Summary
Aquí utilizamos electroforesis en agarosa semi desnaturalización bidimensional para confirmar la presencia de fibras de amiloide como de tamaño heterogéneo y excluir la posibilidad de que la heterogeneidad de tamaño es debido a la disociación de las fibras amiloides en el gel proceso en ejecución.
Abstract
Fibras amiloides o amiloide-como han sido asociadas con muchas enfermedades humanas y ahora se están descubriendo importantes para muchas vías de señalización. La capacidad de detectar fácilmente la formación de estas fibras en diferentes condiciones experimentales es esencial para la comprensión de su función potencial. Muchos métodos se han utilizado para detectar las fibras, pero no sin algunos inconvenientes. Por ejemplo, microscopía electrónica (EM), o tinción con rojo Congo o Thioflavin T a menudo requiere purificación de las fibras. Por otra parte, la electroforesis en gel de agarosa detergente la desnaturalización (SDD-edad) permite la detección de las fibras de amiloide-como SDS-resistente en los extractos de célula sin purificación. Además, permite la comparación de la diferencia de tamaño de las fibras. Más importante aún, puede utilizarse para identificar proteínas específicas dentro de las fibras por borrar occidental. Es mucho menos tiempo y más fácilmente accesible a un mayor número de laboratorios. SDD-edad resultados a menudo muestran grados variables de heterogeneidad. Plantea la pregunta de si parte de la heterogeneidad resulta de la disociación de la proteína del compleja durante la electroforesis en presencia de SDS. Por esta razón, hemos empleado una segunda dimensión de SDD-edad para determinar si la heterogeneidad de tamaño vista en SDD-edad es realmente consecuencia de la heterogeneidad de fibra en vivo y no un resultado de la degradación o la disociación de algunas de las proteínas durante el electroforesis. Este método permite la confirmación rápida y cualitativa que las fibras de amiloide o amiloide-como no están disociando parcialmente durante el proceso de SDD-edad.
Introduction
La formación de fibras amiloides debido a mal plegamiento de proteínas ha sido conocida para jugar un papel en condiciones patológicas como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington1. Más recientemente, la formación de fibras amiloides o amiloide-como se ha demostrado que una parte de vías de señalización en los seres humanos, incluyendo durante la respuesta inmune innata antiviral2 y necroptosis3,4y en organismos inferiores como levadura5,6. Por lo tanto, la capacidad para detectar estas fibras en el laboratorio es importante. Actualmente, hay tres maneras principales para detectar amiloide y las fibras de amiloide-como: el uso de tintes, EM y SDD-edad.
El uso de tintes, como el rojo Congo o tioflavina T, ofrece la ventaja de ser rápida y fácilmente detectable mediante microscopía o espectroscopia7. Sin embargo, la detección por microscopía, en el caso de Congo rojo, proporciona ninguna especificidad acerca de que las proteínas constituyen las fibras, o el tamaño de las fibras. Del mismo modo, el uso de la espectroscopia para detectar rojo Congo o Thioflavin T Unión a complejos de proteínas proporciona sólo un resultado positivo o negativo.
EM proporciona pruebas concluyentes de la presencia de fibras y también información cuantitativa acerca de la fibra longitud y diámetro8. Sin embargo, este método requiere purificación muy estricta. Además, la EM es una técnica especializada que utiliza el equipo costoso.
SDD-edad se ha utilizado para detectar resistente SDS mega Dalton complejos incluyendo las fibras de amiloide o amiloide-como. Ofrece muchas ventajas. En primer lugar, no requiere la purificación de las fibras y es fácil de realizar9. En segundo lugar, proporciona información cualitativa sobre el tamaño de las fibras, como el tamaño relativo y la cantidad de heterogenicidad de la fibra. Por último, porque el borrar occidental puede realizarse después de la electroforesis, es fácil de detectar la presencia de cualquier proteína que se encuentra un anticuerpo, aunque cabe señalar que debido a SDD-edad es semi-desnaturalización, algunos epitopos pueden permanecer oculto que complica la detección de anticuerpos.
Recientemente, receptor interacción proteína quinasa 1 (RIPK1) y 3 (RIPK3) se han divulgado para formar fibras amiloides para servir como plataformas de señalización durante la necroptosis, forma programada de necrosis3. Mientras que de estudiar estas fibras, nuestro laboratorio demostró que otra proteína asociada a la necroptosis, mezclado quinasa de linaje como dominio (MLKL), también forma las fibras de amiloide-como4. Sin embargo, en el examen con SDD-edad, el tamaño de las fibras MLKL apareció distinto de las fibras RIPK1 y RIPK3, que parecían idénticas entre sí (figura 1). Esto fue inesperado porque es bien sabido que MLKL se une a RIPK1/RIPK3 para formar la necroptosis señalización complejo llamado el necrosome10.
Hay al menos dos explicaciones. En primer lugar, dos fibras de amiloide-como totalmente distintas pueden formar durante la necroptosis, RIPK1/RIPK3 con uno y el otro MLKL que contiene. En segundo lugar, sólo un tipo de amiloide-como las fibras que contienen RIPK1/RIPK3/MLKL pueden formarse durante la necroptosis, pero la Asociación de MLKL con otras proteínas es débil lo suficiente que disocia en SDD-edad.
Para hacer frente a esto, proponemos realizar una edad SDD bidimensional (2D). SDD-edad-stable amiloide o fibras de amiloide-como tienen el mismo patrón de migración durante la electroforesis de la primera y la segunda dimensión. Esta será detectable después de la transferencia de las proteínas a una membrana y realizar un Western blot. Fibras estables exhiben un patrón diagonal fuerte. Cualquier desviación de esto sugeriría que las fibras se someten a cambios debido a la electroforesis de SDS.
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Protocol
1. preparar las muestras
- Amiloide de cultura 2 x 106 produciendo las células de cáncer de colon HT-29 en un plato de cultivo de tejidos de 10 cm en 10 mL de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) con suero bovino fetal 10% y penicilina-estreptomicina. Las células de cultivos durante la noche en una incubadora de 37 ° C con 5% CO2.
- Después de que las células crecen al 80% de confluencia, lavan las células con 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Añadir 3 mL de solución de tripsina e incubar a 37 ° C durante 3 minutos.
- Después de que las células están totalmente disociadas de la fuente, añadir 10 mL de medio de cultivo y transferencia de las células con una pipeta de 10 mL a un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar las células a 1.000 x g durante 3 min a temperatura ambiente. Aspire el medio, resuspender las células en 5 mL de medio de cultivo y contar las células usando un contador de células. Placa de 2 x 106 células en cada uno de los dos platos de 10 cm.
- Permitir que las células se adhieren y recuperar durante la noche en una incubadora de 37 ° C con 5% CO2. Aplicar un tratamiento a un plato para inducir la formación de amiloides con 20 ng/mL de Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-α), 100 inhibidor nM Smac mimética y 20 μm pan-caspasas Z-VAD-FMK11. La combinación se abrevia como zona temporal de seguridad. Tratar el otro plato con el vehículo como un control.
- Después de la longitud adecuada de tiempo, generalmente 6 h, cosecha el lysate de la célula.
- Raspar las células de la placa con una rasqueta de plástico y usar una pipeta de 10 mL para transferir a un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar las células a 1.000 x g durante 3 min a 4 ° C.
- Lavar las células 2 veces a resuspender en 10 mL de PBS frío hielo y centrifugación a 1.000 x g durante 3 min a 4 ° C. Aspirar la solución de PBS.
Nota: El proceso puede hacer una pausa aquí congelando el precipitado de células en nitrógeno líquido y guardar a ˗80 ° C durante 1 mes. - Transfiera el sedimento de células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e incubar en 0,3 mL de tampón de lisis por 30 min en hielo. Centrifugar a 20.000 x g durante 15 min a 4 ° C. El sobrenadante es el lisado de células enteras.
Nota: El proceso puede hacer una pausa aquí mediante el almacenamiento de la muestra a-20 ° C por hasta varios meses. - Medir la concentración de proteína por un ensayo de Bradford según protocolo del fabricante. Añadir 4 x buffer de carga de SDD-edad preparar 20 μl de muestra de 3 μg/μl e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
2. preparar y ejecutar geles
- Añadir 2 g de agarosa a 200 mL de tampón de Tris acetato 1 x (TAE) en un vaso de vidrio y calor en el microondas para fundir la agarosa. Añadir 1 mL de SDS 20% para una concentración final de 0.1% SDS. Agitar cuidadosamente para mezclar. Tenga cuidado de no para generar burbujas después de la adición de SDS.
- Verter la solución de agarosa en una placa de gel de 15 cm x 14 cm. Utilice una pipeta de 1 mL para eliminar cualquier burbuja. Coloque un peine de 20 pozos en la parte superior.
- Primera dimensión: pipeta 60 μg de células enteras lisado en el carril de extrema derecha. Correr el gel a 60 V por cerca de 4 horas (hasta que el frente del tinte es de ¾ a través del gel) con la TAE que contiene 0.1% SDS como el búfer de ejecución.
- Segunda dimensión: gire con cuidado el gel 90° en sentido antihorario (figura 2A). Correr el gel a 60 V por cerca de 4 horas.
Nota: La condición general de la corriente es 4 V/cm longitud de gel. Es importante que las condiciones son exactamente iguales a las dimensiones primeras y segunda.
3. transferencia
- Utilice el método de transferencia capilar para transferir las proteínas a una membrana (PVDF) de difluoruro de polivinilideno (figura 2B).
- Añadir 500 mL de tampón de transferencia a un contenedor de 20 cm x 20 cm aproximadamente. Hacer una pila alta de 5 cm de toallas de papel al lado del contenedor. La superficie de la parte superior de la pila debe ser mayor que las dimensiones del gel.
- Empapar un papel de filtro de 14 cm x 15 cm en tampón de transferencia y coloque encima de la pila de toallas de papel. Tenga cuidado de colocar en el papel sin arrugas o burbujas. Repita con el otro trozo de papel de filtro.
- Activar una membrana PVDF de 14 cm x 15 cm en metanol por 30 s entonces la capa en el papel filtro, teniendo cuidado de utilizar un rodillo para quitar todas las burbujas. Enjuagar el gel con el tampón de transferencia y capa encima de la membrana, otra vez el despliegue de las burbujas.
- Cubrir el borde de las toallas de papel más cercanos al recipiente que contiene el tampón de transferencia con envoltura de plástico. Es importante que el puente de papel, construido en el paso siguiente no entra en contacto directo con la pila de toallas de papel.
- Remoje un pedazo de papel de filtro de 15 cm x 35 cm en tampón de transferencia y coloque un extremo cubre la parte superior del gel y el otro está en el recipiente que contiene el tampón de transferencia. Repita con el otro puente.
- Cubrir el recipiente con papel plástico y dejar durante la noche a temperatura ambiente.
4. Western Blot detección
- Lavar la membrana con 50 mL de PBS que contenga 0.05% Tween-20 (SAFT) en un recipiente de 20 cm x 20 cm. Añadir 20 mL de leche de 5% en SAFT. Roca a temperatura ambiente durante 30 min para bloquear.
- Pipetear 10 μl de anticuerpo de conejo anti-MLKL en 20 mL de leche de 5% en SAFT y agregar al contenedor. Incubar en el eje de balancín de la noche a 4 ° C.
- Lavar la membrana en 20 mL de SAFT para 5 minutos repita 5 veces.
- Pipetear 4 μL de HRP anti-conejo a 20 mL de leche de 5% en SAFT y agregar al contenedor. Incubar en el eje de balancín a temperatura ambiente durante 2 h.
- Lavar la membrana en 20 mL de SAFT para 5 minutos repita 5 veces.
- Añadir substrato quimioluminescencia realzada (ECL) y exponga a las películas de radiografía según protocolo del fabricante.
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Representative Results
Después de la inducción de la necroptosis, RIPK1 y RIPK3 mostraron patrones de amiloide-como casi idénticos (carriles 2 y 4, figura 1). Sin embargo, las fibras MLKL fueron más heterogéneas y parecen ser más pequeño que las fibras RIPK1/RIPK3 (carril 6, figura 1). Nos impulsó a desarrollar el método SDD-edad 2D para hacer frente a la posibilidad o MLKL forma fibras RIPK1/RIPK3-independiente MLKL simplemente se disocia de las grandes fibras RIPK1/RIPK3/MLKL durante edad de la SDD.
Un esquema general del procedimiento de electroforesis y transferencia se muestra en la figura 2. Durante la primera dimensión SDD-edad, las fibras de amiloide o amiloide-como exhibirá un frotis característico, como se ve en la figura 3A. Al ejecutar la segunda dimensión SDD-edad, hay dos posibles resultados. En caso de no degradación o disociación durante el gel ejecutar proceso, las fibras se migrarán idénticamente durante la segunda carrera como lo hicieron en la primera carrera. En este caso, un Western blot exhibe un patrón diagonal sobre la membrana en un ángulo de 45° como se ve en la figura 3B. Si las fibras se disocian durante el proceso de SDD-edad, las fibras más pequeñas migrará más rápido durante la segunda electroforesis. En este caso, un Western blot presenta rayas verticales debajo de la línea diagonal, como se muestra en la figura 3C.
En el caso de las fibras MLKL vistas durante la necroptosis, demuestran el frotis característico durante la primera dimensión SDD-edad (figura 4A). Cuando esas mismas fibras fueron sometidas a SDD-edad 2D, exhibieron una fuerte línea diagonal no vertical rápido (figura 4B). Con esta evidencia, se concluyó que MLKL no era disociar de las fibras durante el proceso de SDD-edad y que las fibras que contienen MLKL observa en la figura 1 fueron de hecho distintas de las fibras RIPK1/RIPK3. Además, cuando RIPK3 era inmuno-agotado de los lysates de la célula, las fibras MLKL permanecieron intacta4, confirmando que MLKL fibras y fibras RIPK1/RIPK3 son entidades de hecho distintas.
Figura 1 . Examen de las fibras de amiloide-como durante necroptosis. Lisados de células enteras fueron extraídas las células que experimentan necroptosis inducida por TNF y sometidas a SDD-edad. Manchas blancas /negras occidentales realizaron RIPK1 RIPK3 y MLKL. Las fibras que contienen MLKL exhibieron un patrón de migración distinta de las fibras RIPK1/RIPK3-que contiene. El monómero MLKL es apenas visible bajo esta condición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Protocolo experimental. (A) esquema de la electroforesis del gel de agarosa detergente semi desnaturalización bidimensional (2D SDD-edad). Comenzar por la carga de la muestra en el carril derecho de la mayoría, marcado en rojo. Después de la terminación de la primera carrera de la dimensión, gire el gel 90° en sentido antihorario. Ejecutar la segunda electroforesis de dimensión. Flecha sólida indica la dirección de la primera dimensión correr, flecha punteada indica la dirección de la segunda dimensión ejecutar. (B) esquema de la transferencia por capilaridad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Resultados. Patrón (A) la migración prevista de fibras amiloides o amiloide-como después de la primera dimensión de SDD-edad. La flecha sólida indica la dirección de migración. (B) la migración esperada patrón del amiloide SDD-edad-estable (sin degradación o disociación) o fibras de amiloide-como después 2D SDD-edad. La flecha sólida indica la dirección de la primera dimensión SDD-edad. Flecha punteada indica la dirección de la segunda dimensión SDD-edad. (C) el patrón de migración prevista del amiloide no-SDD-edad-stable o amiloide-como fibras. La flecha sólida indica la dirección de la primera dimensión SDD-edad. Flecha punteada indica la dirección de la segunda dimensión SDD-edad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Migración de MLKL conteniendo fibras durante 1D y 2D SDD-edad. Lisados de células enteras (A) fueron extraídas las células estimuladas con TSZ a necroptosis. Los lisados fueron sometidos a SDD-edad, y se realizó un Western blot para MLKL. Se observó una mancha característica. Lisados de células enteras (B) fueron extraídas las células estimuladas con TSZ a necroptosis. Los lisados fueron sometidos a SDD-edad 2D y MLKL realizó un Western blot. Se observó una fuerte línea a un ángulo de 45°, que indica que las fibras no sufren disociación durante edad de SDD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El aspecto más crítico de la SDD-edad 2D es que las condiciones de electroforesis son las mismas para la primera y la segunda dimensión. La capacidad para detectar una fuerte línea diagonal a 45° (lo que indica que no se ha producido ninguna disociación o degradación) depende de las fibras de migrar de manera idéntica durante electroforesis. Usando diferentes condiciones, por ejemplo cambiando la tensión o la longitud de tiempo de ejecución, se oscurecen estos resultados. También, como es el caso de tradicional 1D SDD-edad, hirviendo la muestra debe evitarse, como esto interrumpirá amiloide y las fibras de amiloide-como. Como es el caso para todas las transferencias, se debe tener cuidado para evitar burbujas entre las capas de papel de filtro, membrana y gel. Por último, durante la etapa de transferencia, es fundamental que el puente no decaer y contactar directamente con la pila de toallas de papel. Una manera confiable de evitar esto es utilizar un pequeño pedazo de plástico para cubrir el borde de las toallas de papel.
Pueden ajustar las condiciones de funcionamiento en el protocolo (60 V de 4 h). Por ejemplo, en el presente Protocolo, el gel de agarosa fue 14 x 15 cm. Si se utiliza un gel de menor voltaje (V/cm 4 longitud de gel) y tiempo de ejecución deben ajustarse proporcionalmente. Dos muestras pueden analizarse a la vez usando dos peines al preparar el gel. Las muestras deben colocarse en la derecha más bien para cada peine. En este caso, el tiempo debe acortarse otra vez para que la muestra superior no funciona en la parte inferior la mitad del gel. Si el tiempo es ajustado para la uno dimensión de gel, es importante que la otra dimensión se ajusta para que coincida con.
A diferencia de SDS-PAGE, 1D y 2D SDD-edad son la desnaturalización. Porque las fibras permanecen intactas, algunos epítopos pueden permanecen inaccesibles. Esto puede limitar la detección de algunos anticuerpos. SDD-edad 2D está limitada en su capacidad para determinar el tamaño exacto de las fibras amiloides o amiloide-como. Sin embargo, puede hacerse una comparación del tamaño relativo.
Todos los complejos están sujetos a degradación durante edad de SDD o disociación, y así los resultados cualitativos pueden ser difíciles de interpretar. El uso de 2D SDD-edad permite la confirmación de que la heterogeneidad del tamaño visto en SDD-edad no es debido a la disociación dependiente de la SDS durante electroforesis. SDD-edad 2D es apropiada para utilizar en cualquier contexto donde se utiliza el tradicional 1 D SDD-edad. SDD-edad 2D es especialmente útil cuando se observa heterogeneidad de tamaño en 1 D SDD-edad.
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Disclosures
Los autores no declaran conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por una beca para la S.H.-A. de NIH/NCATS (TL1TR001104), una Fundación de Welch conceder (I-1827) y una subvención R01 de NIGMS (RGM120502A) a Z.W. Z.W. es el Virginia Murchison Linthicum erudito en investigación médica y la prevención del cáncer e Instituto de investigación de Texas erudito (R1222).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gel electrophoresis unit | Fisher | HE99XPRO | appratus for gel running. |
| agrose | VWR | 97062-250 | For agarose gel. |
| paper tower | Fisher | 19-120-2484 | for transfering |
| filter paper | VWR | 21427-386 | for transfering |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | for transfering |
| blocking milk powder | Bio-Rad | 1706404XTU | for blocking in Western blot |
| MLKL antibody | Genetex | GTX107538 | rabbit anti-MLKL antibody |
| RIPK1 antibody | BD Biosciences | 610459 | mouse anti-RIPK1 antibody |
| RIPK3 antibody | gift from Dr. Xiaodong Wang | rabbit anti-RIPK3. See refenence 11. | |
| anti-Rabbit-HRP | Sigma | A6154 | secondary antibody |
| ECL | Fisher | WBKLS0500 | Western chemiluminescent HRP substrate |
| X-ray film | Fisher | F-BX810 | for Western blot result |
| DMEM | Sigma | D6429 | for cell culture |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | for cell culture |
| penicilin-streptomycin | Sigma | P4333 | for cell culture |
| Trypsin solution | Sigma | T4049 | for cell culture |
| PBS for tissue culture | Sigma | D8662 | for cell culture |
| recombinant TNF | made in our lab | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| smac-mimetic | gift from Dr. Xiaodong Wang | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| ZVAD-FMK | ApexBio | A1902 | for inducing necroptosis. See reference 11. |
| Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Model TC20; for counting cells |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | for measuring protein concentration in cell lysates |
| Cell lifter | Fisher | 07-200-364 | to remove cells from dish |
| Lysis Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired) |
||
| 10X TAE (1 L) | 48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L |
||
| 4X SDD-AGE loading buffer (50 mL) | 5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O |
||
| TBS Transfer Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O |
||
| PBST Wash Buffer (1 L) | 100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20 |
||
| 10X PBS (10 L) | 800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L |
References
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