ל 60 V במשך כ 4 שעות (עד החזית צבע היא כ ¾ דרך הג'ל) באמצעות את הגטים המכיל מרחביות 0.1% כמו המאגר המצטבר.
- שנית ממד: לסובב בזהירות את הג'ל 90° נגד כיוון השעון (איור 2א). הפעל את הג'ל 60 V במשך כ 4 שעות.
הערה: הפעלה כללית היא 4 V/ג'ל ס"מ. חשוב כי התנאים פועל הן בדיוק זהה עבור הממדים הראשון והשני.
3. העברה
- השתמש בשיטת העברה נימי כדי להעביר את החלבונים קרום difluoride (PVDF) polyvinylidene (איור 2B).
- להוסיף 500 מ"ל של מאגר העברה כ 20 ס"מ על 20 ס"מ מיכל. להפוך ערימה גבוהה 5-ס מ של מגבות נייר ליד המכל. שטח הפנים העליון של הערימה חייב להיות גדול יותר מהמימדים ג'ל.
- להשרות נייר סינון של 14 ס"מ על 15 ס"מ מאגר העברה ומניחים על גבי נייר מגבת המחסנית. לטפל כדי למקם על הנייר ללא קמטים או בועות. חוזר עם עוד פיסת נייר סינון.
- להפעיל את קרום PVDF 14 ס"מ על 15 ס"מ ב מתנול עבור 30 s ואז להחליק אותו על נייר הסינון מקפיד להשתמש מכבש כדי להסיר את כל הבועות. לשטוף את הג'ל עם מאגר העברה, להחליק אותו על גבי הקרום, מגלגלים שוב בועות.
- לכסות על קצה מגבות הנייר הקרוב ביותר הגורם המכיל מאגר העברה בניילון נצמד. חשוב כי הגשר נייר נבנה בשלב הבא לא בא במגע ישיר עם הערימה מגבת נייר.
- לטבול פיסת נייר סינון 15 ס"מ x 35 ס"מ מאגר העברה ולמקם אותו כך קצה אחד מכסה את החלק העליון של הג'ל, והקצה השני נמצא בתוך המיכל מאגר העברה. חזור עם גשר נוסף.
- מכסה המכולה בניילון נצמד ומשאירים למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
4. ווסטרן סופג זיהוי
- לשטוף את הקרום עם 50 מ של PBS המכילה 0.05% Tween-20 (PBST) בתוך מיכל 20 ס"מ × 20 ס"מ. הוסף 20 מ"ל חלב 5% PBST. רוק בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לחסום.
- פיפטה 10 µL של הארנב נוגדן anti-MLKL לתוך 20 מ ל חלב 5% PBST ולהוסיף המכולה. דגירה על נדנדה בין לילה ב 4 º C.
- לשטוף את הקרום ב- 20 מ של PBST עבור 5 דק 5 חוזר פעמים.
- פיפטה µL 4 של אנטי-rabbit-HRP 20 מ ל חלב 5% ב- PBST ולהוסיף המכולה. דגירה על נדנדה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
- לשטוף את הקרום ב- 20 מ של PBST עבור 5 דק 5 חוזר פעמים.
- להוסיף chemiluminescence משופרת המצע (ECL) ולחשוף לסרטי רנטגן לפי הפרוטוקול של היצרן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר אינדוקציה necroptosis, RIPK1 ו- RIPK3 הראו כמעט זהה עמילואיד דוגמאות (נתיבים 2 ו- 4, איור 1). עם זאת, סיבי MLKL היו הטרוגנית יותר ודומה להיות קטן יותר סיבים RIPK1/RIPK3 (ליין 6, איור 1). שהביאה אותנו לפתח שיטת המפגין-גיל 2D להתייחס לאפשרות MLKL טפסים סיבי RIPK1/RIPK3-עצמאית או MLKL פשוט dissociates של הסיבים RIPK1/RIPK3/MLKL גדול במהלך המפגין-גיל.
תרשים כללי של ההליך אלקטרופורזה והעברת מוצג באיור2. במהלך המימד הראשון המפגין-גיל, סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי תערוכת כתם אופיינית, כפי שניתן לראות באיור 3א. בעת הפעלת את המימד השני המפגין-גיל, יש שתי תוצאות אפשריות. במקרה של אין השפלה או דיסוציאציה במהלך הג'ל פועל תהליך, הסיבים להעביר באופן זהה במהלך הריצה השנייה כפי שעשו בשלב הראשון. במקרה זה, תספיג תערוכת דפוס באלכסון על הקרום בזווית של 45° כפי שניתן לראות באיור 3. אם הסיבים מביצועם במהלך תהליך המפגין-גיל, הסיבים קטן להעביר מהר יותר במהלך אלקטרופורזה השני. במקרה זה, תספיג תערוכת ומבטא אנכי מתחת לקו האלכסוני, כפי שמוצג באיור 3ג'.
במקרה של הסיבים MLKL במהלך necroptosis, הם מראים את השמצות אופיינית במהלך המימד הראשון המפגין-גיל (איור 4א). כאשר את הסיבים. אותו היה נתון המפגין 2D-גיל, הציגה קו אלכסוני חדה עם לא אנכי streaking (איור 4B). עם הראיות, הוא היה הסיקו כי MLKL היה לא בריא של הסיבים במהלך תהליך המפגין-גיל, כי הסיבים המכילות MLKL ראה באיור 1 היו אכן נבדלת הסיבים RIPK1/RIPK3. יתר על כן, כאשר RIPK3 היה מדולדל חיסונית מ lysates התא, הסיבים MLKL נשארו שלמים4, המאשר כי סיבים MLKL וסיבים RIPK1/RIPK3 הן ישויות נפרדות אכן.
איור 1 . בחינה של סיבי עמילואיד דמוי במהלך necroptosis. כל תא lysates היו מן התאים שעברו necroptosis TNF-induced ונחשפו המפגין-גיל. שהכלים המערבי בוצעו עבור RIPK1, RIPK3 MLKL. הסיבים המכילות MLKL הציג דפוס העברה ברורה של הסיבים RIPK1/RIPK3-המכילים '. מונומר MLKL הוא בקושי נראה לעין תחת תנאי זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . נסיוני. תיאור סכמטי של agarose דטרגנט למחצה denaturing דו-ממדית בג'ל (SDD 2D-גיל) (A). התחל על-ידי טעינת המדגם בנתיב הימני ביותר, באדום. לאחר סיום של ההפעלה ממד הראשונה, לסובב את הג'ל 90° נגד כיוון השעון. הפעל את אלקטרופורזה הממד השני. חץ מוצק מצביעה על הכיוון של הממד הראשון לרוץ, חץ מנוקד מצביעה על הכיוון של הממד השני להפעיל. (B) הסכימה של העברה על ידי נימיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . תוצאות אפשריות. דפוס (א') ההעברה הצפויה של סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי לאחר המימד הראשון של המפגין-גיל. חץ מוצק מציין את הכיוון של הגירה. דפוס (B) ההעברה הצפויה של עמילואיד המפגין-גיל-יציב (לא השפלה או דיסוציאציה) או סיבי עמילואיד דמוי אחרי המפגין 2D-גיל. חץ מוצק מציין את הכיוון של הממד הראשון המפגין-גיל. חץ מנוקד מציין את הכיוון של הממד השני המפגין-גיל. (ג) התבנית ההעברה הצפויה של עמילואיד שאינם המפגין-גיל-יציב או סיבי עמילואיד דמוי. חץ מוצק מציין את הכיוון של הממד הראשון המפגין-גיל. חץ מנוקד מציין את הכיוון של הממד השני המפגין-גיל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. העברה של MLKL המכילים סיבים במהלך 1 י, המפגין 2D-גיל- (א) כל תא lysates נבצרו מתאי מגורה עם TSZ לעבור necroptosis. Lysates היו נתונים המפגין-גיל, תספיג בוצע עבור MLKL. כתם האופיינית נצפתה. Lysates התא כולו (B) נבצרו מתאי מגורה עם TSZ לעבור necroptosis. Lysates היו נתונים המפגין 2D-גיל, תספיג בוצע עבור MLKL. קו חד בזווית של 45 מעלות נצפתה, המציין כי הסיבים אינם עוברים דיסוציאציה במהלך המפגין-גיל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפן הקריטי ביותר של המפגין 2D-הגיל הוא כי התנאים אלקטרופורזה זהים עבור הממד הראשון והשני. היכולת לזהות קו אלכסוני חדה ב- 45 מעלות (המציין שהתרחשה אין דיסוציאציה או השפלה) תלוי הסיבים מעביר בצורה זהה במהלך שני electrophoreses. שימוש בתנאים שונים, לדוגמה שינוי המתח או את משך זמן ריצה, מטשטש את התוצאות הללו. בנוסף, כמו במקרה עבור מסורתי 1 י המפגין-גיל, רותחים המדגם יש להימנע, ככל זה ישבש עמילואיד ו סיבי עמילואיד דמוי. כמו במקרה של כל העברות, להקפיד להימנע בועות בין השכבות של נייר סינון, קרום, ג'ל. לבסוף, במהלך השלב העברה, זה קריטי כי הגשר לא נפולות, קשר ישירות עם הערימה מגבת נייר. דרך אמינה כדי למנוע זאת היא להשתמש חתיכה קטנה של ניילון נצמד כדי לכסות על קצה מגבות הנייר.
יכול להיות מותאם התנאים פועל בתנאי בפרוטוקול (60 V במשך 4 שעות). לדוגמה, פרוטוקול זה, הג'ל agarose היה 14 ס"מ על 15 ס"מ. אם ג'ל קטן יותר, מתח (4 V/ג'ל ס"מ), זמן ריצה צריך להיות מותאם באופן פרופורציונלי. עשוי להיות מנותח בשתי הדגימות בבת אחת באמצעות שני מסרקים בעת הכנת את הג'ל. הדגימות ייטען המתאים ביותר עבור כל המסרק. במקרה זה, כדאי שוב יתקצר זמן ריצה כך המדגם העליון אינו פועל לתוך החלק התחתון של הג'ל. אם הזמן מותאם עבור ממד אחד של הג'ל, זה קריטי כי המימד האחר מותאמת.
בניגוד מרחביות-עמוד 1 י והן המפגין 2D-גיל הם חצי denaturing. כי הסיבים נותרו ללא פגע, epitopes מסוימים עשויה להישאר נגישים. זה עלול להגביל את זיהוי באמצעות נוגדנים מסוימים. המפגין 2D-גיל היא מוגבלת ביכולתה לקבוע את הגודל המדויק של סיבי עמילואיד או דמוי עמילואיד. עם זאת, ניתן לבצע השוואה גודלו היחסי.
כל חלבון מתחמי דיסוציאציה או השפלה במהלך המפגין-גיל, כך התוצאות איכותי עשוי להיות קשה לפרש. השימוש 2D המפגין-גיל מאפשרת אישור כי גודל הטרוגניות במהלך עידן המפגין ואינו תלוי-מרחביות דיסוציאציה במהלך אלקטרופורזה. המפגין 2D-גיל הוא מתאים לשימוש בכל הקשר שבה נעשה שימוש מסורתי 1 D המפגין בגיל. המפגין 2D-גיל היא שימושית במיוחד כאשר גודל הטרוגניות נצפית המפגין D 1-בגיל....
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי התחברות עבור תרגום-א מ- NIH/NCATS (TL1TR001104), קרן Welch הענק (I-1827), מענק R01 של NIGMS (RGM120502A) ל ז. ו. ז. ו. המלומד קמפ ספרינגס מורצ'יסון וירג'יניה מחקר רפואי, מניעת סרטן, מכון המחקר של טקסס מלומד (R1222).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gel electrophoresis unit | Fisher | HE99XPRO | appratus for gel running. |
| agrose | VWR | 97062-250 | For agarose gel. |
| paper tower | Fisher | 19-120-2484 | for transfering |
| filter paper | VWR | 21427-386 | for transfering |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | for transfering |
| blocking milk powder | Bio-Rad | 1706404XTU | for blocking in Western blot |
| MLKL antibody | Genetex | GTX107538 | rabbit anti-MLKL antibody |
| RIPK1 antibody | BD Biosciences | 610459 | mouse anti-RIPK1 antibody |
| RIPK3 antibody | gift from Dr. Xiaodong Wang | rabbit anti-RIPK3. See refenence 11. | |
| anti-Rabbit-HRP | Sigma | A6154 | secondary antibody |
| ECL | Fisher | WBKLS0500 | Western chemiluminescent HRP substrate |
| X-ray film | Fisher | F-BX810 | for Western blot result |
| DMEM | Sigma | D6429 | for cell culture |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | for cell culture |
| penicilin-streptomycin | Sigma | P4333 | for cell culture |
| Trypsin solution | Sigma | T4049 | for cell culture |
| PBS for tissue culture | Sigma | D8662 | for cell culture |
| recombinant TNF | made in our lab | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| smac-mimetic | gift from Dr. Xiaodong Wang | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| ZVAD-FMK | ApexBio | A1902 | for inducing necroptosis. See reference 11. |
| Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Model TC20; for counting cells |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | for measuring protein concentration in cell lysates |
| Cell lifter | Fisher | 07-200-364 | to remove cells from dish |
| Lysis Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired) |
||
| 10X TAE (1 L) | 48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L |
||
| 4X SDD-AGE loading buffer (50 mL) | 5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O |
||
| TBS Transfer Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O |
||
| PBST Wash Buffer (1 L) | 100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20 |
||
| 10X PBS (10 L) | 800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L |
References
- Ross, C. A., Poirier, M. A.
- Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
- Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
- Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).
- Uptain, S. M., Lindquist, S. Prions as protein-based genetic elements. Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. , (2008).
- Sipe, J. D., et al. Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis. Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).
- Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level. Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).
- Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. Methods in Enzymology. 412, Academic Press. 33-48 (2006).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137, 1100-1111 (2009).
