Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

दो आयामी अर्द्ध denaturing डिटर्जेंट Agarose जेल ट्रो का उपयोग Amyloid या Amyloid फाइबर की तरह आकार विविधता की पुष्टि करने के लिए

Published: April 26, 2018 doi: 10.3791/57498
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Biology, UT Southwestern Medical Center

Summary

यहां हम दो आयामी अर्द्ध denaturing agarose जेल ट्रो का उपयोग करने के लिए विषम आकार के amyloid की तरह फाइबर की उपस्थिति की पुष्टि और संभावना है कि आकार विविधता जेल के दौरान पृथक्करण फाइबर के amyloid के कारण है बाहर प्रक्रिया चल रही है ।

Abstract

Amyloid या Amyloid की तरह फाइबर कई मानव रोगों के साथ जुड़ा हुआ है, और अब कई संकेत रास्ते के लिए महत्वपूर्ण होने की खोज की जा रही है । आसानी से विभिंन प्रायोगिक शर्तों के तहत इन तंतुओं के गठन का पता लगाने की क्षमता उनके संभावित समारोह को समझने के लिए आवश्यक है । फाइबर का पता लगाने के लिए कई तरीकों का इस्तेमाल किया गया है, लेकिन बिना कुछ कमियां के नहीं । उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM), या कांगो लाल या Thioflavin टी के साथ धुंधला अक्सर फाइबर की शुद्धि की आवश्यकता है । दूसरी ओर, अर्द्ध denaturing डिटर्जेंट agarose जेल ट्रो (SDD-आयु) शुद्धि के बिना कोशिका निष्कर्षों में एसडीएस-प्रतिरोधी amyloid फाइबर का पता लगाने की अनुमति देता है । इसके अलावा, यह फाइबर के आकार के अंतर की तुलना की अनुमति देता है । इससे भी महत्वपूर्ण बात, यह पश्चिमी सोख्ता द्वारा तंतुओं के भीतर विशिष्ट प्रोटीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह कम समय लगता है और प्रयोगशालाओं की एक व्यापक संख्या के लिए और अधिक आसानी से सुलभ है । SDD-आयु परिणाम अक्सर विविधता के चर डिग्री दिखाओ । यह सवाल उठाता है कि एसडीएस की मौजूदगी में ट्रो के दौरान प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के पृथक्करण से विविधता परिणामों का हिस्सा है या नहीं. इस कारण से, हम SDD-आयु का एक दूसरा आयाम नियोजित किया है निर्धारित करने के लिए अगर आकार SDD में देखा विविधता-आयु सही मायने में vivo में फाइबर विविधता का एक परिणाम है और या तो गिरावट या कुछ के दौरान प्रोटीन के पृथक्करण का परिणाम नहीं वैद्युतकणसंचलन. इस विधि की अनुमति देता है तेज, गुणात्मक पुष्टि कि amyloid या amyloid फाइबर SDD-आयु प्रक्रिया के दौरान आंशिक रूप से dissociating नहीं हैं ।

Introduction

प्रोटीन के कारण amyloid तंतुओं का गठन लंबे समय तक इस तरह के अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग, और Huntington की बीमारी के रूप में रोग की स्थिति में एक भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है1। हाल ही में, amyloid या amyloid-फाइबर की तरह गठन विरोधी वायरल जंमजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया2 और necroptosis3,4, और कम जीवों में सहित मनुष्यों में रास्ते संकेत का एक हिस्सा हो दिखाया गया है जैसे खमीर5,6। इसलिए लैब में इन फाइबर का पता लगाने की क्षमता जरूरी है । वर्तमान में, वहां तीन मुख्य amyloid और amyloid की तरह फाइबर का पता लगाने के तरीके हैं: रंजक, EM, और SDD-उंर का उपयोग करें ।

ऐसे कांगो लाल या Thioflavin टी के रूप में रंजक का उपयोग करते हैं, तेजी से होने का लाभ प्रदान करता है और आसानी से या तो माइक्रोस्कोपी या स्पेक्ट्रोस्कोपी7का उपयोग कर पता लगाने. हालांकि, माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाने, कांगो लाल के मामले में, जो प्रोटीन फाइबर, या फाइबर का आकार शामिल के बारे में कोई विशिष्टता प्रदान करता है । इसी तरह, स्पेक्ट्रोस्कोपी के उपयोग के लिए कांगो लाल या Thioflavin टी बाध्यकारी प्रोटीन कॉंप्लेक्स का पता लगाने के लिए केवल एक सकारात्मक या नकारात्मक परिणाम प्रदान करता है ।

उंहें फाइबर की उपस्थिति के निर्णायक सबूत प्रदान करता है और यह भी तंतु की लंबाई और व्यास के बारे में मात्रात्मक जानकारी8। हालांकि, इस विधि में बहुत कड़े शुद्धिकरण की आवश्यकता है । इसके अतिरिक्त, EM एक विशेष तकनीक है जो महंगे उपकरणों का उपयोग करता है ।

SDD-आयु amyloid या amyloid जैसे तंतुओं सहित एसडीएस प्रतिरोधी मेगा डाल्टन प्रोटीन कॉम्प्लेक्स का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है । यह कई फायदे प्रदान करता है । सबसे पहले, यह फाइबर की शुद्धि की आवश्यकता नहीं है और peform करने के लिए आसान है9. दूसरा, यह फाइबर heterogenicity के सापेक्ष आकार और मात्रा सहित तंतुओं के आकार के बारे में गुणात्मक जानकारी प्रदान करता है । अंत में, क्योंकि पश्चिमी सोख्ता ट्रो के बाद प्रदर्शन किया जा सकता है, यह किसी भी प्रोटीन है जिसके लिए वहां एक एंटीबॉडी है की उपस्थिति का पता लगाने के लिए आसान है, हालांकि यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि क्योंकि SDD-आयु अर्द्ध denaturing है, कुछ epitopes छुपा रह सकता है जो एंटीबॉडी द्वारा पता लगाने पेचीदा है ।

हाल ही में, रिसेप्टर बातचीत प्रोटीन कळेनासे 1 (RIPK1) और 3 (RIPK3) necroptosis, परिगलन के एक क्रमादेशित फार्म के दौरान प्लेटफार्मों सिग्नलिंग के रूप में सेवा करने के लिए amyloid फाइबर फार्म करने के लिए सूचित किया गया है3. इन तंतुओं का अध्ययन करते हुए, हमारी प्रयोगशाला से पता चला कि एक और necroptosis-जुड़े प्रोटीन, मिश्रित वंश कळेनासे डोमेन की तरह (MLKL), भी गठन amyloid की तरह फाइबर4. हालांकि, SDD-उंर के साथ परीक्षा पर, MLKL फाइबर के आकार RIPK1 और RIPK3 फाइबर, जो एक दूसरे के समान दिखाई (चित्रा 1) से अलग दिखाई दिया. यह अप्रत्याशित था क्योंकि यह अच्छी तरह से जाना जाता है कि MLKL बांध RIPK1/RIPK3 को necroptosis संकेतन परिसर के रूप में necrosome10बुलाया ।

इसमें कम से दो स्पष्टीकरण हैं । सबसे पहले, दो पूरी तरह से अलग amyloid फाइबर necroptosis के दौरान फार्म का हो सकता है, एक युक्त RIPK1/RIPK3 और अंय MLKL युक्त । दूसरा, केवल एक प्रकार की amyloid फाइबर युक्त RIPK1/RIPK3/MLKL के दौरान necroptosis का गठन किया जा सकता है, लेकिन अंय प्रोटीन के साथ MLKL के संघ काफी कमजोर है कि यह dissociates के दौरान SDD-उंर ।

यह पता करने के लिए, हम एक दो आयामी (2d) SDD उंर प्रदर्शन का प्रस्ताव । SDD-आयु-स्थिर amyloid या amyloid-जैसे तंतुओं का पहला और दूसरा आयाम ट्रो के दौरान ही माइग्रेशन पैटर्न होगा. यह एक झिल्ली को प्रोटीन स्थानांतरित करने और एक पश्चिमी दाग बाहर ले जाने के बाद detectable हो जाएगा । स्थिर फाइबर एक तेज तिरछी पैटर्न का प्रदर्शन करेंगे । इस से कोई विचलन सुझाव है कि तंतुओं एसडीएस-ट्रो के कारण परिवर्तन से गुजरना होगा ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. नमूनों को तैयार

  1. संस्कृति 2 एक्स 106 amyloid उत्पादन एचटी-29 Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और पेनिसिलिन-streptomycin युक्त के 10 मिलीलीटर में एक 10 सेमी ऊतक संस्कृति डिश में बृहदांत्र कैंसर कोशिकाओं । संस्कृति 5% CO2के साथ एक ३७ ° c मशीन में रातोंरात कोशिकाओं ।
    1. के बाद कोशिकाओं को ८०% को प्रभावित करने के लिए विकसित, फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें । 3 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर Trypsin समाधान और मशीन के 3 मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. इसके बाद कोशिकाएं डिश से पूरी तरह से असंबद्ध हैं, 10 एमएल कल्चरल मीडियम को जोड़ती हैं और 10 एमएल वाले पिपेट के साथ कोशिकाओं को 15 एमएल वाले शंकु ट्यूब पर ट्रांसफर कर जाती हैं । कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए १,००० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक । मध्यम महाप्राण, संस्कृति माध्यम के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं reसस्पेंड, और एक सेल काउंटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गिनती । प्लेट 2 एक्स 106 कोशिकाओं में से प्रत्येक में २ १०-मुख्यमंत्री व्यंजन ।
    3. कोशिकाओं का पालन करें और 5% CO2के साथ एक ३७ ° c मशीन में रातोंरात ठीक होने की अनुमति दें । एक डिश के लिए उपचार लागू करने के लिए 20 एनजी/एमएल ट्यूमर परिगलन कारक के साथ amyloids के गठन के लिए प्रेरित-अल्फा (TNF-α), १०० एनएम Smac-mimetic, और 20 µ एम पान-caspase अवरोधक Z-वद-FMK11। संयोजन TSZ के रूप में संक्षिप्त है । एक नियंत्रण के रूप में वाहन के साथ दूसरे पकवान समझो ।
  2. समय की उचित लंबाई के बाद, आमतौर पर 6 एच, फसल सेल lysate ।
    1. एक प्लास्टिक खुरचनी के साथ प्लेट बंद कोशिकाओं परिमार्जन और एक 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करने के लिए एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में स्थानांतरण । 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए १,००० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक ।
    2. बर्फ ठंडा पंजाबियों के 10 मिलीलीटर में reसस्पैंड और 4 डिग्री सेल्सियस से कम 3 मिनट के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं 2 बार धो लो । पंजाबियों समाधान महाप्राण ।
      नोट: प्रक्रिया तरल नाइट्रोजन में सेल गोली ठंड और 1 महीने के लिए ˗ ८० डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के द्वारा यहां रोका जा सकता है ।
    3. एक १.५-एमएल microcentrifuge ट्यूब और बर्फ पर 30 मिनट के लिए lysis बफर के ०.३ मिलीलीटर में गर्मी के लिए सेल गोली स्थानांतरण । 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए २०,००० x g पर केंद्रापसारक । supernatant पूरी सेल lysate है ।
      नोट: इस प्रक्रिया को कई महीनों तक के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर नमूना संग्रहीत करके यहां रोका जा सकता है ।
    4. एक ब्रैडफोर्ड परख द्वारा प्रोटीन एकाग्रता निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार उपाय । 3 µ g/µ l नमूना के 20 µ l तैयार करने के लिए 4x SDD-आयु लोडिंग बफ़र जोड़ें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।

2. जैल तैयार और भागो

  1. agarose के 2 g को २०० mL का 1x Tris-एसीटेट बफर (ताे) एक ग्लास यूरिन में डालें और एक माइक्रोवेव में हीट कर के agarose को पिघला दीजिये. ०.१% एसडीएस की अंतिम एकाग्रता के लिए 20% एसडीएस की 1 मिलीलीटर जोड़ें । ध्यान से मिश्रण करने के लिए घूमता । एसडीएस अलावा बुलबुले उत्पन्न करने के लिए नहीं ध्यान रखना ।
  2. एक 15 सेमी x 14 cm जेल स्लैब में agarose समाधान डालो । किसी भी बुलबुले को खत्म करने के लिए एक 1 मिलीलीटर पिपेट का प्रयोग करें । १ २० प्लेस-शीर्ष पर अच्छी तरह से कंघी ।
  3. पहला आयाम: पिपेट ६० दूर सही लेन में पूरे सेल lysate के µ जी । के बारे में 4 घंटे के लिए ६० V पर जेल भागो (डाई सामने जेल के माध्यम से ¾ के बारे में है) ताे चल बफर के रूप में ०.१% एसडीएस युक्त का उपयोग कर ।
  4. दूसरा आयाम: सावधानी से घुमाएं जेल ९० ° काउंटर दक्षिणावर्त (चित्रा 2ए) । चलाने के बारे में 4 एच के लिए ६० वी पर जेल ।
    नोट: सामांय चल रहे हालत 4 वी/ यह महत्वपूर्ण है कि चल रही स्थितियों ठीक पहले और दूसरे आयामों के लिए एक ही हैं ।

3. अंतरण

  1. एक polyvinylidene difluoride (PVDF) झिल्ली (चित्रा 2बी) के लिए प्रोटीन स्थानांतरित करने के लिए केशिका स्थानांतरण विधि का प्रयोग करें ।
    1. एक लगभग 20 सेमी x 20 सेमी कंटेनर के लिए स्थानांतरण बफ़र की ५०० मिलीलीटर जोड़ें । एक 5 सेमी उच्च कंटेनर के बगल में कागज तौलिए के ढेर बनाओ । स्टैक के शीर्ष की सतह क्षेत्र जेल आयाम से बड़ा होना चाहिए ।
    2. स्थानांतरण बफर में एक 14 सेमी x 15 सेमी फिल्टर पेपर सोख और कागज तौलिया ढेर के शीर्ष पर जगह है । ध्यान रखना कोई झुर्रियां या बुलबुले के साथ कागज पर जगह है । फ़िल्टर कागज का एक टुकड़ा के साथ दोहराएं ।
    3. 30 एस के लिए मेथनॉल में एक 14 सेमी x 15 सेमी PVDF झिल्ली को सक्रिय करें तो यह फिल्टर कागज पर सभी बुलबुले को दूर करने के लिए एक रोलर का उपयोग देखभाल लेने पर परत । स्थानांतरण बफर के साथ बंद जेल कुल्ला और यह झिल्ली के शीर्ष पर परत, फिर से बाहर किसी भी बुलबुले रोलिंग ।
    4. प्लास्टिक लपेटो के साथ स्थानांतरण बफर के कंटेनर के लिए निकटतम कागज तौलिए के किनारे को कवर । ऐसे में जरूरी है कि कागजी पुल का निर्माण अगले चरण में कागजी तौलिया टैक के सीधे संपर्क में न आए ।
    5. स्थानांतरण बफर में 15 सेमी x ३५ cm फ़िल्टर पेपर का एक टुकड़ा भिगोएं और एक छोर जेल के शीर्ष कवर और दूसरे छोर हस्तांतरण बफर के कंटेनर में है तो यह जगह है । एक और पुल के साथ दोहराएं ।
    6. प्लास्टिक लपेटो के साथ कंटेनर को कवर और कमरे के तापमान पर रात भर छोड़ दें ।

4. वेस्टर्न सोख्ता डिटेक्शन

  1. एक 20 सेमी × 20 सेमी कंटेनर में ०.०५% के बीच-20 (PBST) युक्त पंजाब के ५० मिलीलीटर के साथ झिल्ली कुल्ला । PBST में 20 मिलीलीटर 5% दूध डालें । ब्लॉक करने के लिए 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रॉक ।
  2. पिपेट 10 µ एल के खरगोश विरोधी MLKL एंटीबॉडी में 5% दूध की 20 मिलीलीटर में PBST और कंटेनर को जोड़ने । 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर घुमाव पर मशीन ।
  3. 5 मिनट के लिए PBST के 20 मिलीलीटर में झिल्ली धो 5 बार दोहराएँ ।
  4. एंटी-खरगोश के पिपेट 4 µ एल-एचआरपी को PBST में 5% दूध की 20 मिलीलीटर और कंटेनर में डालें । 2 एच के लिए कमरे के तापमान पर घुमाव पर मशीन ।
  5. 5 मिनट के लिए PBST के 20 मिलीलीटर में झिल्ली धो 5 बार दोहराएँ ।
  6. संवर्धित chemiluminescence सब्सट्रेट (ECL) जोड़ें और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक्स-रे फिल्मों को बेनकाब.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

necroptosis प्रेरण के बाद, RIPK1 और RIPK3 लगभग समान amyloid-पैटर्न (लेन 2 और 4, चित्रा 1) की तरह दिखाया. हालांकि, MLKL फाइबर और अधिक विषम थे और RIPK1/RIPK3 फाइबर (लेन 6, चित्रा 1) से छोटे होने के लिए लग रहा था । कि हम 2 डी SDD-आयु विधि को विकसित करने के लिए संभावना है कि क्या MLKL रूपों RIPK1/RIPK3-स्वतंत्र तंतुओं या MLKL बस dissociates-उंर के दौरान बड़े RIPK1/RIPK3/MLKL फाइबर से SDD पता करने के लिए प्रेरित किया ।

ट्रो और स्थानांतरण प्रक्रिया का एक सामांय योजनाबद्ध चित्रा 2में दिखाया गया है । पहले आयाम SDD-आयु के दौरान, amyloid या amyloid की तरह फाइबर एक विशेषता धब्बा प्रदर्शन, के रूप में चित्रा 3एमें देखा जाएगा । दूसरा आयाम SDD-उंर चलाने पर, वहां दो संभावित परिणाम हैं । जेल चलने की प्रक्रिया के दौरान कोई गिरावट या पृथक्करण के मामले में, फाइबर हूबहू दूसरे रन के दौरान विस्थापित हो जाएगा के रूप में वे पहले भाग में किया था । इस मामले में, एक पश्चिमी दाग एक ४५ ° कोण पर झिल्ली पर एक तिरछी पैटर्न प्रदर्शन के रूप में चित्रा 3बीमें देखा जाएगा । SDD-आयु प्रक्रिया के दौरान फाइबर अलग कर देना, तो छोटे फाइबर तेजी से दूसरी ट्रो के दौरान स्थानांतरित कर देगा. इस मामले में, एक पश्चिमी दाग तिरछी रेखा के नीचे खड़ी लकीर प्रदर्शन, के रूप में चित्रा 3सीमें दिखाया जाएगा ।

necroptosis के दौरान देखा MLKL फाइबर के मामले में, वे पहले आयाम SDD-आयु (चित्रा 4ए) के दौरान विशेषता धब्बा दिखाते हैं । जब वे एक ही फाइबर 2d SDD उंर के अधीन थे, वे कोई ऊर्ध्वाधर लकीर (चित्रा 4बी) के साथ एक तेज तिरछी रेखा का प्रदर्शन किया । इस प्रमाण के साथ, यह निष्कर्ष निकाला गया कि MLKL SDD-आयु प्रक्रिया के दौरान तंतुओं से dissociating नहीं था और यह कि MLKL-युक्त तंतुओं में देखा गया चित्रा 1 RIPK1/RIPK3 तंतुओं से वास्तव में अलग थे. इसके अलावा, जब RIPK3 सेल lysates से इंयूनो-समाप्त हो गया था, MLKL फाइबर बरकरार रहे4, पुष्टि की है कि MLKL फाइबर और RIPK1/RIPK3 फाइबर वास्तव में अलग संस्थाओं रहे हैं ।

Figure 1
चित्र 1 . necroptosis के दौरान amyloid-तरह के तंतुओं की परीक्षा. पूरे सेल lysates TNF-प्रेरित necroptosis के दौर से गुजर कोशिकाओं से काटा गया और SDD-उंर के अधीन थे । पश्चिमी दाग RIPK1, RIPK3, और MLKL के लिए प्रदर्शन किया गया । MLKL युक्त फाइबर RIPK1/RIPK3-युक्त तंतुओं से एक अलग प्रवास पैटर्न का प्रदर्शन किया । MLKL मोनोमर इस शर्त के तहत बमुश्किल दिखाई देता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . प्रायोगिक प्रोटोकॉल । (क) योजनाबद्ध दो आयामी अर्द्ध-denaturing डिटर्जेंट agarose जेल ट्रो (2d SDD-आयु). सही सबसे लेन में नमूना लोड हो रहा है, लाल रंग में लेबल से शुरू करो । पहला आयाम चलाने की समाप्ति के बाद, जेल ९० ° काउंटर दक्षिणावर्त घुमाएं । दूसरा आयाम ट्रो चलाएं । ठोस तीर प्रथम आयाम चलाने की दिशा इंगित करता है, डॉटेड तीर दूसरा आयाम चलाने की दिशा इंगित करता है । (B) केशिका क्रिया द्वारा अंतरण का स्कीमा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . संभावित परिणाम । (क) SDD-आयु के प्रथम आयाम के बाद amyloid या amyloid-जैसे तंतुओं का अपेक्षित प्रवास पैटर्न. ठोस तीर माइग्रेशन की दिशा इंगित करता है । (ख) 2d SDD-आयु के बाद SDD-आयु-स्थिर (कोई क्षरण या पृथक्करण) amyloid या amyloid-जैसे तंतुओं के अपेक्षित माइग्रेशन प्रतिमान । ठोस तीर प्रथम आयाम SDD-आयु की दिशा को इंगित करता है. डॉटेड तीर द्वितीय आयाम SDD-आयु की दिशा इंगित करता है । (C) गैर-SDD-आयु-स्थिर amyloid या amyloid-जैसे तंतुओं का अपेक्षित माइग्रेशन प्रतिमान । ठोस तीर प्रथम आयाम SDD-आयु की दिशा को इंगित करता है. डॉटेड तीर द्वितीय आयाम SDD-आयु की दिशा इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4। 1 डी और 2d SDD-आयु के दौरान MLKL-युक्त तंतुओं का प्रवास । (क) पूरे सेल lysates TSZ के साथ उत्तेजित कोशिकाओं से काटा गया necroptosis से गुजरना । lysates SDD उंर के अधीन थे, और MLKL के लिए एक पश्चिमी दाग प्रदर्शन किया गया । एक विशेषता धब्बा मनाया गया । (ख) पूरे सेल lysates necroptosis से गुजरना करने के लिए TSZ के साथ उत्तेजित कोशिकाओं से काटा गया था । lysates 2d SDD उंर के अधीन थे और एक पश्चिमी दाग MLKL के लिए प्रदर्शन किया गया । एक ४५ डिग्री कोण पर एक तेज लाइन मनाया गया था, यह दर्शाता है कि तंतुओं SDD-उंर के दौरान पृथक्करण से गुजरना नहीं है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

2d SDD-आयु का सबसे विचारणीय पहलू यह है कि ट्रो स्थितियां पहले और दूसरे आयाम के लिए ही हैं । ४५ डिग्री पर एक तेज तिरछी रेखा का पता लगाने की क्षमता (यह दर्शाता है कि कोई पृथक्करण या क्षरण हुआ है) दोनों electrophoreses के दौरान एक समान तरीके से पलायन तंतुओं पर निर्भर करता है । विभिंन स्थितियों का उपयोग करना, उदाहरण के लिए वोल्टेज या रन समय की लंबाई बदलने के लिए, इन परिणामों अस्पष्ट होगा । इसके अलावा, के रूप में पारंपरिक 1 डी SDD उंर के लिए मामला है, नमूना उबलते, बचा जाना चाहिए के रूप में इस amyloid और amyloid फाइबर की तरह बाधित होगा । के रूप में सभी स्थानांतरण के लिए मामला है, ध्यान फिल्टर कागज, झिल्ली की परतों के बीच बुलबुले से बचने के लिए लिया जाना चाहिए, और जेल । अंत में, स्थानांतरण कदम के दौरान, यह महत्वपूर्ण है कि पुल सूखना नहीं है और सीधे कागज तौलिया ढेर से संपर्क करें । एक विश्वसनीय तरीका यह रोकने के लिए प्लास्टिक लपेटो के एक छोटे से टुकड़े का उपयोग करने के लिए कागज तौलिए के किनारे को कवर है ।

प्रोटोकॉल (६० V 4 h के लिए) में उपलब्ध कराई गई चल रही शर्तों समायोजित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल में, agarose जेल में 14 सेमी x 15 सेमी था । एक छोटे जेल का उपयोग किया जाता है, तो वोल्टेज (4 वी/सेमी जेल लंबाई) और चलाने के समय आनुपातिक समायोजित किया जाना चाहिए । जेल की तैयारी करते समय दो कंघी का प्रयोग कर एक बार में दो नमूनों का विश्लेषण किया जा सकता है । नमूने सही में सबसे अच्छी तरह से प्रत्येक कंघी के लिए लोड किया जाना चाहिए । शीर्ष नमूना जेल के निचले आधे में नहीं चलता है ताकि इस स्थिति में, चलाते समय फिर से छोटा होना चाहिए । समय जेल के एक आयाम के लिए समायोजित किया जाता है, तो यह अन्य आयाम मैच के लिए समायोजित किया गया है कि महत्वपूर्ण है.

एसडीएस-PAGE के विपरीत, दोनों 1 डी और 2d SDD-आयु अर्द्ध denaturing हैं । क्योंकि फाइबर बरकरार रहना, कुछ epitopes दुर्गम रह सकता है । यह कुछ एंटीबॉडी द्वारा पता लगाने की सीमा हो सकती है । 2d SDD-आयु amyloid या amyloid की तरह फाइबर का सही आकार निर्धारित करने की क्षमता में सीमित है । हालांकि, एक सापेक्ष आकार तुलना किया जा सकता है ।

सभी प्रोटीन परिसरों SDD-आयु के दौरान पृथक्करण या क्षरण के अधीन हैं, और इसलिए गुणात्मक परिणाम की व्याख्या करने के लिए मुश्किल हो सकता है । 2d SDD-आयु परमिट पुष्टि का उपयोग SDD-आयु के दौरान देखा विविधता आकार पृथक्करण के दौरान एसडीएस-निर्भर ट्रो के कारण नहीं है । 2d SDD-आयु किसी भी संदर्भ में उपयोग करने के लिए उपयुक्त है, जहां पारंपरिक 1 डी SDD-उंर का उपयोग किया जाता है । 2d SDD-आयु विशेष रूप से उपयोगी है जब आकार विविधता 1 डी SDD-आयु में मनाया जाता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं की ।

Acknowledgments

यह काम S.H.-ए के लिए एक फैलोशिप द्वारा समर्थित है । से NIH/NCATS (TL1TR001104), एक वेल्च फाउंडेशन अनुदान (I-१८२७), और R01 (NIGMS) से RGM120502A Z.W. से एक Z.W. अनुदान चिकित्सा अनुसंधान और कैंसर की रोकथाम और टेक्सास विद्वान (Murchison) के अनुसंधान संस्थान में वर्जीनिया Linthicum R1222 विद्वान है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gel electrophoresis unit Fisher HE99XPRO appratus for gel running.
agrose VWR 97062-250 For agarose gel.
paper tower Fisher 19-120-2484 for transfering
filter paper VWR 21427-386 for transfering
PVDF membrane Bio-Rad 162-0177 for transfering
blocking milk powder Bio-Rad 1706404XTU for blocking in Western blot
MLKL antibody Genetex GTX107538 rabbit anti-MLKL antibody
RIPK1 antibody BD Biosciences 610459 mouse anti-RIPK1 antibody
RIPK3 antibody gift from Dr. Xiaodong Wang rabbit anti-RIPK3. See refenence 11.
anti-Rabbit-HRP Sigma A6154 secondary antibody
ECL Fisher WBKLS0500 Western chemiluminescent HRP substrate
X-ray film Fisher F-BX810 for Western blot result
DMEM Sigma D6429 for cell culture
fetal bovine serum Sigma F4135 for cell culture
penicilin-streptomycin Sigma P4333 for cell culture
Trypsin solution Sigma T4049 for cell culture
PBS for tissue culture Sigma D8662 for cell culture
recombinant TNF made in our lab for inducing necroptosis. See reference 11.
smac-mimetic gift from Dr. Xiaodong Wang for inducing necroptosis. See reference 11.
ZVAD-FMK ApexBio A1902 for inducing necroptosis. See reference 11.
Cell Counter Bio-Rad 1450102 Model TC20; for counting cells
Pierce™ BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 for measuring protein concentration in cell lysates
Cell lifter Fisher 07-200-364 to remove cells from dish
Lysis Buffer (1 L) 20 mL 1 M Tris pH 7.4
10 mL glycerol
30 mL 5 M NaCl
840 mL ddH2O
10 mL Triton-X100
(protease and phosphates inhibitors as desired)
10X TAE (1 L) 48.4 g Tris base
11.42 mL glacial acetic acid
20 mL 0.5M EDTA pH 8
ddH20 to 1 L
4X SDD-AGE loading buffer (50 mL) 5 mL 10X TAE
10 mL glycerol
4 mL 20% SDS
0.5 mL 10% bromophenol blue
31 mL ddH2O
TBS Transfer Buffer (1 L) 20 mL 1 M Tris pH 7.4
30 mL 5 M NaCl
950 mL ddH2O
PBST Wash Buffer (1 L) 100 mL 10xPBS
800 mL ddH2O
1 mL Tween20
10X PBS (10 L) 800 g NaCl
20 g KCl
144 g Na2HPO4·2H2O
24 g KH2PO4
add ddH2O to 10 L

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature medicine. 10, 10-17 (2004).
  2. Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
  3. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
  4. Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).
  5. Uptain, S. M., Lindquist, S. Prions as protein-based genetic elements. Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).
  6. Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. , (2008).
  7. Sipe, J. D., et al. Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis. Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).
  8. Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level. Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).
  9. Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. Methods in Enzymology. 412, Academic Press. 33-48 (2006).
  10. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
  11. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137, 1100-1111 (2009).

Tags

जैव रसायन अंक १३४ Amyloid Amyloid की तरह प्रोटीन कुल प्रोटीन जटिल दो आयामी अर्द्ध denaturing डिटर्जेंट agarose जेल ट्रो पृथक्करण आकार विविधता संकेतन
दो आयामी अर्द्ध denaturing डिटर्जेंट Agarose जेल ट्रो का उपयोग Amyloid या Amyloid फाइबर की तरह आकार विविधता की पुष्टि करने के लिए
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hanna-Addams, S., Wang, Z. Use of… More

Hanna-Addams, S., Wang, Z. Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers. J. Vis. Exp. (134), e57498, doi:10.3791/57498 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter