Summary
Her bruker vi todimensjonal semi denaturing agarose gel geleelektroforese å bekrefte tilstedeværelse av amyloid-lignende fiber av heterogene størrelse og utelukke muligheten for at størrelse heterogenitet skyldes dissosiasjon av amyloid fibrene under gel prosess.
Abstract
Amyloid eller amyloid-lignende fiber har vært forbundet med mange menneskelige sykdommer, og nå blir oppdaget å være viktig for mange signalveier. Evnen å lett oppdage dannelsen av disse fiber under ulike eksperimentelle forhold er avgjørende for å forstå deres potensielle funksjon. Mange metoder brukes til å oppdage fibrene, men ikke uten noen ulemper. Elektronmikroskop (EM) eller flekker med Kongo rød eller Thioflavin T ofte krever for eksempel rensing av fibrene. På den annen side, tillater semi denaturing vaskemiddel agarose gel geleelektroforese (SDD-alder) påvisning av SDS bestandig amyloid-lignende fiber i cellen ekstrakter uten rensing. I tillegg kan det sammenligning av størrelsen forskjellen av fibrene. Enda viktigere, kan den brukes til å identifisere spesifikke proteiner i fiber av vestlige blotting. Det er mindre tidkrevende og lettere tilgjengelig for et større antall labs. SDD-alder resultater viser ofte variabel graden av heterogenitet. Det reiser spørsmål om en del av heterogenitet resultat av protein kompleks under geleelektroforese i nærvær av SDS. Derfor har vi brukt en andre dimensjonen av SDD-alder for å avgjøre om den størrelse heterogenitet sett i SDD-alder er virkelig et resultat av fiber heterogenitet i vivo og ikke et resultat av nedbrytning eller av noen av proteiner under geleelektroforese. Denne metoden gir rask, kvalitativ bekreftelse på at amyloid eller amyloid-lignende fiber ikke er delvis dissociating under av SDD-alder.
Introduction
Dannelsen av amyloid fiber på grunn av protein misfolding har lenge vært kjent å spille en rolle i patologisk forhold som Alzheimers og Parkinsons sykdom Huntingtons sykdom1. Nylig har dannelsen av amyloid eller amyloid-lignende fiber vist seg å være en del av signalveier mennesker, inkludert anti-viral medfødte immunforsvaret2 og necroptosis3,4, og lavere organismer som gjær5,6. Derfor er muligheten til å oppdage disse fibrene i laboratoriet viktig. Foreløpig det er tre hovedmåter å oppdage amyloid og amyloid-lignende fiber: bruk av fargestoffer, EM og SDD-alder.
Bruk av fargestoffer, som Kongo rød eller Thioflavin T, tilbyr fordelen av å rask og lett synlig bruker mikroskopi eller spektroskopi7. Oppdagelsen av mikroskopi, ved Kongo rød, gir imidlertid ingen spesifisitet som proteiner utgjør fiber eller størrelsen på fiber. Tilsvarende gir bruk av spektroskopi å oppdage Kongo rød eller Thioflavin T binding til protein komplekser bare et positivt eller negativt resultat.
EM gir bevis for tilstedeværelsen av fiber og kvantitativ informasjon om fiber lengde og diameter8. Denne metoden krever imidlertid svært strenge rensing. I tillegg er EM en spesialisert teknikk som bruker dyrt utstyr.
SDD-alder har blitt brukt til å oppdage SDS bestandig mega Dalton protein komplekser inkludert amyloid eller amyloid-lignende fiber. Det gir mange fordeler. Først det krever ikke rensing av fiber og er lett å peform9. For det andre gir kvalitativ informasjon om størrelsen av fiber, inkludert relative størrelsen og mengde fiber heterogenicity. Til slutt, fordi vestlige blotting kan utføres etter geleelektroforese, er det lett å oppdage tilstedeværelsen av et protein som finnes et antistoff, selv om det bør bemerkes at ettersom SDD-alder semi denaturing, noen epitopes kan forbli skjult som kompliserer påvisning av antistoff.
Nylig reseptor samspill protein kinase 1 (RIPK1) og 3 (RIPK3) har blitt rapportert til skjemaet amyloid fibre som signaliserer plattformer under necroptosis, en programmert form for nekrose3. Mens han studerte disse fiber, viste vår lab at en annen necroptosis-assosiert protein, blandet herkomst kinase domene-lignende (MLKL), også dannet amyloid-lignende fiber4. Imidlertid ved undersøkelse med SDD-alder var størrelsen på MLKL fibrene forskjellig fra RIPK1 og RIPK3 fiber, som dukket opp identiske med hverandre (figur 1). Dette var uventet fordi det er kjent at MLKL binder til RIPK1/RIPK3 å danne necroptosis signalene kompleks kalt necrosome10.
Det er minst to forklaringer. Først to helt forskjellige amyloid-lignende fiber kan danne under necroptosis, én med RIPK1/RIPK3 og den andre som inneholder MLKL. Andre er bare én type amyloid-lignende fiber med RIPK1/RIPK3/MLKL kan dannes under necroptosis, men association of MLKL med andre proteiner svak nok som det dissosierer under SDD-alder.
For å løse dette, foreslår vi utfører en todimensjonal (2D) SDD-alder. SDD-år-stabile amyloid eller amyloid-lignende fiber vil ha samme migrasjon mønster under første og andre dimensjon-geleelektroforese. Dette vil være synlig etter overføring proteiner til en membran og gjennomføre en Western blot. Stabil fiber har en skarp skrå. Eventuelle avvik fra dette foreslår at fibrene gjennomgå endringer på grunn av SDS-geleelektroforese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargjør prøver
- Kultur 2 x 106 amyloid produsere HT-29 tykktarmskreft celler i 10 cm vev kultur parabol i 10 mL av Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) som inneholder 10% fosterets bovin serum og penicillin-streptomycin. Kultur celler over natten i en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
- Når cellene vokse til 80% confluency, vask cellene med 10 mL fosfat-bufret saltoppløsning (PBS). Legg 3 mL Trypsin løsning og ruge ved 37 ° C i 3 minutter.
- Når cellene er helt avstand fra parabolen, legge 10 mL av kultur medium og overføre cellene med en 10-mL pipette slik 15-mL konisk. Sentrifuge cellene på 1000 x g for 3 min ved romtemperatur. Sug opp mediet resuspend cellene i 5 mL av kultur medium og telle celler ved hjelp av en celle teller. Plate 2 x 106 celler i hver to 10 cm retter.
- At cellene å overholde og gjenopprette over natten i en 37 ° C inkubator med 5% CO2. Gjelde en rett å indusere dannelsen av amyloids med 20 ng/mL Tumor nekrose faktor-alfa (TNF-α), 100 nM Smac-mimetic og 20 µM pan-caspase hemmer Z-VAD-FMK11behandling. Kombinasjonen er forkortet til TSZ. Behandle andre parabolen med kjøretøy som en kontroll.
- Etter passende tidsrom, vanligvis 6 h og høste cellen lysate.
- Skrap cellene av platen med en plastskrapen og bruke en 10-mL pipette overføre til et 15-mL konisk rør. Sentrifuge cellene på 1000 x g i 3 minutter på 4 ° C.
- Vask cellene 2 ganger av resuspending i 10 mL av is kaldt PBS og sentrifugering 1000 x g i 3 minutter på 4 ° C. Sug opp PBS løsningen.
Merk: Prosessen kan pauses her ved frysing celle pellet i flytende nitrogen og lagre på ˗80 ° C i opptil 1 måned. - Overføre celle pellet slik 1.5-mL microcentrifuge og ruge i 0,3 mL lyseringsbuffer i 30 min på is. Sentrifuger 20.000 x g i 15 min på 4 ° C. Nedbryting er hele cellen lysate.
Merk: Prosessen kan pauses her ved å lagre prøven på-20 ° C i opptil flere måneder. - Måle protein konsentrasjonen av en Bradford analysen i henhold til produsentens protokollen. Legge til 4 x SDD-alder lasting buffer å forberede 20 µL av 3 µg/µL prøve og ruge ved romtemperatur for 10 min.
2. Forbered og kjøre Gels
- Legge til 2 g agarose 200 mL 1 x Tris-acetate buffer (TAE) i et glass kanne og varme i mikrobølgeovn til å smelte agarose. Legg 1 mL av 20% SDS for en siste konsentrasjon av 0,1% SDS. Nøye virvel for å blande. Ta vare ikke for å generere bobler etter at SDS.
- Hell agarose løsningen i en 15 cm x 14 cm gel skive. Bruk en 1-mL pipette for å eliminere bobler. Plass én 20-vel kam øverst.
- Første dimensjon: Pipette 60 µg hele cellen lysate i langt høyre kjørefelt. Kjøre gel på 60 V ca 4 h (inntil fargestoff foran er om lag ¾ gjennom gel) bruker TAE med 0,1% SDS som kjører bufferen.
- Andre dimensjon: nøye rotere gel 90° mot urviseren (figur 2A). Kjøre gel på 60 V ca 4 h.
Merk: Generelle kjører tilstand er 4 V/cm gel lengde. Det er viktig at kjører betingelser er nøyaktig den samme for de første og andre dimensjonene.
3. Overfør
- Bruke overføringsmetoden kapillær til å overføre proteiner til en polyvinylidene difluoride (PVDF) membran (figur 2B).
- Legge til 500 mL overføring buffer en ca 20 cm x 20 cm beholder. Gjøre en 5 cm høy stabel papirhåndklær ved siden av beholderen. Arealet av toppen av stakken må være større enn gel.
- Nyt en 14 cm x 15 cm filterpapir i overføring buffer og plasser på håndkle papirbunken. Pass på å plassere på papiret uten rynker eller bobler. Gjenta med et stykke filter papir.
- Aktivere en 14 cm x 15 cm PVDF membran i metanol for 30 s deretter lag på filter papir å ta vare for å bruk en roller for å fjerne alle bobler. Skyll gel med overføring buffer og lag over membranen, igjen introduserer bobler.
- Dekke kanten av papirhåndklær nærmest av overføring buffer med plast brytes. Det er viktig at papir broen bygget i det neste trinnet ikke kommer i direkte kontakt med håndkle papirbunken.
- Nyt 15 cm x 35 cm filter papir i overføring buffer og plasser den så ene dekker toppen av gel og den andre enden er i beholderen overføring bufferen. Gjenta med en annen bru.
- Dekk beholderen med plast brytes og la over natten i romtemperatur.
4. Western Blotting gjenkjenning
- Skyll membranen med 50 mL PBS 0,05 prosent Tween-20 (PBST) i en 20 cm x 20 cm beholder. Legge til 20 mL 5% melk i PBST. Rock ved romtemperatur for 30 min å blokkere.
- Pipetter 10 µL kanin anti-MLKL antistoff i 20 mL 5% melk i PBST og legge til beholderen. Ruge på rocker overnatting på 4 ° C.
- Vask membranen i 20 mL PBST for 5 min. Gjenta 5 ganger.
- Pipetter 4 µL av anti-rabbit-HRP til 20 mL av 5% melk i PBST og legge til beholderen. Ruge på rocker ved romtemperatur for 2T.
- Vask membranen i 20 mL PBST for 5 min. Gjenta 5 ganger.
- Legg forbedret chemiluminescence substrat (ECL) og utsette for X-ray filmer i henhold til produsentens protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter necroptosis induksjon viste RIPK1 og RIPK3 nesten identisk amyloid-lignende mønstre (baner 2 og 4 figur 1). Men MLKL fiber ble stadig mer uensartet og syntes å være mindre enn RIPK1/RIPK3 fiber (lane 6 figur 1). Det bedt oss å utvikle 2D SDD-alder metoden for å håndtere muligheten MLKL danner RIPK1 og RIPK3-uavhengig fiber eller MLKL bare dissociates fra store RIPK1/RIPK3/MLKL fiber under SDD-alder.
En generell skjematisk av geleelektroforese og overføre prosedyren er vist i figur 2. Under den første dimensjonen SDD-alder har amyloid eller amyloid-lignende fiber en karakteristisk smøre, som vist i Figur 3A. På running den andre dimensjonen SDD-alder, er det to mulige resultater. Hvis ingen degradering eller avstandtagen under gel running forarbeide, vil fiber overføre identisk under andre kjøre som de gjorde under første kjøring. I dette tilfellet har en Western blot en skrå membranen i 45° vinkel som vist i Figur 3B. Hvis fibrene distansere under av SDD-alder, vil mindre fibrene overføre raskere under den andre geleelektroforese. I dette tilfellet har en Western blot loddrette striper under den diagonale linjen, som vist på Figur 3C.
Ved MLKL fibrene under necroptosis, viser de karakteristiske smear under den første dimensjonen SDD-alder (Figur 4A). Når de samme fibrene ble utsatt for 2D SDD-alder, viser de en skarp diagonal linje med ingen loddrette streker (Figur 4B). Med denne bevis, det ble konkludert med at MLKL ikke var dissociating fra papirfibrene under SDD-alder prosessen og at MLKL inneholder fibrene i figur 1 var faktisk atskilt fra RIPK1/RIPK3 fibrene. Videre, da RIPK3 var immuno-utarmet fra celle lysates, MLKL fiber forble intakt4, bekrefter at MLKL fiber og RIPK1/RIPK3 fiber er faktisk forskjellige enheter.
Figur 1 . Undersøkelse av amyloid-lignende fiber under necroptosis. Hele cellen lysates ble høstet fra cellene gjennomgår TNF-indusert necroptosis og utsatt for SDD-alder. Vestlige blots ble utført for RIPK1, RIPK3 og MLKL. MLKL inneholder fibrene utstilt et distinkt migrasjon mønster RIPK1/RIPK3-som inneholder fibrene. MLKL monomer er knapt synlig under denne tilstanden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Eksperimentell protokollen. (A) skjematisk av todimensjonal semi denaturing vaskemiddel agarose gel geleelektroforese (2D SDD-alder). Begynn med lasting prøven i høyre de fleste kjørefelt, merket i rødt. Etter opphør av første dimensjon kjøring, rotere gel 90° mot klokka. Kjør den andre dimensjonen geleelektroforese. Heltrukken pil angir den første dimensjonen kjøre, prikket pil angir den andre dimensjonen kjøre. (B) skjema for overføring av kapillær handling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Mulige resultater. (A) den forventede migreringen mønster av amyloid eller amyloid-lignende fiber etter den første dimensjonen av SDD-alder. Heltrukken pil angir retningen for overføringen. (B) forventede migrering mønster av SDD-alder-stabilt (uten degradering eller avstandtagen) amyloid eller amyloid-lignende fiber etter 2D SDD-alder. Heltrukken pil angir den første dimensjonen SDD-alder. Stiplet pil angir den andre dimensjonen SDD-alder. (C) forventede migrering mønsteret av ingen-SDD-år-stabile amyloid eller amyloid-lignende fiber. Heltrukken pil angir den første dimensjonen SDD-alder. Stiplet pil angir den andre dimensjonen SDD-alder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Overføring av MLKL som inneholder fibre under 1D og 2D SDD-alder. (A) hele cellen lysates ble høstet fra celler stimulert med TSZ å gjennomgå necroptosis. Lysates ble utsatt for SDD-AGE, og en Western blot ble utført for MLKL. En karakteristisk smøre ble observert. (B) hele cellen lysates ble høstet fra celler stimulert med TSZ å gjennomgå necroptosis. Lysates ble utsatt for 2D SDD-alder og en Western blot ble utført for MLKL. En skarp linje i 45° vinkel ble observert, indikerer at fibrene ikke gjennomgår dissosiasjon under SDD-alder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det viktigste aspektet av 2D SDD-alder er at de geleelektroforese betingelsene er de samme for første og andre dimensjonen. Muligheten til å oppdage en skarp diagonal linje i 45° (indikerer at ingen dissosiasjon eller degradering oppstod) avhenger av fiber migrering i en identisk måte under begge electrophoreses. Bruke ulike forhold, for eksempel endre spenning eller hvor kjøretid vil skjule disse resultatene. Også, som er tilfellet for tradisjonelle 1D SDD-alderen, kokende prøven bør unngås, som dette vil forstyrre amyloid og amyloid-lignende fiber. Som er tilfellet for alle overføringer, bør forsiktighet utvises å unngå bobler mellom lagene i filter papir, membran og gel. Til slutt, under overføring trinn er det avgjørende at brua ikke henge ned og direkte kontakt håndkle papirbunken. En pålitelig måte å unngå dette er å bruke et lite stykke plastfolie for å dekke kanten på papirhåndklær.
Kjører vilkår protokollen (60 V 4 h) kan justeres. For eksempel i denne protokollen var agarose gel 14 cm x 15 cm. Hvis en mindre gel brukes, skal spenning (4 V/cm gel lengde) og kjøretid justeres proporsjonalt. To prøver kan analyseres på en gang ved hjelp av to kammer når forbereder gel. Prøvene skal lastes i høyre mest for hver kam. I dette tilfellet bør operasjonstiden igjen forkortes slik at toppen prøven ikke kjører i bunnen halvdelen av geléen. Hvis klokkeslettet justeres for én dimensjon av gel, er det viktig at den andre dimensjonen er justert.
I motsetning til SDS-side er både 1 D og 2D SDD-alder halvt denaturing. Fordi fibrene forblir intakt, kan noen epitopes forblir utilgjengelige. Dette kan begrense oppdagelsen av noen antistoffer. 2D SDD-alder er begrenset i sin evne til å bestemme den nøyaktige størrelsen på amyloid eller amyloid-lignende fiber. Men kan en relativ størrelse sammenligning gjøres.
Alle protein komplekser kan dissosiasjon eller degradering under SDD-alder, og så de kvalitative resultatene kan være vanskelige å tolke. Bruk av 2D SDD-alder tillater bekreftelse på at størrelse heterogenitet under SDD-alder ikke er grunn SDS-avhengige dissosiasjon under geleelektroforese. 2D SDD-alder er riktig å bruke i enhver kontekst der tradisjonelle 1 D SDD-alder brukes. 2D SDD-alder er spesielt nyttig når størrelsen heterogenitet er observert i 1 D SDD-alder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklære noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet er støttet av et fellesskap for sh-A. fra NIH/NCATS (TL1TR001104), en Welch Foundation gir (I-1827) og en R01 grant fra NIGMS (RGM120502A) å Z.W. Z.W. er Virginia Murchison Linthicum forskeren i medisinsk forskning og kreftforebygging og Research Institute av Texas Scholar (R1222).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gel electrophoresis unit | Fisher | HE99XPRO | appratus for gel running. |
| agrose | VWR | 97062-250 | For agarose gel. |
| paper tower | Fisher | 19-120-2484 | for transfering |
| filter paper | VWR | 21427-386 | for transfering |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | for transfering |
| blocking milk powder | Bio-Rad | 1706404XTU | for blocking in Western blot |
| MLKL antibody | Genetex | GTX107538 | rabbit anti-MLKL antibody |
| RIPK1 antibody | BD Biosciences | 610459 | mouse anti-RIPK1 antibody |
| RIPK3 antibody | gift from Dr. Xiaodong Wang | rabbit anti-RIPK3. See refenence 11. | |
| anti-Rabbit-HRP | Sigma | A6154 | secondary antibody |
| ECL | Fisher | WBKLS0500 | Western chemiluminescent HRP substrate |
| X-ray film | Fisher | F-BX810 | for Western blot result |
| DMEM | Sigma | D6429 | for cell culture |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | for cell culture |
| penicilin-streptomycin | Sigma | P4333 | for cell culture |
| Trypsin solution | Sigma | T4049 | for cell culture |
| PBS for tissue culture | Sigma | D8662 | for cell culture |
| recombinant TNF | made in our lab | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| smac-mimetic | gift from Dr. Xiaodong Wang | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| ZVAD-FMK | ApexBio | A1902 | for inducing necroptosis. See reference 11. |
| Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Model TC20; for counting cells |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | for measuring protein concentration in cell lysates |
| Cell lifter | Fisher | 07-200-364 | to remove cells from dish |
| Lysis Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired) |
||
| 10X TAE (1 L) | 48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L |
||
| 4X SDD-AGE loading buffer (50 mL) | 5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O |
||
| TBS Transfer Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O |
||
| PBST Wash Buffer (1 L) | 100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20 |
||
| 10X PBS (10 L) | 800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L |
References
- Ross, C. A., Poirier, M. A.
- Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
- Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
- Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).
- Uptain, S. M., Lindquist, S. Prions as protein-based genetic elements. Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. , (2008).
- Sipe, J. D., et al. Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis. Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).
- Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level. Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).
- Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. Methods in Enzymology. 412, Academic Press. 33-48 (2006).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137, 1100-1111 (2009).
