Summary
ここでは、異機種混在サイズのアミロイド様線維の存在を確認し、ゲルの中にアミロイド線維の解離によるサイズの不均一性がある可能性を除外する二次元半変化 agarose のゲルの電気泳動を使用します。実行中のプロセス。
Abstract
アミロイドやアミロイド様線維は多くの人間の病気に関連付けられている、今多くのシグナル伝達経路の重要であることが発見されています。様々 な実験条件下でのこれらの繊維の形成を容易に検出する機能は潜在的な機能を理解するために不可欠です。多くの方法は、繊維を検出するために使用されているいくつかの欠点がないわけで。たとえば、電子顕微鏡検査 (EM) やコンゴーレッドまたは Thioflavin T にしばしば染色繊維の精製が必要です。その一方で、半変化洗剤アガロース電気泳動 (SDD-年齢) は精製することがなく細胞抽出液の SDS 耐性のアミロイド様線維の検出をことができます。さらに、それは繊維の大きさの違いの比較をことができます。もっと重大に、それは西部にしみが付くことによって繊維内の特定の蛋白質を識別するために使用できます。時間がかかるであり、ラボの広い数をより簡単にアクセスできます。SDD 時代結果しばしば不均質性が変化します。それはタンパク質の SDS 存在下での電気泳動の中に複合体の解離に起因する不均一性の一部であるかどうか質問を上げます。このため、我々 は SDD 時代の SDD 時代に見られるサイズの不均一性が真に繊維不均質体内の結果、劣化または中にタンパク質のいくつかの解離の結果ではないかどうかの 2 番目の次元を採用しています。電気泳動。このメソッドは、SDD 時代プロセス中にアミロイドやアミロイド様線維が部分的に解離しない高速、定性の確認できます。
Introduction
1アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの病態に関与するタンパク質のミスフォールディングによるアミロイド繊維の形成を知られている長い。最近では、アミロイドやアミロイド様線維形成が抗ウイルス自然免疫応答2ネクロトーシス3,4中を含む人間と低い有機体のシグナル伝達経路の一部であると示されています。酵母5,6などしたがって、実験室でこれらの繊維を検出する機能は重要です。現在、アミロイドとアミロイド様線維を検出する 3 つの主な方法があります: 染料、EM、および SDD 時代の使用。
コンゴ赤や Thioflavin T などの染料の使用では、急速な顕微鏡、分光法7を使用して容易に検出できるという利点を提供しています。しかし、コンゴ赤の場合、顕微鏡による検出には、繊維、または繊維のサイズを構成するタンパク質の特異性は提供しません。同様に、コンゴ赤または Thioflavin T のバインディングを蛋白質の複合体を検出する分光学の使用は、正または負の結果のみを提供します。
EM は、繊維と繊維の長さと直径の8について定量的な情報の存在の決定的な証拠を提供します。ただし、この方法では、非常に厳格な浄化が必要です。さらに、EM は高価な機器を使用する特殊な技術です。
SDD 時代は、SDS 耐性メガ ダルトン タンパク質やアミロイドのようなアミロイド繊維を含むを検出するために使用されています。多くの利点を提供しています。最初に、それは繊維の精製を必要としないし、peform9に簡単です。第二に、それは相対的なサイズおよび繊維の heterogenicity の量を含む繊維のサイズに関する定性的情報を提供します。ウェスタンブロッティングは、電気泳動後実行できます、ために、最後に、それは、SDD 時代は半変化、いくつかのエピトープが隠されたままにするそれに注意する必要がありますを任意のタンパク質、抗体がある存在を検出する簡単です抗体による検出を複雑になります。
最近では、受容体相互作用タンパク質キナーゼ 1 (RIPK1) と 3 (RIPK3) は、ネクロトーシス、壊死3のプログラムのフォームの間にプラットフォームをシグナルとして機能するフォーム アミロイド線維に報告されています。これらの繊維を勉強しながら私たちの研究室は、リネージュ キナーゼ ドメインのような (MLKL) を混合、別のネクロトーシス関連蛋白質がまた4アミロイド様線維を形成を示した。しかし、SDD の年齢を調べると、MLKL 繊維のサイズ登場登場お互い (図 1) と同じ RIPK1 と RIPK3 の繊維とは異なる。MLKL RIPK1/RIPK3 にバインド ネクロトーシス シグナリング複合 necrosome10と呼ばれる形成して知られているのでこれは予想外だった。
少なくとも 2 つの説明があります。最初に、2 つのまったく異なるアミロイドのような繊維がネクロトーシス、1 つ含む RIPK1/RIPK3 およびその他の含まれている MLKL の中にフォームがあります。第二に、含む RIPK1/RIPK3/MLKL 可能性がありますネクロトーシス、MLKL 協会他の蛋白質との間に形成されるアミロイド様線維の 1 種類のみですそれは SDD 時代の間に電離する十分に弱いです。
これに対処するため二次元 (2 D) SDD 時代を実行することを提案します。SDD 時代安定アミロイドやアミロイド様線維は最初と 2 番目のディメンションの電気泳動中に同じの移行パターンをあります。膜へのタンパク質の転送、西部のしみの実施後、これは検出可能になります。安定した繊維は、シャープな斜めパターンを展示いたします。これからの逸脱は、繊維が SDS 電気泳動による変化を受けることを示唆するでしょう。
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Protocol
1. 試料を準備します。
- 2 x 10 の文化6アミロイド 10 ml のダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清とペニシリン-ストレプトマイシンを含む 10 cm 培養皿に HT 29 大腸がん細胞を生産します。培養細胞は、5% CO2と 37 ° C のインキュベーターで一晩します。
- セルは、80% の confluency に成長後は、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 ml セルを洗浄しています。トリプシン溶液 3 mL を追加し、3 分の 37 ° C で孵化させなさい。
- セルはお皿から完全解離後培地 10 mL を追加し、15 mL の円錐管に 10 mL のピペットで細胞を転送します。室温で 3 分間 1,000 x g で細胞を遠心します。培地を吸引を 5 mL の培地、細胞を再懸濁します、携帯カウンターを使用してセルをカウントします。それぞれ 2 つの 10 cm 料理のプレート 2 x 106セルです。
- 細胞が接着し、5% CO2と 37 ° C のインキュベーターで一晩回復を許可します。一皿 20 ng/ml の腫瘍壊死因子-α (TNF-α)、100 nM Smac 擬態と 20 μ M 汎カスパーゼ阻害剤 Z VAD FMK11アミロイドの形成を誘導するために治療を適用します。組み合わせはチーリンと省略されます。コントロールとして車両と他の料理を扱います。
- 適切な期間後 6 h 通常細胞ライセートの収穫します。
- プラスチックのスクレーパーとプレートから細胞をこすり、15 mL の円錐管に 10 mL のピペットを使用します。4 ° C で 3 分間 1,000 x g で細胞を遠心分離します。
- 10 mL の氷冷 PBS に再、4 ° C で 3 分間 1,000 × g で遠心分離によってセルを洗浄して 2 回PBS ソリューションを吸い出しなさい。
注: プロセスをここで休止して細胞ペレットを液体窒素で凍結し、˗80 ° C で 1 ヶ月保存できます。 - 1.5 mL 遠心チューブに細胞ペレットを転送し、0.3 mL の氷の上で 30 分間溶解バッファーで孵化させなさい。4 ° C で 15 分間 20,000 × g で遠心します。上清は全細胞ライセートです。
注: プロセスは、-20 ° c で数ヶ月にサンプルを格納することによってここで休止できます。 - 製造元のプロトコルに従ってブラッドフォードの試金蛋白質濃度を測定します。4 x 20 μ 3 μ g/μ L のサンプルを準備し、10 分間室温でインキュベート SDD 時代読み込みバッファーを追加します。
2. 準備し、ゲルを実行
- 寒天 2 g を 200 mL のガラス製ビーカーで agarose を溶かし、電子レンジで加熱 1 x トリス酢酸バッファー (TAE) に追加します。最終濃度 0.1 %sds の 20 %sds の 1 mL を追加します。慎重に混合旋回します。SDS 添加後泡を生成しないように注意してください。
- 15 cm × 14 cm ゲル平板にアガロース溶液を注ぐ。1 mL ピペットを使用して任意の気泡を除去します。1 つの 20 も櫛を上部に配置します。
- まず寸法: ピペット 60 μ g の全細胞ライセート一番右車線で。(染料のフロントはゲルを通って約 ¾) まで約 4 時間 60 V でゲルを実行実行バッファーとして 0.1 %sds を含む TAE を使用します。
- 2 番目の寸法: 慎重回転させるとゲル 90 ° 反時計回り (図 2A)。約 4 時間の 60 V でゲルを実行します。
注: 一般的な走行条件は 4 V/cm のゲルの長さです。実行条件が最初と 2 番目のディメンションの同じであることが重要です。
3. 転送
- ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 二フッ化膜 (図 2B) に蛋白質を転送するための毛管転送メソッドを使用します。
- 転送バッファーの 500 の mL を追加し、約 20 cm × 20 cm のコンテナー。コンテナーの横にあるペーパー タオルの 5 cm 高スタックを確認します。スタックの先頭の表面積は、ゲルの大きさよりも大きくなければなりません。
- 転送バッファーの 14 cm x 15 cm のフィルター ペーパーを浸し、紙タオルのスタック上に配置。しわや気泡がない紙の上に注意してください。フィルター紙の別の部分でを繰り返します。
- 30 のメタノールで 14 cm x 15 cm PVDF 膜をアクティブに s は、ローラーを使用して、すべてのバブルを削除する世話ろ紙上にレイヤーします。転送バッファーでゲルを洗い流すし、再び任意の気泡をロールアウト、膜上にレイヤーします。
- プラスチック製のラップと転送バッファーのコンテナーに最も近いペーパー タオルの端をカバーします。ペーパー タオルのスタックとの直接接触に次の手順で紙の鉄橋が来ないことが重要です。
- 転送バッファーの 15 cm × 35 cm フィルター紙を浸漬し、一端がゲルの上をカバーしてもう一方の端は、転送バッファーのコンテナー内に配置します。別の橋を繰り返します。
- プラスチック製のラップのコンテナーをカバーし、室温で一晩おきます。
4. ウエスタンブロット検出
- 0.05% を含む PBS の 50 mL の膜を洗浄トゥイーン 20 (pbst;) 20 cm × 20 cm のコンテナー。PBST で 5% ミルク 20 mL を追加します。ブロックを 30 分間室温でロック。
- PBST で 5% ミルク 20 mL にウサギ抗 MLKL 抗体の 10 μ L をピペットし、コンテナーに追加します。4 ° C で一晩ロッカーでインキュベートします。
- 5 分繰り返し 5 回 20 ml PBST の膜を洗浄します。
- Pbst; 5% ミルク 20 mL に抗うさぎ HRP の 4 μ L をピペットし、コンテナーに追加します。ロッカー 2 時間室温で孵化させなさい。
- 5 分繰り返し 5 回 20 ml PBST の膜を洗浄します。
- 基板化学発光 (ECL) を追加し、製造元のプロトコルによると x 線フィルムを公開します。
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Representative Results
ネクロトーシス誘導後 RIPK1 と RIPK3 は、ほぼ同一のアミロイドのようなパターン (レーン 2、4、図 1) を示した。しかし、MLKL 繊維はより均一であった、RIPK1/RIPK3 繊維 (レーン 6、図 1) よりも小さくなるように見えた。求め、私たちは MLKL フォーム RIPK1/RIPK3 に依存しない繊維または MLKL を単に SDD 時代に大規模な RIPK1/RIPK3/MLKL 繊維から分離するかどうか、可能性に対処するため 2次元 SDD 時代手法を開発します。
電気泳動および転送プロシージャの一般的な回路図を図 2に示します。SDD 時代最初の次元の中にアミロイドやアミロイド様線維を図 3Aに見られるように特性の塗抹標本を展示いたします。SDD 時代の 2 番目のディメンションを実行時に 2 つの可能な結果があります。ないの劣化またはゲルのプロセスを実行中に解離の場合繊維が移行されます同じ 2 番目の実行中に最初の実行の場合と同様。この例では、西部のしみは図 3Bに見られるように 45 ° の角度で膜上の斜線パターンを展示いたします。繊維は、SDD 時代プロセス中に分離する小さい繊維が第 2 電気泳動の間に高速に移行します。この場合、西部のしみは、図 3Cに示すように、斜めの線の下の垂直ストリー キングを展示いたします。
ネクロトーシス中に見られる MLKL 繊維、場合彼らは SDD 時代 (図 4A) の最初の次元の中に特性の塗抹標本が表示されます。それらの同じ繊維は 2D SDD 時代にさらされた、彼らはない垂直光線 (図 4B) シャープな斜めラインを展示しました。この証拠で、MLKL は SDD 時代プロセス中にない解離繊維と図 1に示す MLKL 含有繊維が RIPK1/RIPK3 繊維から確かに異なると考えられました。さらに、RIPK3 はセル lysates から免疫枯渇したとき MLKL 繊維に残ったそのまま4MLKL、RIPK1/RIPK3 繊維確かに別個の主体であることを確認します。
図 1.ネクロトーシス中のアミロイド様線維検討します。全体のセル lysates は TNF 誘導ネクロトーシスになる細胞から収穫され、SDD 時代を受けます。西部のしみは、RIPK1、RIPK3、MLKL に行った。MLKL 含有繊維は、RIPK1/RIPK3 含有繊維から明確な移行パターンを展示しました。MLKL モノマーがこの条件の下で見えないです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.実験的プロトコル。(A) 二次元半変化洗剤 agarose ゲル電気泳動 (2 D SDD 時代) の模式図。右ほとんどの車線、赤ラベルのサンプルをロードすることによって開始します。最初のディメンションの実行が終了した後、ゲル 90 ° 反時計回りを回転します。2 番目の次元電気泳動を実行します。実線の矢印は、実行最初の次元の方向を示す、点線の矢印は、実行 2 番目の次元の方向を示します。(B) 毛管作用によって転送のスキーマです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.結果。SDD 時代の最初のディメンションの後アミロイドやアミロイド様線維の (A) 予想される移行パターン。実線の矢印は、移動の方向を示します。(B) 予想される移行パターンの SDD 時代安定 (劣化または解離) アミロイドや 2D SDD 時代後アミロイド様線維。実線の矢印は、SDD 時代の最初の次元の方向を示します。点線の矢印は、SDD 時代の 2 番目の次元の方向を示します。(C) 非 SDD 時代-安定したアミロイドやアミロイド様線維の予想される移行パターン。実線の矢印は、SDD 時代の最初の次元の方向を示します。点線の矢印は、SDD 時代の 2 番目の次元の方向を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。1 D および 2 D の SDD 時代の間に移行の MLKL 含有繊維します。(A) 全体のセル lysates はチーリン ネクロトーシスに受ける刺激から収穫されました。Lysates は SDD 時代に, MLKL の西部のしみを行いました。特徴的な塗抹標本が観察されました。(B) 全体のセル lysates はチーリン ネクロトーシスに受ける刺激から収穫されました。Lysates は 2D SDD 時代に, MLKL の西部のしみを行いました。45 ° の角度でシャープなラインを認めた、繊維に SDD 時代の間に解離が行われていないことを示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
2 D の SDD 時代の最も重要な側面は、電気泳動条件が最初と 2 番目のディメンションの同じであることです。45 ° (解離や劣化が発生しなかったことを示す) でシャープな斜めラインによって異なります両方中に同じ方法で移行する繊維を検出する能力は electrophoreses します。電圧または実行時間の長さを変更するなど、さまざまな条件を使用して、これらの結果があいまいされます。また、従来の 1 次元の場合と同様 SDD 時代、サンプルを沸騰避けるべきである、これはアミロイドとアミロイド様線維が中断されますと。すべての転送として、フィルター ペーパー、膜およびゲルの層間泡を避けるために注意が必要があります。最後に、転送処理中にブリッジしないドループし、ペーパー タオル スタックに直接問い合わせが重要です。信頼性の高い方法これを防ぐためには、ペーパー タオルの端をカバーするプラスチック製のラップの小片を使用することです。
プロトコル (60 V 4 時間) で提供される実行条件を調整可能性があります。たとえば、このプロトコルでは agarose のゲルは 14 cm x 15 cm だった。小さいゲルを使用する場合電圧 (4 V/cm のゲルの長さ) と実行時比率に応じて調整する必要があります。2 つのサンプルは、ゲルを準備するときに 2 つの櫛を使用して一度に分析する可能性があります。サンプルは、各櫛のために最もよく右に読み込む必要があります。この場合、上のサンプルが実行されないように、底にゲルの半分は、ランタイムを再び縮められねばなりません。ゲルの 1 つの次元の時間を調整する場合、他の寸法が一致するように調整が重要です。
SDS-PAGE と対照をなして 1 D および 2 D の SDD 時代が半変化です。繊維がそのまま残っているのでいくつかのエピトープはアクセスできません可能性があります。これは、いくつかの抗体による検出を制限があります。2D SDD 時代は、アミロイドやアミロイド様線維の正確なサイズを決定する能力に制限されます。しかし、相対的なサイズ比較を行うことがあります。
すべての蛋白質の複合体は、解離や SDD 時代劣化、定性的な結果を解釈することは困難かもしれないので。2 d 使用 SDD 時代は SDD 時代の間に見られるサイズの不均一性は、電気泳動中に SDS 依存性解離原因確認を許可します。2D SDD 時代は伝統的な 1 D SDD 時代が使用される任意のコンテキストで使用する適切です。2D SDD 時代は、1 D SDD 時代のサイズの不均一性が観察されるときに便利です。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この作品の交わりに支えられて s. h. a.NIH/NCATS (TL1TR001104) からウェルチ財団 (I-1827) を与えるし、Z.W. Z.W. に日の出 (RGM120502A) から R01 グラントはテキサス州学者の研究所 (R1222) やがん予防医学研究のバージニア マーチソン リンシカム学者。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gel electrophoresis unit | Fisher | HE99XPRO | appratus for gel running. |
| agrose | VWR | 97062-250 | For agarose gel. |
| paper tower | Fisher | 19-120-2484 | for transfering |
| filter paper | VWR | 21427-386 | for transfering |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | for transfering |
| blocking milk powder | Bio-Rad | 1706404XTU | for blocking in Western blot |
| MLKL antibody | Genetex | GTX107538 | rabbit anti-MLKL antibody |
| RIPK1 antibody | BD Biosciences | 610459 | mouse anti-RIPK1 antibody |
| RIPK3 antibody | gift from Dr. Xiaodong Wang | rabbit anti-RIPK3. See refenence 11. | |
| anti-Rabbit-HRP | Sigma | A6154 | secondary antibody |
| ECL | Fisher | WBKLS0500 | Western chemiluminescent HRP substrate |
| X-ray film | Fisher | F-BX810 | for Western blot result |
| DMEM | Sigma | D6429 | for cell culture |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | for cell culture |
| penicilin-streptomycin | Sigma | P4333 | for cell culture |
| Trypsin solution | Sigma | T4049 | for cell culture |
| PBS for tissue culture | Sigma | D8662 | for cell culture |
| recombinant TNF | made in our lab | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| smac-mimetic | gift from Dr. Xiaodong Wang | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| ZVAD-FMK | ApexBio | A1902 | for inducing necroptosis. See reference 11. |
| Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Model TC20; for counting cells |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | for measuring protein concentration in cell lysates |
| Cell lifter | Fisher | 07-200-364 | to remove cells from dish |
| Lysis Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired) |
||
| 10X TAE (1 L) | 48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L |
||
| 4X SDD-AGE loading buffer (50 mL) | 5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O |
||
| TBS Transfer Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O |
||
| PBST Wash Buffer (1 L) | 100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20 |
||
| 10X PBS (10 L) | 800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L |
References
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