Summary
Här använder vi tvådimensionell semi denatureringen agaros gel-elektrofores att bekräfta förekomsten av amyloid-liknande fibrer av heterogena storlek och utesluta att storlek heterogenitet är på grund av dissociation av amyloid fibrerna under gelen process som körs.
Abstract
Amyloid eller amyloid-liknande fibrer har förknippats med många sjukdomar, och nu upptäcks vara viktigt för många signalvägar. Förmågan att lätt upptäcka bildandet av dessa fibrer olika experimentella villkor är viktigt för att förstå deras potentiella funktion. Många metoder har använts för att upptäcka fibrerna, men inte utan vissa nackdelar. Elektronmikroskopi (EM) eller färgning med kongorött eller Thioflavin T ofta kräver exempelvis rening av fibrerna. Däremot, tillåter semi denatureringen tvättmedel agaros gel-elektrofores (SDD-ålder) identifiering av SDS-resistenta amyloid-liknande fibrer i cell extrakt utan rening. Det kan dessutom jämförelse av storlek skillnaden av fibrerna. Viktigare, kan det användas för att identifiera specifika proteiner inom fibrerna av Western blotting. Det är mindre tidskrävande och mer lättillgänglig för ett större antal labs. SDD-ålder resultaten visar ofta varierande grad av heterogenitet. Det väcker frågan om en del av heterogenitet resultat från dissociationen av protein komplex under elektrofores i närvaro av SDS. Av denna anledning har vi anställt en andra dimension SDD-ålder för att avgöra om storlek heterogenitet sett i SDD-AGE är verkligen ett resultat av fiber heterogenitet i vivo och inte ett resultat av antingen nedbrytning eller dissociation av några av proteinerna under elektrofores. Denna metod tillåter snabb, kvalitativ bekräftelse på att amyloid eller amyloid-liknande fibrerna inte delvis separera under processen SDD-ålder.
Introduction
Bildningen av amyloid fibrer på grund av protein Skellefteåsjukan har länge varit känt att spela en roll vid patologiska tillstånd som Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom och Huntingtons sjukdom1. Mer nyligen, bildningen av amyloid eller amyloid-liknande fibrer har visat sig vara en del av signalvägar i människor, inklusive under anti-virala medfödda immunsvar2 och necroptosis3,4, och i lägre organismer till exempel jäst5,6. Därför är förmågan att upptäcka dessa fibrer i labbet viktigt. För närvarande finns det tre sätt att upptäcka amyloid och amyloid-liknande fibrer: användning av färgämnen, EM och SDD-ålder.
Användning av färgämnen, såsom kongorött eller Tioflavin T, erbjuder fördelen av att vara snabb och lätt påvisbara använder antingen mikroskopi eller spektroskopi7. Påvisande genom mikroskopi, när det gäller kongorött, ger dock ingen specificitet som proteiner består av fibrer, eller storleken av fibrerna. Likaså ger användningen av spektroskopi att upptäcka kongorött eller Thioflavin T bindning till proteinkomplex endast ett positivt eller negativt resultat.
EM ger avgörande bevis för förekomsten av fibrer och också kvantitativ information om fiber längd och diameter8. Denna metod kräver dock mycket stränga rening. EM är dessutom en specialiserad teknik som använder dyr utrustning.
SDD-ålder har använts för att upptäcka SDS-resistenta mega Dalton proteinkomplex inklusive amyloid eller amyloid-liknande fibrer. Det erbjuder många fördelar. Först, det kräver inte rening av fibrer och är lätt att peform9. För det andra, det ger kvalitativ information om storleken av fibrerna, inklusive relativa storlek och mängden fiber heterogenicity. Slutligen, eftersom Western blotting kan utföras efter elektrofores, är det lätt att upptäcka förekomsten av något protein som det är en antikropp, även om det bör noteras att eftersom SDD-ålder är semi denatureringen, vissa epitoper kan förbli dolda som komplicerar detektering av antikroppar.
Nyligen, receptor samverkande proteinkinas 1 (RIPK1) och 3 (RIPK3) har rapporterats att bilda amyloid fibrer som signalering plattformar under necroptosis, en programmerad form av nekros3. Medan du studerar dessa fibrer, visade vårt labb att en annan necroptosis-associerade protein, blandade härstamning kinase domän-liknande (MLKL), också bildade amyloid-liknande fibrer4. Emellertid vid undersökning med SDD-ålder verkade storleken på MLKL fibrerna skiljer sig från RIPK1 och RIPK3 fibrerna, som dök upp identiska med varandra (figur 1). Detta var oväntat eftersom det är välkänt att MLKL binder till RIPK1/RIPK3 att bilda den necroptosis signalering komplex kallas de necrosome10.
Det finns minst två förklaringar. Först två helt åtskilda amyloid-liknande fibrer kan bilda under necroptosis, en som innehåller RIPK1/RIPK3 och den andra som innehåller MLKL. Andra, endast en typ av amyloid-liknande fibrer innehållande RIPK1/RIPK3/MLKL kan bildas under necroptosis, men kopplingen mellan MLKL och de andra proteinerna är svaga nog som det separerar under SDD-åldern.
För att åtgärda detta, föreslår vi utför en tvådimensionell (2D) SDD-ålder. SDD-ålder-stabil amyloid eller amyloid-liknande fibrer har samma migration mönster under den första och andra dimension elektrofores. Detta kommer att upptäckas efter överföra proteinerna till ett membran och genomföra en Western blot. Stabil fibrer kommer att ställa ut en skarp diagonalt mönster. Varje avvikelse från detta skulle föreslå att fibrerna genomgår förändringar på grund av den SDS-elektrofores.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. förbereda prover
- Kultur 2 x 106 amyloid producerar HT-29 kolon cancerceller i en 10-cm vävnadsodling maträtt i 10 mL av Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) innehållande 10% fetalt bovint serum och penicillin-streptomycin. Kultur celler över natten i en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
- Efter cellerna växa till 80% konfluens, tvätta cellerna med 10 mL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS). Tillsätt 3 mL Trypsin och inkubera vid 37 ° C i 3 min.
- När cellerna är helt separerade från skålen, tillsätt 10 mL odlingsmedium och överföra cellerna med pipett 10 mL till en 15 mL koniska rör. Centrifugera cellerna vid 1 000 x g i 3 min i rumstemperatur. Aspirera medium, resuspendera cellerna i 5 mL odlingsmedium och räkna cellerna använder en cell räknare. Plattan 2 x 106 celler i var och en av två 10-cm rätter.
- Att cellerna att följa och återhämta sig under natten i en 37 ° C inkubator med 5% CO2. Gälla en maträtt att inducera bildandet av amyloid med 20 ng/mL tumörnekrosfaktor-alfa (TNF-α), 100 nM Smac-mimetiska och 20 µM pan-kaspas-hämmare Z-VAD-FMK11behandling. Kombinationen är förkortat TSZ. Behandla andra skålen med fordonet som en kontroll.
- Efter lämplig längd av tid, oftast 6 h, skörda cellen lysate.
- Skrapa cellerna av plattan med en plastskrapa och använda 10 mL pipett för att överföra till en 15 mL koniska rör. Centrifugera cellerna vid 1 000 x g under 3 minuter vid 4 ° C.
- Tvätta cellerna 2 gånger av omblandning i 10 mL is kallt PBS och centrifugering vid 1 000 x g under 3 minuter vid 4 ° C. Aspirera PBS lösningen.
Obs: Processen kan pausas här genom frysning cellpelleten i flytande kväve och lagra vid ˗80 ° C i upp till 1 månad. - Överföra cellpelleten till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör och inkubera i 0,3 mL lyseringsbuffert i 30 min på is. Centrifugera vid 20 000 x g under 15 minuter vid 4 ° C. Supernatanten är den hela cellen lysate.
Obs: Processen kan pausas här genom att lagra provet vid-20 ° C i upp till flera månader. - Mätning av protein koncentrationen av en Bradford analysen enligt tillverkarens protokollet. Lägga till 4 x SDD-ålder lastning buffert för att förbereda 20 µL av 3 µg/µL prov och odla i rumstemperatur i 10 min.
2. Förbered och kör geler
- Tillsätt 2 g agaros till 200 mL 1 x Tris-acetat buffert (TAE) i en glasbägare och värm i mikrovågsugn smälta Agarens. Tillsätt 1 mL 20% SDS för en slutlig koncentration på 0,1% SDS. Snurra försiktigt för att blanda. Se till att inte generera bubblor efter SDS tillsats.
- Häll över agaros lösningen i en 15 x 14 cm gel platta. Använd 1 mL pipett för att eliminera eventuella bubblor. Placera en 20-väl kam på toppen.
- Första dimensionen: pipett 60 µg av hela cell lysate i körfältet längst till höger. Kör gelen vid 60 V för ca 4 h (tills dye framsidan är ca ¾ genom gelen) använder den TAE som innehåller 0,1% SDS som kör bufferten.
- Andra dimension: försiktigt rotera gelen 90° moturs (figur 2A). Kör gelen vid 60 V för ca 4 h.
Obs: Kör allmäntillståndet är 4 V/cm gel längd. Det är viktigt att de yttre förhållandena är exakt samma för första och andra dimensioner.
3. överföring
- Använd överföringsmetoden kapillär överföra proteinerna till ett polyvinylidene kryptondifluorid (PVDF) membran (figur 2B).
- Tillsätt 500 mL överföring buffert till en cirka 20 x 20 cm behållare. Göra en 5-cm hög bunt med pappershanddukar bredvid behållaren. Ytan på toppen av stacken måste vara större än måtten som gel.
- Blötlägg ett 14 x 15 cm filterpapper i överföring buffert och placera ovanpå handduken pappersbunten. Var noga med för att placera på papperet utan rynkor eller bubblor. Upprepa med en annan bit av filterpapper.
- Aktivera ett 14 x 15 cm PVDF membran i metanol för 30 s sedan lager det på filterpapperet noga med för att använda en roller för att ta bort alla bubblor. Skölj av gelen med överföring buffert och lager det ovanpå membranet, igen rullande ut eventuella bubblor.
- Täcka kanten av pappershanddukar närmast behållaren på överföring buffert med plastfolie. Det är viktigt att de papper bro byggd i nästa steg inte kommer i direkt kontakt med handduk pappersbunten.
- Blötlägg en papperslapp 15 x 35 cm filter i överföring buffert och placera den så att ena änden täcker toppen av gel och den andra ändan är i behållaren på överföring buffert. Upprepa med en annan bro.
- Täck kärlet med plastfolie och lämna över natten i rumstemperatur.
4. Western Blotting upptäckt
- Skölj membranet med 50 mL PBS som innehåller 0,05% Tween-20 (PBST) i en 20 × 20 cm behållare. Tillsätt 20 mL 5% mjölk i PBST. Rock i rumstemperatur i 30 min att blockera.
- Pipettera 10 µL kanin-anti-MLKL-antikropp i 20 mL 5% mjölk i PBST och lägga till i behållaren. Inkubera i rocker över natten vid 4 ° C.
- Tvätta membranet i 20 mL PBST för 5 min. Upprepa 5 gånger.
- Pipettera 4 µL anti-rabbit-HRP till 20 mL 5% mjölk i PBST och lägga till i behållaren. Inkubera i rocker i rumstemperatur i 2 h.
- Tvätta membranet i 20 mL PBST för 5 min. Upprepa 5 gånger.
- Lägga till förbättrade chemiluminescence substrat (ECL) och utsätt för X-ray filmer enligt tillverkarens protokollet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter necroptosis induktion visade RIPK1 och RIPK3 nästan identiska amyloid-liknande mönster (körfält 2 och 4, figur 1). Dock MLKL fibrer heterogena mer och tycktes vara mindre än RIPK1/RIPK3 fibrer (lane 6, figur 1). Som föranledde oss att utveckla 2D SDD-AGE metoden för att hantera möjligheten MLKL bildar RIPK1/RIPK3-oberoende fibrer eller MLKL helt enkelt separerar från de stora RIPK1/RIPK3/MLKL-fibrerna under SDD-åldern.
En allmän Schematisk av förfarandet elektrofores och överföring visas i figur 2. Under den första dimensionen SDD-ålder, kommer amyloid eller amyloid-liknande fibrer uppvisar en karakteristisk smeta, som kan ses i figur 3A. Vid kör den andra dimensionen SDD-ålder, finns det två möjliga utfall. Ingen nedbrytning eller dissociation under gelen kör processen, kommer att fibrerna migrera identiskt under andra åket som de gjorde i den första körningen. I det här fallet ställer en Western blot ut ett diagonalt mönster på membranet i 45° vinkel som kan ses i figur 3B. Om fibrerna dissociera under processen SDD-ålder, kommer att mindre fibrer migrera snabbare under den andra elektrofores. I det här fallet ställer en Western blot ut vertikala strimmor nedanför den diagonala linjen, som visas i figur 3C.
När det gäller MLKL fibrerna ses under necroptosis, visar de karakteristiska utstryket under den första dimensionen SDD-ålder (figur 4A). När dessa samma fibrer utsattes för 2D SDD-ålder, utställda de en skarp diagonal linje med inga vertikala strimmor (figur 4B). Med detta bevis, drogs slutsatsen att MLKL inte separera från fibrerna under processen SDD-ålder och att den MLKL-innehållande fibrer ses i figur 1 var verkligen skiljer sig från den RIPK1/RIPK3-fibrer. Dessutom när RIPK3 var immuno-utarmat från den cell-lysates, förblev MLKL fibrerna intakt4, bekräftar att MLKL fibrer och RIPK1/RIPK3 fibrer är verkligen skilda enheter.
Figur 1 . Undersökning av amyloid-liknande fibrer under necroptosis. Hela cellen lysates var skördas från celler som genomgår TNF-inducerad necroptosis och utsätts för SDD-ålder. Western blotting utfördes för RIPK1, RIPK3 och MLKL. MLKL-innehållande fibrer uppvisade ett distinkt migration mönster från RIPK1/RIPK3-innehållande fibrer. MLKL monomeren är knappt synlig under detta villkor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Experimentprotokoll. (A) Schematisk bild av tvådimensionella semi denatureringen tvättmedel agaros gel-elektrofores (2D SDD-ålder). Börja med att fylla på provet i de flesta högerfilen, märkt i rött. Efter avslutning av den första dimension körningen, rotera gelen 90° moturs. Kör den andra dimensionen elektrofores. Heldragen pil anger riktningen för den första dimensionen kör, streckad pil anger riktningen av den andra dimensionen som kör. (B) schemat för överföring av kapillärkraften. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Möjliga resultat. (A) den förväntade migrationen mönster av amyloid eller amyloid-liknande fibrer efter den första dimensionen SDD-ålder. Heldragen pil anger riktningen för migration. (B) de beräknade migrationen mönster (ingen nedbrytning eller dissociation) SDD-ålder-stabil amyloid eller amyloid-liknande fibrer efter 2D SDD-ålder. Heldragen pil anger riktningen för den första dimensionen SDD-ålder. Streckad pil anger riktningen av den andra dimensionen SDD-ålder. (C) det beräknade migration mönstret av icke-SDD-ålder-stabil amyloid eller amyloid-liknande fibrer. Heldragen pil anger riktningen för den första dimensionen SDD-ålder. Streckad pil anger riktningen av den andra dimensionen SDD-ålder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Migration av MLKL-innehållande fibrer under 1D och 2D SDD-ålder. (A) hela cellen lysates skördades från celler stimuleras med TSZ genomgå necroptosis. Lysates utsattes för SDD-ålder och en Western blot utfördes för MLKL. En karakteristisk smeta observerades. (B) hela cellen lysates skördades från celler stimuleras med TSZ genomgå necroptosis. Lysates utsattes för 2D SDD-ålder och en Western blot utfördes för MLKL. En skarp linje i 45° vinkel observerades, vilket indikerar att fibrerna inte genomgår dissociation under SDD-åldern. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den mest kritiska aspekten av 2D SDD-ålder är att villkor som elektrofores är samma för den första och den andra dimensionen. Förmågan att upptäcka en skarp diagonal linje vid 45° (indikerar att ingen dissociation eller nedbrytning har inträffat) beror på de fibrer som migrerar på ett identiskt sätt under båda electrophoreses. Med hjälp av olika villkor, till exempel att ändra spänning eller längden på körning kommer att skymma dessa resultat. Också, som är fallet för traditionella 1D SDD-ålder, kokande provet bör undvikas, eftersom detta kommer att störa amyloid och amyloid-liknande fibrer. Som är fallet för alla överföringar, iakttas försiktighet för att undvika bubblor mellan skikten av filterpapper, membran och gel. Slutligen under överföring steg är det kritiskt att bron inte sloka och direkt kontakta handduk pappersbunten. Ett pålitligt sätt att förhindra detta är att använda en liten bit plastfolie för att täcka kanten av pappershanddukar.
Kör villkoren i protokollet (60 V för 4 h) kan justeras. I detta protokoll var exempelvis agarosgel 14 x 15 cm. Om en mindre gel används, bör spänning (4 V/cm gel längd) och vid körning justeras proportionellt. Två prover kan analyseras på en gång genom att använda två kammar när du förbereder gelen. Proverna ska läsas till höger mest väl för varje kam. I detta fall bör körtiden igen förkortas så att övre provet inte körs i botten hälften av gelen. Om tiden justeras för en dimension av gelen, är det kritiskt att den andra dimensionen är anpassad för att matcha.
I motsats till SDS-PAGE är både 1 D och 2D SDD-ålder semi denatureringen. Eftersom fibrerna förbli intakt, kanske vissa epitoper förblir oåtkomliga. Detta kan begränsa upptäckt av några antikroppar. 2D SDD-ålder är begränsad i sin förmåga att avgöra den exakta storleken av amyloid eller amyloid-liknande fibrer. En relativ Storleksjämförelse kan dock göras.
Alla proteinkomplex omfattas av dissociation eller nedbrytning under SDD-ålder, och så de kvalitativa resultaten kan vara svårtolkade. Användning av 2D SDD-ålder tillåter bekräftelse på att storlek heterogenitet sett under SDD-ålder inte beror på SDS-beroende dissociation under elektrofores. 2D SDD-ålder är lämpliga att använda i alla sammanhang där traditionella 1 D SDD-ålder används. 2D SDD-ålder är särskilt användbart när storleken heterogenitet observeras i 1 D SDD-ålder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av en gemenskap för S.H.-A. från NIH/NCATS (TL1TR001104), en Welch-Stiftelsen beviljar (I-1827), och en R01 bidrag från NIGMS (RGM120502A) att Z.W. Z.W. är den Virginia Murchison Linthicum forskare i medicinsk forskning och förebyggande av Cancer och forskning institutet av Texas Scholar (R1222).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gel electrophoresis unit | Fisher | HE99XPRO | appratus for gel running. |
| agrose | VWR | 97062-250 | For agarose gel. |
| paper tower | Fisher | 19-120-2484 | for transfering |
| filter paper | VWR | 21427-386 | for transfering |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | for transfering |
| blocking milk powder | Bio-Rad | 1706404XTU | for blocking in Western blot |
| MLKL antibody | Genetex | GTX107538 | rabbit anti-MLKL antibody |
| RIPK1 antibody | BD Biosciences | 610459 | mouse anti-RIPK1 antibody |
| RIPK3 antibody | gift from Dr. Xiaodong Wang | rabbit anti-RIPK3. See refenence 11. | |
| anti-Rabbit-HRP | Sigma | A6154 | secondary antibody |
| ECL | Fisher | WBKLS0500 | Western chemiluminescent HRP substrate |
| X-ray film | Fisher | F-BX810 | for Western blot result |
| DMEM | Sigma | D6429 | for cell culture |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | for cell culture |
| penicilin-streptomycin | Sigma | P4333 | for cell culture |
| Trypsin solution | Sigma | T4049 | for cell culture |
| PBS for tissue culture | Sigma | D8662 | for cell culture |
| recombinant TNF | made in our lab | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| smac-mimetic | gift from Dr. Xiaodong Wang | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| ZVAD-FMK | ApexBio | A1902 | for inducing necroptosis. See reference 11. |
| Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Model TC20; for counting cells |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | for measuring protein concentration in cell lysates |
| Cell lifter | Fisher | 07-200-364 | to remove cells from dish |
| Lysis Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired) |
||
| 10X TAE (1 L) | 48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L |
||
| 4X SDD-AGE loading buffer (50 mL) | 5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O |
||
| TBS Transfer Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O |
||
| PBST Wash Buffer (1 L) | 100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20 |
||
| 10X PBS (10 L) | 800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L |
References
- Ross, C. A., Poirier, M. A.
- Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
- Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
- Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).
- Uptain, S. M., Lindquist, S. Prions as protein-based genetic elements. Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. , (2008).
- Sipe, J. D., et al. Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis. Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).
- Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level. Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).
- Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. Methods in Enzymology. 412, Academic Press. 33-48 (2006).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137, 1100-1111 (2009).
