Summary
هنا نستخدم الأبعاد شبه يشوه [اغروس] هلام التفريد لتأكيد وجود ألياف اميلويد مثل الحجم غير المتجانسة، واستبعاد إمكانية أن يعود إلى التباين في حجم الانفصال الألياف اميلويد خلال الجل العملية قيد التشغيل.
Abstract
ألياف اميلويد أو اميلويد تشبه ارتبطت بالعديد من الأمراض التي تصيب الإنسان، والآن يجري اكتشافها مهما للعديد من مسارات الإشارات. القدرة على اكتشاف سهولة تكوين هذه الألياف تحت الظروف التجريبية المختلفة أمر ضروري لفهم وظيفتها المحتملة. وقد استخدمت العديد من الأساليب للكشف عن الألياف، ولكن لا يخلو من بعض العيوب. على سبيل المثال، الميكروسكوب الإلكتروني (م)، أو تلطيخ مع أحمر الكونغو أو تي ثيوفلافين غالباً ما يتطلب تنقية الألياف. من ناحية أخرى، يتيح شبه يشوه المنظفات [اغروس] هلام التفريد (SDD-العمر) الكشف عن الألياف اميلويد تشبه المقاوم للحزب الديمقراطي الصربي في مقتطفات الخلية دون تنقية. وباﻹضافة إلى ذلك، فإنه يسمح مقارنة الفرق حجم الألياف. الأهم من ذلك، يمكن استخدامه للتعرف على بروتينات محددة داخل الألياف من النشاف الغربية. وأقل استهلاكاً للوقت وأكثر سهولة لعدد أوسع من مختبرات. غالباً ما تظهر النتائج SDD-العمر متغير درجة من عدم التجانس. فإنه يثير المسألة ما إذا كان جزء من التباين النتائج من التفكك للبروتين معقدة أثناء التفريد حضور الحزب الديمقراطي الصربي. لهذا السبب، نحن قد استخدمت بعد ثاني من SDD-سن لتحديد ما إذا كان تباين حجم ينظر في SDD-العمر حقاً نتيجة للألياف عدم التجانس في فيفو وليس نتيجة لتدهور أو تفكك بعض البروتينات خلال التفريد. يسمح هذا الأسلوب تأكيد سريعة ونوعية الألياف اميلويد أو مثل اميلويد هي لا الناي جزئيا خلال عملية SDD-العمر.
Introduction
منذ فترة طويلة كان معروفا تشكيل ألياف اميلويد بسبب البروتين misfolding لتلعب دوراً في ظروف مرضية مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون، ومرض هنتنغتون1. في الآونة الأخيرة، قد تبين تشكيل ألياف اميلويد أو اميلويد مثل أن تكون جزء من مسارات الإشارات في البشر، بما في ذلك من خلال الاستجابة المناعية الفطرية المضادة للفيروسات2 ونيكروبتوسيس3،4، وفي انخفاض الكائنات الحية مثل الخميرة5،6. ولذلك، من المهم القدرة على الكشف عن هذه الألياف في المعمل. حاليا، هناك ثلاثة طرق رئيسية للكشف عن اميلويد وألياف اميلويد مثل: استخدام الأصباغ، وطب الطوارئ و SDD-العمر.
ويتيح استخدام الأصباغ، مثل أحمر الكونغو أو تي ثيوفلافين، تتميز بأنها سريعة ويمكن كشفها بسهولة باستخدام الفحص المجهري أو التحليل الطيفي7. ومع ذلك، يوفر الكشف عن طريق الفحص المجهري، وفي حالة الكونغو الحمراء، خصوصية لا التي تشمل بروتينات الألياف، أو حجم الألياف. وبالمثل، يوفر استخدام التحليل الطيفي للكشف عن ربط أحمر الكونغو أو تي ثيوفلافين إلى مجمعات البروتين فقط نتيجة إيجابية أو سلبية.
م توفر أدلة قاطعة على وجود الألياف وكمية من المعلومات حول الألياف طولها وقطرها8أيضا. ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب تنقية صارمة للغاية. بالإضافة إلى ذلك، أم هو أسلوب متخصصة الذي يستخدم معدات باهظة الثمن.
وقد استخدمت SDD-العمر للكشف عن مجمعات البروتين المقاوم للحزب الديمقراطي الصربي دالتون الضخمة بما في ذلك ألياف اميلويد أو مثل اميلويد. ويوفر العديد من المزايا. أولاً، أنها لا تتطلب تنقية الألياف ومن السهل peform9. ثانيا، فإنه يوفر معلومات نوعية عن الحجم الألياف، بما في ذلك الحجم النسبي وكمية من الألياف هيتيروجينيسيتي. وأخيراً، لأنه يمكن أن يؤديها النشاف الغربية بعد التفريد، فمن السهل الكشف عن وجود أي البروتين الذي يوجد جسم، على الرغم من أنه تجدر الإشارة إلى أنه نظراً لأن يشوه شبه SDD-العمر، بعض [ابيتوبس] قد تظل أخفى الذي يعقد الكشف بالضد.
في الآونة الأخيرة، أبلغ مستقبلات التفاعل البروتين كيناز 1 (RIPK1) و 3 (RIPK3) على شكل ألياف اميلويد لتكون بمثابة إشارات المنصات خلال نيكروبتوسيس، نموذج مبرمجة من نخر3. أثناء دراسة هذه الألياف، لدينا مختبر أظهرت أن آخر البروتين المرتبطة نيكروبتوسيس، خلط النسب كيناز مثل المجال (ملكل)، وشكلت أيضا ألياف اميلويد مثل4. ومع ذلك، عند الفحص مع SDD-العمر، ظهرت حجم الألياف ملكل متميزة من ألياف RIPK1 و RIPK3، التي بدت متطابقة مع بعضها البعض (الشكل 1). وكان هذا غير متوقع لأنه من المعروف جيدا أن يربط ملكل RIPK1/RIPK3 لتشكيل نيكروبتوسيس إشارة معقدة تسمى نيكروسومي10.
وهناك مالا يقل عن اثنين من التفسيرات. أولاً، قد تشكل ألياف اميلويد تشبه تماما متميزة اثنين أثناء نيكروبتوسيس، واحدة تحتوي على RIPK1/RIPK3 وملكل الأخرى التي تحتوي على. ثانيا، هو نوع واحد فقط من ألياف اميلويد تشبه قد شكلت المحتوية على RIPK1/RIPK3/ملكل أثناء نيكروبتوسيس، ولكن رابطة ملكل مع البروتينات الأخرى ضعف ما يكفي أنه ينأى خلال SDD-العمر.
لمعالجة هذه المشكلة، نقترح إجراء ثنائي الأبعاد (2D) SDD-عمر. وسيكون اميلويد SDD-العمر-مستقرة أو ألياف اميلويد تشبه نفس نمط الهجرة أثناء التفريد البعد الأول والثاني. سيكون هذا الاكتشاف بعد نقل البروتينات إلى غشاء والاضطلاع بوصمة عار غربية. ألياف مستقرة سوف يحمل نقش قطري حادة. أي انحراف عن هذا يوحي بأن الألياف تغيرات بسبب مخزونات النشر الاستراتيجي-التفريد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد العينات
- ثقافة 2 × 106 اميلويد إنتاج خلايا سرطان القولون HT-29 في طبق استنبات الأنسجة 10 سم في 10 مل من تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين والبنسلين والستربتوميسين. خلايا الثقافة بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
- بعد زراعة الخلايا إلى 80% كونفلوينسي، تغسل الخلايا مع 10 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS). أضف 3 مل من محلول التربسين واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
- بعد الخلايا معزولة تماما من الطبق، أضف 10 مل من الثقافة المتوسطة ونقل الخلايا ماصة 10 مل أنبوب مخروطي 15 مل. الطرد المركزي الخلايا في 1,000 س ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح المتوسطة وريسوسبيند الخلايا في 5 مل من الثقافة المتوسطة عد الخلايا باستخدام عداد خلايا. لوحة 2 × 106 خلايا في كل من اثنين 10 سم الأطباق.
- السماح للخلايا للتقيد واسترداد بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية مع شركة 5%2. تطبيق العلاج على صحن واحد للحث على تشكيل أميلويدس مع 20 نانوغرام/مليلتر ألفا عامل نخر الورم (تنف-α)، 100 نانومتر عموم ميكرومتر الألغام ميميتيك، و 20-caspase المانع Z-نقص فيتامين-مارك فنلندي11. يتم اختصار التركيبة كالمنطقة الأمنية المؤقتة. علاج الطبق الأخرى مع مركبة كعنصر تحكم.
- وبعد طول الوقت المناسب، الحصاد عادة ح 6، الخلية ليستي.
- كشط الخلايا خارج اللوحة مع مكشطة بلاستيكية واستخدم ماصة 10 مل لتحويل إلى أنبوب مخروطي 15 مل. الطرد المركزي الخلايا في 1,000 س ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
- تغسل الخلايا 2 مرات ريسوسبيندينج في 10 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني وسينتريفوجينج في 1,000 س ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح الحل برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: هذه العملية يمكن أن يكون مؤقتاً هنا بتجميد بيليه الخلية في النتروجين السائل، وتخزينها في ˗80 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. - نقل الخلية بيليه إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل واحتضان في 0.3 مل من تحلل المخزن المؤقت لمدة 30 دقيقة على الجليد. أجهزة الطرد المركزي في 20,000 x ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. المادة طافية هي الخلية كله ليستي.
ملاحظة: هذه العملية يمكن أن يكون مؤقتاً هنا عن طريق تخزين العينة في-20 درجة مئوية لتصل إلى عدة أشهر. - قياس تركيز البروتين بمقايسة برادفورد وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. إضافة 4 × SDD-العمر تحميل المخزن المؤقت إعداد 20 ميليلتر من 3 ميكروغرام/ميليلتر عينة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
2-إعداد وتشغيل المواد الهلامية
- إضافة 2 ز [اغروس] إلى 200 مل س 1 تريس-خلات المخزن المؤقت (تاي) في كوب زجاج والحرارة في فرن ميكروويف تذوب في [اغروس]. أضف 1 مل من الحزب الديمقراطي الصربي 20% لتركيز نهائي من الحزب الديمقراطي الصربي 0.1%. دوامة بعناية مزيج. الحرص على عدم توليد فقاعات بعد إضافة صحيفة بيانات السلامة.
- من أجل الحل [اغروس] إلى لوح جل 15 سم × 14 سم. استخدام ماصة 1 مل لإزالة أي فقاعات. مكان واحد مشط 20-جيدا في الجزء العلوي.
- البعد الأول: ماصة 60 ميكروغرام كل خلية في حارة اليمين المتطرف. تشغيل الهلام في 60 الخامس لحوالي 4 ح (حتى الصبغ والجبهة هي حوالي ¾ من خلال الجل) استخدام تاي التي تحتوي على مخزونات النشر الاستراتيجي 0.1% كالمخزن المؤقت قيد التشغيل.
- البعد الثاني: تدوير بعناية للهلام 90° عقارب الساعة (الشكل 2أ). تشغيل الهلام في 60 الخامس لحوالي 4 ح.
ملاحظة: حالة تشغيل عامة 4 طول جل الخامس/سم. من المهم أن شروط التشغيل هي بالضبط نفس الأبعاد الأولى والثانية.
3-نقل
- استخدام أسلوب النقل الشعرية لنقل البروتينات إلى غشاء ثنائي الفلوريد (PVDF) الفينيليدن (الشكل 2ب).
- إضافة 500 مل من المخزن المؤقت نقل إلى حاوية 20 سم × 20 سم تقريبا. جعل كومة عالية 5 سم من المناشف الورقية بجانب الحاوية. يجب أن تكون المساحة السطحية للجزء العلوي من المكدس أكبر من أبعاد هلام.
- نقع ورقة تصفية 14 سم × 15 سم في نقل المخزن المؤقت ثم ضعه أعلى المكدس منشفة ورقة. الحرص على وضع على الورق مع لا التجاعيد أو فقاعات. كرر مع آخر قطعة من ورق الترشيح.
- تنشيط غشاء PVDF 14 سم × 15 سم في الميثانول لمدة 30 ثانية ثم طبقة على ورق الترشيح مع الحرص على استخدام اسطوانة إزالة جميع فقاعات. شطف الجل مع نقل المخزن المؤقت وطبقة من أعلى الغشاء، مرة أخرى وطرح أي فقاعات.
- تغطي حافة مناشف ورقية الأقرب إلى حاوية لنقل المخزن المؤقت مع غلاف بلاستيكي. من المهم أن الجسر الورقة التي شيدت في الخطوة التالية لا تتلامس مباشرة مع مكدس منشفة ورقة.
- نقع قطعة من ورق الترشيح 15 سم × 35 سم في نقل المخزن المؤقت ووضعه حتى نهاية واحد يغطي الجزء العلوي من الجل والطرف الآخر في حاوية نقل المخزن المؤقت. كرر مع جسر آخر.
- تغطية الحاوية مع غلاف بلاستيكي وتترك ليلة كاملة في درجة حرارة الغرفة.
4-الغربية النشاف الكشف
- شطف الغشاء مع 50 مل من برنامج تلفزيوني تحتوي على 0.05% 20 توين (ببست) في حاوية 20 سم × 20 سم. إضافة 20 مل حليب 5% في ببست. صخرة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة كتلة.
- "الماصة؛" 10 ميليلتر من جسم الأرنب ملكل المضادة إلى 20 مل حليب 5% في ببست، وإضافة إلى الحاوية. تبني على الروك بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- يغسل الغشاء في 20 مل ببست 5 دقيقة كرر 5 مرات.
- "الماصة؛" 4 ميليلتر لمكافحة rabbit HRP إلى 20 مل حليب 5% في ببست، وإضافة إلى الحاوية. تبني على الروك في درجة حرارة الغرفة ح 2.
- يغسل الغشاء في 20 مل ببست 5 دقيقة كرر 5 مرات.
- إضافة تشيميلومينيسسينسي تعزيز الركيزة (القامة) وعرض لأفلام الأشعة السينية وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد التعريفي نيكروبتوسيس، و RIPK1 و RIPK3 وأظهرت أنماط مثل اميلويد مماثلة تقريبا (الممرات 2 و 4، الشكل 1). ومع ذلك، ألياف ملكل متغايرة أكثر ويبدو أصغر من ألياف RIPK1/RIPK3 (لين 6، الشكل 1). الذي حدا بنا إلى وضع أسلوب SDD-العمر 2D لمعالجة احتمال ملكل يشكل ألياف RIPK1/RIPK3-مستقلة كانت أم ملكل تنأى ببساطة من ألياف RIPK1/RIPK3/ملكل كبيرة خلال SDD-العمر.
ويرد في الشكل 2تخطيطي عام إجراء التفريد، ونقل. خلال البعد الأول SDD-العمر، سوف يحمل ألياف اميلويد أو اميلويد الشبيهة مسحه مميزة، كما هو مبين في الشكل 3ألف. عند تشغيل البعد الثاني SDD-العمر، هناك نتيجتين محتملتين. في حالة لا تدهور أو تفكك خلال الجل تشغيل العملية، الألياف سيتم ترحيل مماثل أثناء التشغيل الثاني كما فعلوا في التشغيل الأول. وفي هذه الحالة، سوف يحمل وصمة عار غربية نقش قطري على الغشاء بزاوية 45 درجة كما هو موضح في الشكل 3ب. إذا كان فصل الألياف أثناء عملية SDD-العمر، سيتم ترحيل الألياف أصغر أسرع أثناء التفريد الثانية. وفي هذه الحالة، سوف يحمل وصمة عار غربية streaking الرأسية عن خط قطري، كما هو مبين في الشكل 3ج.
في حالة الألياف ملكل شهدت خلال نيكروبتوسيس، فإنها تظهر اللطاخة المميزة خلال البعد الأول SDD-العمر (الشكل 4أ). عندما كانت تتعرض هذه الألياف نفس في 2D SDD-العمر، أظهرت أنها خط قطري حادة مع لا عمودي streaking (الشكل 4ب). مع هذا الدليل، واستنتج أن ملكل كان الناي لا من الألياف خلال عملية SDD-العمر وأن الألياف التي تحتوي على ملكل ينظر في الشكل 1 كانت متميزة في الواقع من ألياف RIPK1/RIPK3. وعلاوة على ذلك، عندما كان RIPK3 المنضب المناعية من ليساتيس الخلية، ألياف ملكل ظلت سليمة4، مؤكدة أن ألياف ملكل وألياف RIPK1/RIPK3 كيانات متميزة في الواقع.
الشكل 1 . دراسة الألياف اميلويد تشبه خلال نيكروبتوسيس- كانت تحصد من الخلايا التي تمر نيكروبتوسيس الناجمة عن تنف ليساتيس خلية كاملة وتعرض ل SDD-العمر. وأجريت البقع الغربية ل RIPK1 و RIPK3 وملكل. أظهرت الألياف المحتوية على ملكل نمط هجرة متميزة من ألياف RIPK1/RIPK3-تتضمن. مونومر ملكل مرئياً بالكاد تحت هذا الشرط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . بروتوكول تجريبي. (أ) التخطيطي للتفريد هلام [اغروس] المنظفات يشوه شبه ثنائية الأبعاد (2D SDD-العمر). ابدأ بتحميل العينة في حارة معظم الحق، المسمى باللون الأحمر. بعد انتهاء المرحلة الأولى من تشغيل البعد، تدوير هلام عقارب الساعة 90°. تشغيل التفريد البعد الثاني. الصلبة سهم يشير إلى اتجاه البعد الأول تشغيل، سهم منقط يشير إلى اتجاه البعد الثاني تشغيل. (ب) مخطط لنقل بعمل شعري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . النتائج الممكنة- النمط (أ) الهجرة المتوقعة من ألياف اميلويد أو مثل اميلويد بعد البعد الأول من العمر SDD. الصلبة سهم يشير إلى اتجاه الهجرة. (ب) الهجرة المتوقعة نمط اميلويد SDD-العمر-مستقرة (لا تدهور أو الانفصال) أو ألياف اميلويد تشبه بعد سن SDD 2D. الصلبة سهم يشير إلى اتجاه البعد الأول SDD-العمر. سهم منقط يشير إلى اتجاه البعد الثاني SDD-العمر. (ج) نمط الهجرة المتوقعة من اميلويد غير-SDD-العمر-مستقرة أو ألياف اميلويد الشبيهة. الصلبة سهم يشير إلى اتجاه البعد الأول SDD-العمر. سهم منقط يشير إلى اتجاه البعد الثاني SDD-العمر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. المحتوية على "الهجرة ملكل" الألياف أثناء 1 د و 2D SDD-العمر- كانت تحصد ليساتيس خلية كله (A) من الخلايا التي حفزت مع المنطقة الأمنية المؤقتة للخضوع نيكروبتوسيس. ليساتيس تعرضوا ل SDD-العمر، وأنجز وصمة عار غربية ملكل. وقد لوحظ مسحه مميزة. (ب) خلية كله ليساتيس كانت تحصد من خلايا حفز مع المنطقة الأمنية المؤقتة للخضوع نيكروبتوسيس. ليساتيس تعرضوا ل 2D SDD-العمر وأنجز وصمة عار غربية ملكل. ولوحظ خط حادة بزاوية 45 درجة، مشيراً إلى أن الألياف لا تخضع للانفصال من خلال سن SDD. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الجانب الأكثر أهمية في 2D SDD-السن أن شروط التفريد هي نفسها بالنسبة للبعد الأول والثاني. اليكتروفوريسيس القدرة على الكشف عن خط قطري حادة في 45° (التي تشير إلى أن حدوث لا تفكك أو تدهور) يعتمد على الألياف يهاجرون بطريقة مماثلة أثناء على حد سواء. استخدام شروط مختلفة، على سبيل المثال تغيير الجهد أو طول وقت التشغيل، سوف يحجب هذه النتائج. أيضا، كما الحال بالنسبة التقليدية 1 د SDD-العمر، غليان العينة ينبغي تجنب، كهذا سوف يعطل اميلويد وألياف اميلويد الشبيهة. وكما الحال لجميع التحويلات، ينبغي الحرص على تجنب فقاعات بين الطبقات من ورق الترشيح والغشاء، وجل. وأخيراً، أثناء الخطوة نقل، من الأهمية بمكان أن الجسر لا تدلي والاتصال مباشرة بالمكدس منشفة ورقة. طريقة موثوقة لمنع هذا استخدام قطعة صغيرة من البلاستيك لتغطية حافة مناشف ورقية.
ويمكن تعديل شروط التشغيل المنصوص عليها في البروتوكول (60 الخامس ح 4). على سبيل المثال، كان [اغروس] هلام في هذا البروتوكول، 14 سم × 15 سم. إذا كان يتم استخدام هلام أصغر، وقت التشغيل والجهد (V/سم 4 جل طول) ينبغي تعديل تناسبياً. قد تحليل عينات اثنين في وقت واحد باستخدام امشاط اثنين عند تحضير الهلام. يجب أن يتم تحميل العينات في حق آخر جيد لكل مشط. وفي هذه الحالة، مرة أخرى ضرورة تقصير وقت التشغيل حيث أن العينة أعلى لا تصل إلى الأسفل نصف جل. إذا كان يتم ضبط الوقت للبعد واحد من الجل، من الأهمية بمكان أن يتم ضبط البعد الآخر لمطابقة.
وعلى النقيض من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، 1 د و 2D SDD-العمر شبه يشوه. نظراً لأن الألياف لا تزال سليمة، قد تظل بعض [ابيتوبس] غير قابل للوصول. وهذا قد يحد الكشف عن طريق بعض الأجسام المضادة. 2D SDD-العمر محدودة في قدرتها على تحديد حجم الألياف اميلويد أو اميلويد تشبه بالضبط. ومع ذلك، يمكن إجراء مقارنة حجم نسبي.
جميع البروتينات مجمعات تخضع للانفصال أو تدهور خلال SDD-العمر، وذلك قد يكون من الصعب تفسير النتائج النوعية. يسمح استخدام 2D SDD-العمر تأكيدا بأن تباين حجم شهدت خلال SDD-العمر ليس بسبب تفكك تعتمد على الحزب الديمقراطي الصربي أثناء التفريد. 2D SDD-العمر مناسبة للاستخدام في أي سياق حيث يتم استخدام التقليدية 1 د SDD-العمر. 2D SDD-العمر مفيد بشكل خاص عندما يلاحظ تباين حجم 1 د SDD-العمر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
هذا العمل تدعمه زمالة لأدمغة-ألف. من المعاهد الوطنية للصحة/نكتس (TL1TR001104)، منح "مؤسسة ولش" (I-1827)، ومنحة R01 من نيجمس (RGM120502A) إلى Z.W. Z.W. أنور فيرجينيا لينثيكوم الباحث في البحوث الطبية والوقاية من السرطان ومعهد أبحاث من تكساس الباحث (R1222).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gel electrophoresis unit | Fisher | HE99XPRO | appratus for gel running. |
| agrose | VWR | 97062-250 | For agarose gel. |
| paper tower | Fisher | 19-120-2484 | for transfering |
| filter paper | VWR | 21427-386 | for transfering |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | for transfering |
| blocking milk powder | Bio-Rad | 1706404XTU | for blocking in Western blot |
| MLKL antibody | Genetex | GTX107538 | rabbit anti-MLKL antibody |
| RIPK1 antibody | BD Biosciences | 610459 | mouse anti-RIPK1 antibody |
| RIPK3 antibody | gift from Dr. Xiaodong Wang | rabbit anti-RIPK3. See refenence 11. | |
| anti-Rabbit-HRP | Sigma | A6154 | secondary antibody |
| ECL | Fisher | WBKLS0500 | Western chemiluminescent HRP substrate |
| X-ray film | Fisher | F-BX810 | for Western blot result |
| DMEM | Sigma | D6429 | for cell culture |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | for cell culture |
| penicilin-streptomycin | Sigma | P4333 | for cell culture |
| Trypsin solution | Sigma | T4049 | for cell culture |
| PBS for tissue culture | Sigma | D8662 | for cell culture |
| recombinant TNF | made in our lab | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| smac-mimetic | gift from Dr. Xiaodong Wang | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| ZVAD-FMK | ApexBio | A1902 | for inducing necroptosis. See reference 11. |
| Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Model TC20; for counting cells |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | for measuring protein concentration in cell lysates |
| Cell lifter | Fisher | 07-200-364 | to remove cells from dish |
| Lysis Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired) |
||
| 10X TAE (1 L) | 48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L |
||
| 4X SDD-AGE loading buffer (50 mL) | 5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O |
||
| TBS Transfer Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O |
||
| PBST Wash Buffer (1 L) | 100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20 |
||
| 10X PBS (10 L) | 800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L |
References
- Ross, C. A., Poirier, M. A.
- Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
- Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
- Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).
- Uptain, S. M., Lindquist, S. Prions as protein-based genetic elements. Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. , (2008).
- Sipe, J. D., et al. Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis. Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).
- Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level. Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).
- Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. Methods in Enzymology. 412, Academic Press. 33-48 (2006).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137, 1100-1111 (2009).
![استخدام الأبعاد شبه يشوه المنظفات [اغروس] هلام التفريد اثنين لتأكيد عدم تجانس حجم الألياف اميلويد أو اميلويد مثل](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/57498.jpg)
